生物碱含量范文

生物碱含量范文（精选10篇）

生物碱含量 第1篇

1 仪器与材料

UV-2450紫外可见分光光度计(岛津);Waters 2695型高效液相色谱仪;Waters 2996二极管阵检测器,Sartorius BP211D十万分之一电子天平。乙腈(霍尼韦尔色谱纯);无水乙醇(天津科密欧色谱纯);其它试剂为分析纯;水为超纯水; 苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110805-200508);氧化苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110780-201007);槐定碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110784-200804);氧化槐果碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111652-200301);槐果碱对照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批号:11052422)。

2 样品的制备

苦参药材采自山西振东道地药材开发有限公司苦参规范化种植基地,经广东药学院生药教研室李书渊教授鉴定为苦参(Sophora flavescens Ait.)药材。挖取三年生苦参的根,用水迅速冲淋,晾至外表栓皮上无水分,刮取木栓层,分取韧皮部、木质部及髓部,晒干,粉碎,过三号筛,备用[1]。

3 各部分指标性成分含量测定[2]

3.1 方法与结果

3.1.1 色谱条件

色谱柱: Inertsil-NH2柱 (250 mm×4.6mm,5μm ),流动相:乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10);流速:1.0mL /min ;检测波长:210 nm。

3.1.2 对照品溶液的配制

分别取槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱(含量以92.3%计算)对照品适量,精密称定,加乙腈-无水乙醇(80∶20)溶解,分别制成每1mL含槐果碱0.6520mg、氧化槐果碱0.5680mg 、苦参碱 0.5520mg 、槐定碱0.4160mg 、氧化苦参碱0.4763mg的溶液, 作为对照品溶液。取槐果碱对照品溶液0.1mL、苦参碱对照品溶液0.2mL、氧化槐果碱对照品溶液1.5mL、槐定碱对照品溶液0.3mL和氧化苦参碱对照品溶液5mL至10mL容量瓶中,加乙腈-无水乙醇(80:20)定容至刻度,得混合对照品溶液。

3.1.3 供试品溶液的制备

取苦参不同组织部位的粉末0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加浓氨溶液0.5mL,三氯甲烷20mL,超声处理30min,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5mL,加在中性氧化铝柱(100~200目,5g,内径1cm)上,依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液各20mL洗脱,合并洗脱液,回收溶剂至干,残渣加无水乙醇适量使溶解,转移至10mL量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,即得。

3.2 方法学考察

3.2.1 标准曲线的制备

精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20、25、30μL注入液相色谱仪测定, 以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,分别为:

槐果碱:Y=2051369.7095X-4695.0806,γ2=0.9997

氧化槐果碱:Y=174542.0190X-6872.2660, γ2=0.9996

苦参碱:Y=26940711.5776X-25501.1103, γ2=1.000

槐定碱:Y=1303758.0199X-13731.3299, γ2=0.9997

氧化苦参碱:Y=1230594.0238X-34593.7729, γ2=0.9996

表明槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱分别在:0.01304~0.1956μg/mL、0.1704~2.556μg/mL、0.02208~0.3312μg/mL、0.02496~0.3744μg/mL范围内线性关系良好。

3.2.2 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20μL , 连续进样5次,记录色谱峰的峰面积, 结果槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱峰面积的 RSD分别为0.48%、0.95%、0.14%、2.9% 和0.13%。结果表明仪器精密度较好。

3.2.3 稳定性试验

取韧皮部供试品溶液1份,分别于0,2,4,8,12,24,48 h 进样测定, 结果槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为 1.0%,0.51%,0.45%,1.6%,1.7%,表明供试品溶液稳定性良好。

3.2.4 重复性试验

取苦参韧皮部粉末0.3g共6份,按供试品制备方法制备,分别测定其含量,结果槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱含量测定的 RSD 分别为 2.7 %、2.2%、 1.4%、2.9 %、 1.2%。结果表明,本方法重复性较好。

3.2.5 加样回收率

取槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱对照品适量,精密称定,加乙腈-无水乙醇(80∶20)分别配成浓度为0.3200mg/mL、5.770mg/mL、1.280mg/mL、2.790mg/mL、34.13mg/mL的对照品储备液,五种对照品储备液分别取1mL置10mL容量瓶中,加无水乙醇定容。精密吸取1mL上述对照品溶液共6份,置具塞锥形瓶中,挥干溶剂,分别取苦参韧皮部粉末约0.15g,精密称定,按“3.1.3”项制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,测定,结果见表1。

3.2.6 含量测定

取苦参药材不同组织部位粉末,按供试品溶液制备方法制备,精密吸取20μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定各产地苦参药材中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱和氧化苦参碱的含量,结果见表2。

结果表明,木栓层中生物碱含量最低,其槐定碱含量较木质部和髓部高;槐果碱、氧化槐果碱、苦参碱及氧化苦参碱在各部分中的含量依次为韧皮部>木质部>髓部>木栓层。计算五种单体生物碱的总量比较看出,韧皮部中五种单体生物碱总量明显高于髓部和木质部。

4 总生物碱含量测定

4.1 溶液的配制

4.1.1 对照品的制备

精密称取氧化苦参碱对照品0.00560g(氧化苦参碱含量以92.3%算),加氯仿溶解,定容至50mL,即得浓度为0.103mg/mL的标准品溶液。

4.1.2 供试品的制备

取不同组织部位粗粉0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加浓氨溶液0.5mL,精密加入三氯甲烷20mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失重量,精密量取续滤液1mL,加氯仿定容至10mL。

4.2 比色条件的选择

4.2.1 测定波长的选择

精密量取对照品溶液与供试品溶液各1mL至分液漏斗,加pH4.0缓冲溶液8.0mL,再加入溴甲酚绿[3](取溴甲酚绿350mg,加0.1mol/LNaOH溶液10mL,研磨溶解,加水定容至250mL)1.0mL,迅速振摇后加二氯甲烷10mL,继续振摇,静置30min,分取二氯甲烷层,在300~700nm下扫描。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。结果表明,在413nm下,对照品溶液和供试品溶液吸光度最高[4]。

4.2.2 缓冲溶液pH的选择

精密吸取供试品溶液1.0mL共6份,分别加入pH 3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2的缓冲液8mL,再加入溴甲酚绿1.0mL,迅速振摇后加二氯甲烷10.0mL, 继续振摇, 静置30min,分取二氯甲烷层。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。用紫外可见分光光度计于413nm 处测定吸光度。结果表明,当缓冲液pH值为4.0时吸收度最大,故选用pH4.0的缓冲液。

4.2.3 缓冲溶液用量

精密吸取供试品溶液1.0mL共6份,分别置于分液漏斗中,分别加入pH值为4.0的缓冲溶液5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL,加入1mL溴甲酚绿,迅速振摇后加二氯甲烷10.0mL,继续振摇,静置30min,分取二氯甲烷层,用紫外可见分光光度计在413nm 处测定吸光度。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。结果表明,当缓冲液用量为6mL时吸收度最大,故缓冲液用量为6mL。

4.2.4 酸性染料用量考察

精密吸取供试品溶液1.0mL共6份, 分别置于分液漏斗中, 加入pH值4.0的缓冲溶液6mL后, 分别加入溴甲酚绿0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,迅速振摇后加二氯甲烷10.0mL, 继续振摇,静置30min,分取二氯甲烷层,用紫外可见分光光度计在413nm 处测定吸光度。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。结果表明,当溴甲酚绿用量为1.5mL时吸光度最大,故溴甲酚绿选用1.5mL。

4.2.5 静置时间的选择

精密吸取供试品溶液1.0mL共5份,加pH为4.0的缓冲液6mL和溴甲酚绿1.5mL,迅速振摇,加二氯甲烷10.0mL,继续振摇,分别静置5min、15min、30min、45min、60min,分取二氯甲烷层,用紫外可见分光光度计在413nm 处测定吸光度。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。结果表明,静置30min时吸光度最大,30min后吸光度呈现先稳定继而下降的趋势,故选用静置时间为30min。

4.3 方法学考察

4.3.1 标准曲线的制定

用移液管准确量取氧化苦参碱对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL至分液漏斗中,分别加入pH 值4.0缓冲液6mL,再精密加入溴甲酚绿1.5mL,迅速振摇后加二氯甲烷至有机层总量为11mL,继续振摇,静置30min,分取二氯甲烷层,在413nm 波长处测定吸光度。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。以对照品量(mg)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。求得回归方程为:Y=7.1688X-0.0404(γ2=0.9991)。结果表明,氧化苦参碱浓度在20.68μg~144.8μg/mL范围内线性关系良好。

4.3.2 精密度

精密吸取氧化苦参碱对照品溶液1.0mL,重复测定吸收度5次。结果表明,RSD值为1.1%,说明实验方法的精密度良好。

4.3.3 稳定性

精密吸取韧皮部供试品溶液1.0mL,测定吸光度, 分别在 10、15、20、30、45、60min各测定1次。结果表明,60min内苦参韧皮部供试品溶液保持稳定。

4.3.4 重复性

取韧皮部苦参药材粉末6份各0.3g,按“4.1.2”方法制备供试品溶液,分别取供试品溶液各1.0mL,测定吸光度,总碱平均含量为3.5%,RSD 为0.33%。

4.3.5 加样回收率

取已知含量的苦参韧皮部粉末0.15g共6份,精密称定,置具塞锥形瓶中,加浓氨溶液0.5mL,精密加入三氯甲烷20mL,密塞,称定重量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用三氯甲烷补足减失重量,精密量取续滤液1.0mL,挥干溶剂,分别加入浓度为0.1034 mg /mL的氧化苦参碱对照品溶液2mL,加氯仿定容至10mL,依法测定吸光度,计算加样回收率,结果见表3。

4.3.6 含量测定

取苦参不同组织部位粉末0.3g各3份,精密称定,按“4.1.2”同法制备供试品溶液,精密吸取不同组织部位制得的供试品溶液1.0mL,置分液漏斗中,加入pH 值4.0缓冲液6mL,再精密加入溴甲酚绿1.5mL,迅速振摇后加二氯甲烷10.0mL,继续振摇,静置30min,分取二氯甲烷层,在413nm 波长处测定吸光度。另以同法操作(不加氧化苦参碱对照品溶液)的二氯甲烷为空白。结果见表4。

结果表明,四个部分的总生物碱含量大小依次为韧皮部>木质部>髓部>木栓层,木栓层中总生物碱含量极少,超出线性范围;韧皮部含量最高。

5 结论

文献报道,黄酮和生物碱类化合物为苦参主要有效成分。苦参的药理作用以抑菌、抗心律失常为主,最近的药理学研究结果表明,苦参具有抗炎、抗肝损伤、抗肝纤维化及抗肿瘤等多种药理活性。目前,多用苦参碱、苦参总生物碱含量来控制药材质量。在现有方法的基础上,本实验采用酸性染料比色法,以氧化苦参碱为对照品,对苦参不同组织部位的总生物碱进行含量测定。苦参总生物碱中主要含有氧化苦参碱和苦参碱等,多采用HPLC法进行测定,但是仅通过一种或几种生物碱的含量评价药材质量不够客观,故本实验采用多指标成分含量测定,旨在为完善苦参药材的质量控制方法,客观全面地评价苦参药材质量提供依据。

金淑琴[5]在研究苦参异常构造时认为苦参的异常构造属于髓部的异常维管束,并发现苦参饮片直径1.0~2.5cm者,髓部约占直径1/6~1/2,直径2.5~6.0cm者,髓部约占直径的1/2~2/3,即一般来说随着生长年限增加,苦参直径增大,髓部所占的比例增大。《中华本草》记载:苦参生产上用种子作为繁殖材料,“播种第3年9-10月份采挖”。若按生长年限为三年采挖,这时正是苦参异常构造尚未形成或刚开始形成的时候。现市售苦参仍以野生为主,难以确定其准确的生长年限。本实验取3年生苦参作为样品,结果发现苦参各组织部位除木栓层外髓部生物碱含量较低,由此推断,当生长年限超过3年,髓部比例增加,片型大的苦参饮片生物碱含量可能低于片型小的苦参饮片,这为往后苦参饮片规格的划分提供了实验依据。

参考文献

[1]周刚,吕庆红.牡丹皮不同部位有效成分含量测定及指纹图谱化学成分研究[J].中国中药杂志,2008,33(8):2070-2 073.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:188-189.

[3]孟祥松,时军.溴甲酚绿比色法测定苦参总碱含量的研究[J].安徽医药,2007,11(1):41-42.

[4]吕翠平,郭亚健,张莹.防己黄芪汤水煎液中二种防己生物碱煎出量测定[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(12):30-31.

生物碱含量 第2篇

高效液相色谱法测定发酵液中生物素含量

采用高效液相色谱法测定发酵液中生物素的含量.结果表明,样品浓度在5～150 μg・mL-1范围内线性关系良好,最低检测限为0.01 μg・mL-1,精密度实验的RSD为0.21%,稳定性实验的`RSD为6.6%,发酵液在15 h内检测结果无明显差别,加样回收率在95%～102%之间.该方法简便、快捷、准确、重现性好,可用于发酵液中生物素的含量测定.

作 者：黄琴 丁安子 宋娟 HUANG Qin DING An-zi SONG Juan 作者单位：湖北工业大学,发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北,武汉,430068刊 名：化学与生物工程 ISTIC英文刊名：CHEMISTRY & BIOENGINEERING年，卷(期)：26(8)分类号：O657.7 Q563关键词：生物素 发酵液 高效液相色谱 含量测定

生物碱含量 第3篇

[关键词] 元胡止痛片；延胡索总生物碱；分光光度法

[中图分类号] R284   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）03-141-02

Determine the content of total corydalis alkaloid by spectrophotometry in Yuanhuzhitong tablet

LIU Linlin1，2  LI Zhengguo2  LIU Lifang1

1.Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2.Jining Institute for Drug Control,Jining 272025,China

[Abstract] Objective Determine the content of total corydalis alkaloid by spectrophotometry in Yuanhuzhitong tablet， Identify the optimal extraction and determination. Methods Use bromocresol green combined with alkaloids into organic complex，extraction with a certain amount of organic solvent, measured at a wavelength of 413nm by spectrophotometry.Results Average recovery was 100.9%, RSD 0.53%. Conclusion This method is accurate， reliable， reproducible and can be used as quality control standards of Yuan hu zhi tong Tablet.

[Key words] Yuanhuzhitong tablet; Total Corydalis Alkaloid; Spectrophotometry

元胡止痛片由延胡索与白芷两味药材组成，主治由气滞血瘀引起的胃痛、胁痛、头痛及痛经，效果确切。药理实验证明，延胡索中所含的生物碱类物质为主要的镇痛成分。处方中所用延胡索多经过醋制，因为游离的生物碱较难溶于水，经醋制后生成醋酸盐而易溶于水。本研究通过分光光度法测定元胡止痛片中总生物碱含量可有效控制元胡止痛片生产投料，确保药品质量。

1 仪器与试药

梅特勒-托利多XS-43；TU-1800SPC紫外可见光分光光度计，SBC-100超声波处理器（济宁市超声波仪器厂），所用试剂均为分析纯。元胡止痛片（市售品）；延胡索乙素（中国药品生物制品检定所，批号：110726-200610）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

取本品20片，糖衣片除去糖衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，用石油醚（60～90℃）脱脂1 h。取药渣，挥干溶剂后，加1.5%盐酸溶液50 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液2 mL，置于分液漏斗中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.2）20 mL，加溴甲酚绿显色剂2.0 mL，用氯仿15 mL萃取，待静置分层后，分取氯仿层作为供试品溶液。

2.2 阴性供试品溶液制备

精密称取白芷细粉0.5 g，按供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备

精密称取延胡索乙素对照品适量，加1.5%盐酸溶液溶解，配制成每1毫升含0.234 mg的溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于分液漏斗中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.2）20 mL，加溴甲酚绿显色剂2.0 mL，用三氯甲烷15 mL萃取，待静置分层后，分取三氯甲烷层，以三氯甲烷为空白，于413 nm测定吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=2.612 9C+0.001 952（r=0.999 7），线性范围为0～0.234 mg。结果在线性范围内的对照品浓度与吸收度呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

对同一供试品（批号：070801），按照供试品的提取方法操作，连续测定6次，测得吸光度值为0.553、0.553、0.553、0.552、0.552、0.552，RSD为0.10%（n=6），表明该方法精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一供试品5份，每份约1 g，分别进行测定，结果平均含量为17.37 mg/片，RSD为0.13%（n=5）。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，在室温下放置不同时间（h），分别在0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0定吸光度，观察放置时间对吸光度的影响。测定结果（A）分别为0.241、0.241、0.242、0.243、0.243、0.245，RSD为0.63%（n=6），说明萃取液在6 h内吸光度基本无变化。

2.8 准确度测定

采用加样回收法，取已知含量的供试品（批号：071002），分别加入一定量对照品，按上述方法测定，结果平均回收率为100.96%，RSD为0.53%。

表1  回收率试验结果

取样量

（mg）样品含量（mg）加入量（mg）测得总量

（mg）回收率

（%）平均回收率（%）RSD（%）

511.24.348 22.512 56.897 5100.536 4100.96

0.53

504.84.861 92.512 57.452 1101.053 6

521.94.860 42.512 57.492 7101.624 9

519.25.001 72.512 57.610 4101.280 2

505.44.894 72.512 57.431 5100.328 1

2.9 样品测定

取不同批次样品，按上述方法进行测定，计算样品中延胡索乙素的含量，结果见表2。

表2  样品含量测定结果（n=2）

批号070901060920080201070818090101080401

含量（mg/片）11.746.9620.6113.0212.647.31

3 讨论

3.1 提取方法的选择

取供试品及阴性供试品各1 g，分别以石油醚（60～90℃）与乙醚脱脂，弃去石油醚，取药渣， 结果表明以石油醚（60～90℃）脱脂可以去除白芷对试验的干扰。

3.2 不同酸度的影响

采用不同浓度（0.5%、1%、1.5%、2%）的盐酸溶液提取，对提取结果进行比较，结果1.5%盐酸溶液提取效果更好。

3.3 提取时间考察

取同一批号供试品（批号：080304）5份，每份约1 g，精密称定，分别以石油醚（60～90℃）脱脂1 h，弃去石油醚，取药渣，挥干溶剂， 分别精密加入1.5%盐酸溶液50 mL，再分别超声处理（功率300 W，频率40 kHz）10、30、60、90、120 min，结果以超声处理30 min生物碱已经能够提取完全。

3.4 显色剂的选择

参考有关文献[1-3]，选用溴甲酚绿显色剂与甲基橙进行试验，结果表明溴甲酚绿测得的结果更稳定，采用溴甲酚绿为显色剂。

3.5 缓冲溶液酸度的考察

分别取pH为5.6、5.4、5.2、5.0、4.8、4.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液进行试验，结果证明pH=5.2的缓冲液更利于溴甲酚绿与生物碱结合成有机络合物。

3.6 测定波长的确定

精密吸取对照品溶液1 mL，阴性供试品溶液和供试品溶液各2 mL，置分液漏斗中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.2）20 mL和溴甲酚绿显色剂2 mL，用氯仿15 mL萃取，待静置分层后，分取氯仿层，于255～550 nm之间进行波长扫描，结果表明对照品溶液、供试品溶液在413 nm处吸收最强，而阴性供试品溶液在此处无吸收，最终选定413 nm为检测波长。

采用本方法测定元胡止痛片中总生物碱含量，操作简便，精密度及回收试验结果良好，阴性供试品对结果无干扰，且不同厂家生产的元胡止痛片中总生物碱含量差异明显。因此，增加元胡止痛片中总生物碱含量测定方法可有效控制元胡止痛片的生产投料。

[参考文献]

[1] 刘喜纲，刘翠哲，常金花. 应用酸性染料比色法测定总生物碱的含量[J].中国药房，2007，18（11）：875.

[2] 曾常青，罗北亮. 酸性染料比色法测定钩藤的总生物碱含量[J].中药材，2007，30（8）：1021-1024.

[3] 赵骏，齐喜红. 生物碱提取方法研究概述[J].天津中医学院学报，2003，22（4）：43-44.

生物碱含量 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

黄连取自我院实验室,应用的试剂主要有盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱,纯净水,色谱专用试剂乙腈,实验室专用试剂十二烷基磺酸钠、磷酸二氢钾、乙醇、甲醇、甲酸、丙酮、乙酸乙酯。仪器:循环水式真空泵、RayngerST型红外测温仪、RE32CS旋转蒸发仪、万分之一电子天平、十万分之一电子天平、超声波清洗器、UV系列紫外可见分光光度计、二极管阵列紫外检测器、液相色谱仪、Chrom eleon工作站。

1.2 制备方法

1.2.1 胆汁黄连取500g黄连和30mL新鲜猪胆汁,两者混合搅拌,保证黄连充分吸收胆汁,之后炒干。

1.2.2 醋黄连

取500g黄连和93g醋,用纯净水浸泡黄连,黄连切片后与醋混合,搅拌均匀,保证黄连充分吸收醋,之后晾晒、炒干。

1.2.3 姜黄连取500g黄连和65.5g醋,两者混合搅拌,之后用微火炒,黄连表面颜色变深后晾晒。

1.2.4 萸黄连

取500g黄连和50g吴茱萸,用适量的水煎煮吴茱萸,将黄连和吴茱萸煎液混合,保证黄连充分吸收煎液,之后炒干。

1.2.5 酒黄连取500g黄连和65.5g黄酒,两者混合搅拌,之后用微火炒,黄连表面颜色变深后晾晒。

1.2.6 生黄连取500g生黄连,呛水冲洗表面杂质,切片干燥。

1.2.7 供试品溶液

取上述炮制好的黄连粉末,用精密仪器称0.1g,在具塞锥形瓶中加入黄连、40mL盐酸-甲醇(1∶100),经1h超生处理后冷却,再次加入一定量盐酸-乙醇以补足质量,溶液混合均匀后过滤,在有刻度的量瓶中倒入混合溶液,加入盐酸-乙醇直至溶液的体积为50mL,混合均匀后过滤。

1.2.8 对照品溶液

取盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱,分别加入甲醇制成浓度为0.5mg/mL的对照品溶液。

1.2.9分析方法取10μL对照品溶液和供试品溶液进行分析,共有模式为共有峰面积均值和峰保留时间,利用中药色谱指纹图谱相似度软件进行计算分析,对不同辅料炮制黄连生物碱类成分含量进行检测。

2 结果

胆汁黄连、萸黄连、醋黄连、酒黄连、姜黄连中生物碱类含量分别为21.37%、22.29%、23.33%、22.18%、22.98%,均比生黄连20.14%略高,且小檗碱含量增加幅度较大,药根碱和巴马汀含量增加幅度较小。详见表1。

3 讨论

黄连是苦寒之药,如果长时间服用该药物,容易损伤脾胃,危害人体健康[4]。临床上通常使用黄连治疗肿毒痈疽病症,但是在腹泻、痢疾等病的治疗中,通常应用炮制后的黄连,防止黄连苦寒之性损伤人体健康。黄连发挥药效的主要成分是生物碱类物质,其中,小檗碱抑制细菌生长、增殖作用较强[5],而炮制后的黄连同样有此功效。黄连有多种炮制方法,而应用不同辅料炮制黄连时,黄连的药性会发生一定变化。黄连性寒,姜汁、吴茱萸和黄酒均属于温性辅料,可在一定程度上抑制黄连的寒性。反之胆汁性寒会加重黄连的寒性。使用不同方法炮制黄连后,其药理作用并不会发生显著变化,但是黄连药效强度可能受到影响。

本次研究中,胆汁黄连、萸黄连、醋黄连、酒黄连、姜黄连中生物碱类含量分别为21.37%、22.29%、23.33%、22.18%、22.98%,均比生黄连20.14%略高,且小檗碱含量增加幅度较大,药根碱和巴马汀含量增加幅度较小。可见,不同辅料炮制黄连后,黄连生物碱类含量发生了一定改变,但是变化并不显著。黄连生物碱类成分主要有药根碱、巴马汀、小檗碱,不同辅料炮制黄连中的生物碱类含量高低不同,其中,醋黄连生物碱类总含量最高,其次为姜黄连、萸黄连、酒黄连、胆汁黄连和生黄连。不同辅料炮制黄连的炮制时间、温度、浸润程度等可能影响黄连生物碱类的含量。酒的主要成分为乙醇,而乙醇可能通过与生物碱作用而促使生物碱类物质的溶出,而弱酸醋主要是将游离生物碱转化为可溶于水的生物碱,进而使生物碱类物质溶出。本次研究主要检测了黄连生物碱类的含量,发现不同辅料对黄连生物碱类的本质特性不会产生影响,但是会对生物碱的溶出率产生一定影响,从而使不同辅料炮制黄连的生物碱含量发生改变。胆汁黄连性苦寒,具有解毒、通肠利胆、明目清肝的功效。醋有助于黄连入肝经,强化黄连止痛药效,对妇女阴中肿痛、肝胆虚火心腹痛的治疗效果较好。吴茱萸性温,可抑制黄连的寒性,萸黄连通常用于下痢、泄泻、散肝胆郁火。姜性温,姜黄连通常用药胃热呕吐治疗。酒可缓和黄连寒性,可引药上行,酒黄连通常用于口舌生疮、目赤肿痛等病症。本次研究发现不同辅料会对黄连的化学成分产生一定程度的影响,而不同辅料炮制黄连的功效与其有效成分存在紧密联系,医学界应结合病症,从生物效应角度研究不同辅料对黄连生理生化指标和能量代谢的影响,并对不同炮制黄连的抗菌作用进行研究,从而充分发挥炮制黄连的作用。

综上所述,炮制过程会在一定程度上影响黄连的成分,但是应用不同辅料炮制对黄连生物碱类的影响并不大。

摘要：目的:研究不同辅料炮制对黄连生物碱类成分含量的影响。方法:应用黄连根茎,分别使用姜、吴茱萸、黄酒、醋、胆汁作为辅料炮制黄连,并对黄连中生物碱的成分进行检测,分析各类辅料对黄连生物碱类成分含量的影响。结果:胆汁黄连、萸黄连、醋黄连、酒黄连、姜黄连中生物碱类含量分别为21.37%、22.29%、23.33%、22.18%、22.98%,均比生黄连20.14%略高,且小檗碱含量增加幅度较大,药根碱和巴马汀含量增加幅度较小。结论:炮制过程会在一定程度上影响黄连的成分,但是不同辅料炮制对黄连生物碱类含量的影响并不大。

关键词：黄连,生物碱类,炮制,不同辅料

参考文献

[1]袁常青,邢亮.高效液相法测定黄连中盐酸小檗碱的含量[J].亚太传统医药,2010,6(8):32-34.

[2]李传钰,赵瑛.HPLC法测定不同配比黄连干姜盐酸小檗碱含量[J].亚太传统医药,2014,10(5):31-33.

[3]钟凌云,杨金梅,龚千锋,等.不同辅料炮制对黄连生物碱类成分的影响[J].中药材,2010,13(2):195-198.

[4]钟凌云,孙莹莹,龚千锋.炮制影响黄连药性研究现状及展望[J].中草药,2010,18(2):323-325.

生物碱含量 第5篇

关键词：黄芩;不定根;IBA浓度;培养基;总黄酮

中图分类号：S567.23+9.043 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2015）04-0065-02

收稿日期：2014-05-23

基金项目：吉林省科技项目（编号：201115228）。

作者简介：田海丽（1990—），女，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事植物生物技术研究。E-mail：tianhaili123@sina.com。

通信作者：吴松权，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植物种质研究。Tel：（0433）2435633;E-mail：arswsq@ybu.edu.cn。

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科黄芩属多年生草本植物，别称山茶根、黄金茶，始载于《神农本草经》，被列为中品[1]。黄芩以根入药，其味苦性寒，有清热除湿、泻火解毒、止血安胎、镇静抗炎的功效[2-3]。黄酮类化合物是黄芩的有效成分，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗HIV、清除自由基等作用，并且其毒性小，不易产生耐药性，生物安全性高[4-8]。这些特点使得黄芩的应用和开发越来越受到国内外医学界的关注，需求量随之急剧增加，致使野生黄芩被大量采挖，野生资源遭到了严重破坏，而黄芩在栽培过程中往往出现品质下降、农药残留等问题，市场供求矛盾日益尖锐。

不定根培养是一种植物器官培养方法，近年来正成为获取特定次生代谢产物的有效手段之一，具有生长周期短、可人为控制生长条件、重复性强等优点[9]。在目前的药用植物不定根研究中，研究得较为透彻的是人参，如韩国在研究人参不定根培养方面取得了重大成就，已达到了工业化生产程度;我国科研人员也相继对丹参、太子参、三七、红豆杉、甘草、柴胡、苍术、白术、东北刺人参、黄芪进行了研究[10]。但是目前还未发现利用黄芩不定根进行次生代谢的研究，因此本试验以黄芩为材料诱导不定根，研究B5、MS培养基与不同IBA浓度的组合对不定根增殖的影响，以期通过测定生物量、总黄酮含量，优化出最适宜的培养基与IBA激素浓度，为利用黄芩不定根规模化生产黄酮类化合物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

黄芩种子采集于吉林省延边朝鲜族自治州安图县。标准品芸香苷购自上海融禾医药科技发展有限公司;试验中所用到的其他试剂均为分析纯。

主要仪器为UV-3100紫外-可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 黄芩不定根诱导 选取籽粒饱满的黄芩种子播种，待苗长至6 cm时，选取根部，先用自来水冲洗2 h，再分别用75%乙醇漂洗45 s、无菌水漂洗3次、0.1%氯化汞消毒 6 min、无菌水漂洗6次后切成1 cm×1 cm的外植体，接种于B5+2.0 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂、pH值为5.8的培养基上，于（25±1） ℃暗培养，诱导不定根。

1.2.2 培养基及激素浓度组合的筛选 培养基为MS、B5，添加不同浓度的IBA（0、1、2、3、4、5 mg/L），培养基中其他成分同诱导培养基。在（25±1） ℃条件下暗培养7周，60 ℃烘干后称其干质量，即为生物量。

1.2.3 总黄酮测定 （1）对照品溶液的制备：精确称取1 mg芸香苷标准品，置于10 mL容量瓶中，先加30%乙醇溶解，再定容至10 mL，混匀后配制成标准溶液。（2）标准曲线的绘制：精确量取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再分别加入 0.3 mL 5%亚硝酸钠，混匀，静置6 min;加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，静置6 min;加入2.0 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，再分别用30%乙醇定容至10 mL，静置15 min，在 510 nm 波长处测定其吸光度D510 nm。以吸光度D510 nm为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，y=11.892 9x+0077 6，r2=0998 2。（3）样品溶液制备：称取100 mg烘干至恒质量的黄芩不定根，在液氮中充分研磨，加入1 mL无水乙醇充分混匀，振荡暗提取24 h，12 000 r/min离心10 min，收集上清液置于1 mL容量瓶备用。（4）样品总黄酮的测定：精确量取 0.3 mL 样品，以取样0 mL为空白对照，按照标准曲线的制备步骤的“加入30%乙醇至5 mL”起，至“分别测其吸光度”，从标准曲线上读出样品溶液中总黄酮的含量。

1.2.4 统计分析 使用SPSS 19.0進行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 培养基与IBA浓度对不定根生长的影响

由表1可以看出，在B5、MS培养基中，不定根的生长能力不同，且2种培养基之间存在显著性差异，B5培养基显著优于MS培养基，不定根在B5培养基中生长旺盛、分化多、白嫩、生长状态良好、老化速度慢，而在MS培养基中不定根生长缓慢、分化少、易老化，且生物量少。从激素浓度看，IBA促进了黄芩不定根生长，B5培养基与IBA组合促进了黄芩不定根的生物量积累，显著高于MS培养基与IBA组合;并且随着IBA浓度的提高，不定根上的愈伤组织也随之增多，当IBA浓度为1.0 mg/L时，不定根生长旺盛、分化多、根长、基本无愈伤组织，生物量较大，达0.628 g;当IBA浓度为4.0 mg/L时，生物量积累最大达0.641 g，但是此时不定根分化较少，且根长度较短，愈伤组织较多;当IBA浓度为5.0 mg/L时，生物量有所减少，这可能与激素浓度过高有关。

nlc202309051242

表1 培养基与IBA浓度对黄芩不定根生物量的影响

培养基

类型

不同IBA浓度的不定根生物量（g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 0.168j 0.628b 0.526d 0.612c 0.641a 0.436e

MS 0.128k 0.284g 0.242h 0.176i 0.304f 0.244h

注：表中数据后标有不同小写字母代表在0.05水平下差异显著。表2同。

2.2 培养基与IBA浓度对黄芩培养基不定根总黄酮含量的影响

由表2可以看出，IBA对黄芩不定根总黄酮的累积有促进作用，添加IBA后不定根的总黄酮量明显高于对照组，虽然MS培养基与IBA组合对总黄酮含量促进作用明显高于B5培养基与IBA组合，但是B5培养基中不定根的生物量显著高于MS培养基（表1），因此认为B5培养基更利于总黄酮的累积。IBA浓度为1.0 mg/L时，总黄酮含量最高，且与其他处理之间存在显著性差异;当IBA浓度为3.0 mg/L时，B5培养基总黄酮含量与对照无显著性差异，而MS培养基与对照之间存在显著性差异。因此可以认为，选择适当的IBA浓度才能增加黄芩不定根总黄酮的含量;万贵香等研究也表明，适宜的外源激素才能促进黄芩愈伤组织中黄芩苷的积累[11]。

表2 培养基和IBA浓度对黄芩不定根总黄酮含量的影响

培养基

类型

不同IBA浓度的总黄酮含量（mg/g）

0 mg/L 1.0 mg/L 2.0 mg/L 3.0 mg/L 4.0 mg/L 5.0 mg/L

B5 1.54bcd 2.49a 1.54bcd 1.34cd 2.11ab 1.79abcd

MS 0.59e 2.03abc 1.57bcd 1.39bcd 1.06de 1.97abc

注同表1。

3 结论

由研究结果可以看出，无论是B5还是MS培养基，在供试IBA浓度范围内黄芩不定根生物量与总黄酮的累积都存在2个高峰。第1个高峰期为1.0 mg/L IBA，这可能是低浓度的IBA促进了不定根的生长与黄酮类物质的积累;随着IBA浓度增加，对其促进作用减小并逐渐形成激素胁迫使生物量与总黄酮减少;之后随着IBA浓度进一步增加，不定根响应激素胁迫而逐渐适应了较高的IBA浓度，出现了第2个高峰期，在B5培养基生物量和总黄酮最高时期为4.0 mg/L处理，而MS培养基中生物量最高时期为4.0 mg/L处理，总黄酮最高时期为5.0 mg/L处理。可见黄芩不定根在不同培养基中应对高浓度外源激素胁迫的能力是有不同的，总体可见，B5培养基中IBA浓度为1.0 mg/L时，总黄酮含量最高，达2.49 mg/g。

B5培养基和MS培养基主要区别在于培养基的铵态氮与硝态氮比值的差异，B5培养基铵态氮与硝态氮比值是MS培养基的1/6，铵态氮含量远低于MS培养基，从而使硝态氮更利于不定根生长及总黄酮积累，这也可能是B5培养基优于MS培养基的原因。Cui等研究发现，氮源类型影响不定根生长及次生代谢产物积累，硝态氮更利于不定根的生长[12]。本试验表明，黄芩不定根在B5培养基中生长状态良好，而且B5培养基生物量显著高于MS培养基，使B5培养基总黄酮积累显著高于MS培养基，推测是由于氮源类型的差异引起的，这还需要进一步的试验鉴定。

参考文献：

[1]周锡钦，张庆英，梁 鸿，等. 黄芩中主要黄酮类成分的含量分析[J]. 中国中药杂志，2009，34（22）：2910-2915.

[2]张 瑜，武 斌. 黄芩药理作用的研究进展[J]. 医学综述，2013，19（6）：1091-1093.

[3]王 玮，白 月，王俊平. 黄芩茎叶总黄酮对大鼠气囊滑膜炎抗炎作用机制的研究[J]. 沈阳医学院学报，2008，10（1）：24-25.

[4]赵 梅，周淑琴. 黄芩中黄酮类化合物抗肿瘤作用的研究进展[J]. 中国药房，2013，24（11）：1050-1052.

[5]Li-Weber M. New therapeutic aspects of flavones：the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin，Baicalein and Baicalin[J]. Cancer Treatment Reviews，2009，35（1）：57-68.

[6]Zhang D Y，Wu J，Ye F，et al. Inhibition of cancer cell proliferation and prostaglandin E-2 synthesis by Scutellaria baicalensis[J]. Cancer Research，2003，63（14）：4037-4043.

[7]郭少英，程发峰，钟相根，等. 黄芩苷的体外抗氧化研究[J]. 时珍国医国药，2011，22（1）：9-11.

[8]李晨睿，牛银波，潘亚磊，等. 黄芩药动学研究进展[J]. 中国药理学通报，2013，19（8）：1048-1053.

[9]Wu S Q，Lian M L，Gao R，et al. Bioreactor application on adventitious root culture of Astragalus membranaceus[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2011，47（6）：719-724.

[10]尹雙双，高文远，王 娟，等. 药用植物不定根培养的影响因素[J]. 中国中药杂志，2012，37（24）：3691-3694.

[11]万贵香，马 琳，张 坚. 不同浓度的外源激素对黄芩愈伤组织的生物量和黄芩苷含量的影响[J]. 中国中药杂志，2012，37（24）：3799-3802.

[12]Cui X H，Murthy H N，Wu C H，et al. Adventitious root suspension cultures of Hypericum perforatum：effect of nitrogen source on production of biomass and secondary metabolites[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2010，46（5）：437-444.

生物碱含量 第6篇

关键词：鸡骨草叶,总生物碱,含量测定,抗氧化活性

鸡骨草(Hance)是一种流行的中国蔬菜食用的饮料、汤或民间医药。它是豆科相思子属植物广州相思子(Abrus Cantoniensis Hance)的干燥全草,是一种常用中药材,其性凉,味甘淡[1],具有清热解毒,疏肝止痛之疗效,鸡骨草还可在春夏季节用来煲汤作为食疗,是临床常用中药,广泛用于治疗黄疸,胁肋不舒,胃脘胀痛,急、慢性肝炎及肝硬化腹水等疾病[2,3]。具有对肝脏的保护作用,抗菌和抗病毒作用,抗炎、免疫调节作用,降脂作用,对羟基自由基的清除作用等[4]。原产地于广西、广东等南部省区,以广西的种植面积最大,是两广的地道药材,其植株含相思子碱、糖类化合物、皂苷、黄酮苷、胆碱、甾醇类、氨基酸等化学成分[2,3,4,5]。也是含天然生物碱丰富的植物之一。

总生物碱是存在于自然界(大部分存在于植物[6],但在一些动物上也有发现)中的一类含氮的碱性有机化合物,有似碱的性质,因此以前又称为赝碱。大多数为环状结构,氮素多包含在环内,具有明显的生物活性,是中草药中重要的有效成分之一。具有光学活性。目前研究表明[7,8,9],由于氧化损伤的机制在疾病的发生发展中起着重要的作用,所以中药的抗氧化作用是其达到治疗效果的重要因素。很多疾病包括肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆等都不同程度地与自由基活性损伤有关。而生物碱类化合物具有很强的抗菌活性[10]、抑制活性氧、清除自由基等[11]作用,同时毒副作用相对小于化学合成药,因此一直是人们竭力于开发新药的重要研究领域。目前国内外对鸡骨草黄酮类和多糖类成分测定和含量测定的研究较多,而有关生物碱类的成分及含量测定的研究国内外报道较少见。但是,近年来,对鸡骨草叶总生物碱的研究引起了人们极大的兴趣。

1 仪器与材料

1.1 试验材料

鸡骨草(Abrus Cantoniensis Hance)叶购于广西百色市右江区农贸市场,经右江民族医学院民族医教研室覃道光副教授鉴定为豆科相思子属植物鸡骨草的叶。

1.2 主要实验器材

KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、752N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、电子分析天平FA1204(上海天美天平仪器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A型(上海精宏实验设备有限公司)、台式连续投料粉碎机DF-15(温岭市林大机械有限公司)、电热式恒温水浴锅HHS-214(江苏金坛宏凯仪器厂)、SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、PHSJ-4A型实验室p H计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.3 试剂

盐酸小檗碱标准品(中国食品药品检定研究院,批号:110713-201212)、ABTS对照品(上海金穗生物科技有限公司,批号:C18H24N606S4);DPPH对照品(日本东京化成工业株式会社,批号:217-591-8)。其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 生物碱的提取

称取鸡骨草叶粉末500 g,提取条件是:超声辅助功率60 W,提取时间30 min/次,提取2次,料液比(g∶m L)1∶9,提取温度70℃,提取剂70%乙醇,合并滤液,经石油醚去除色素,用氯仿萃取2次,取下层液体水浴蒸发浓缩至褐色浸膏[12]。

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 标准溶液的配制

称取5.0 mg干燥的盐酸小檗碱标准品,用蒸馏水溶解置50 m L容量瓶中,稀释至容量瓶的刻度线,摇匀备用。用移液管从中精密吸取5.0 m L该溶液于25 m L的容量瓶中,加入0.1 mol/L的盐酸溶液并稀释至容量瓶的刻度线,制0.02 mg/m L的液体作为盐酸小檗碱对照品母液[13]。

2.2.2 标准曲线的绘制

分别吸取0.02 mg/m L的盐酸小檗碱对照母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 m L置于10 m L容量瓶中,加入0.1 mol/L的盐酸溶液定容,摇匀备用,作为实验组,在波长为345 nm下测定其吸光值(A)[14]。选择等体积的0.1 mol/L的盐酸溶液,作为空白对照组,在相同的条件下测定其吸光值(A),以横坐标为浓度C,纵坐标为吸光值(A),得出标准曲线:A=0.23+1.2675C(r2=0.9997)。

2.2.3 样品含量的测定

称取提取物5.0 g置于烧杯中,用蒸馏水溶解,置于250 m L的容量瓶中,加蒸馏水定容,制成0.02 g/m L的液体混合均匀备用;精密吸取5.0 m L提取物溶液至10 m L容量瓶中,加入0.1 mol/L盐酸溶液定容,混合均匀备用;采用二倍稀释法得到5 mg/m L的溶液[15],再次用紫外-可见分光光度法于345 nm波长下测定其吸光值(A),通过标准曲线方程计算总生物碱含量为1.89 mg/g[16]。

2.3 总生物碱体外抗氧化活性的测定

2.3.1 测定总生物碱还原Fe3+活性的能力

取5支试管中,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 m L的0.02 g/m L样品,体积少于0.5 m L则用蒸馏水补至体积相等。加入1%铁氰化钾及p H=6.6磷酸缓冲液各2.5 m L于50℃水浴箱中恒温20 min后,立即加入10%三氯乙酸2.5 m L,置于4000 r/min的转数下离心10 min,取上清溶液2.5 m L,加入2.5 m L的蒸馏水及0.5 m L的0.1%三氯化铁,10 min后,采用紫外-可见分光光度法于波长700 nm处测吸光度值(A)[17]。

2.3.2 总生物碱对DPPH自由基清除活性的测定

取5支试管,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 m L的样品,加蒸馏水补至体积相等。在避光条件下分别加入4 m L浓度为24 mg/L的DPPH乙醇(95%)溶液摇匀,作为实验组,常温下避光30 min,采用紫外-可见分光光度法在517 nm处测吸光度(Ai),以等量不加样品提取液的DPPH乙醇(95%)液为对照组,采用同样的方法测定对照组吸光度(A0)。清除率=(1-Ai/A0)×100%[18]。

2.3.3总生物碱对ABTS自由基清除活性的测定

分别将7 mmol/L的ABTS溶液50 m L与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液50 m L在常温下混合,将混合后溶液作为ABTS储备液,并在室温下避光16 h,用甲醇将置于暗处16 h后的溶液稀释至734 nm波长下的吸光度为0.7。分别吸取样品20、40、60、80、100μL,置于支试管中,再用80%乙醇溶液补至体积相等,分别加入2 m L的ABTS储备液,常温下反应6 min后,在相同的波长下测定其吸光度值(Ai)。测定2 m L的ABTS储备液与100μL 80%乙醇溶液混合后的吸光度值(A0);以2 m L甲醇代替ABTS储备液,采用紫外-可见分光光度法测定其吸光度值(Aj)。清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%[19]。

2.4 结果与分析

2.4.1 鸡骨草叶总生物碱还原Fe3+的能力

吸光度值(A)越大代表被测样品还原Fe3+的能力的越强,鸡骨草叶总生物碱具有一定还原Fe3+的能力,样品量越大其吸光度值就越大,即还原Fe3+的能力就越强[20]。见图1。

2.4.2 总生物碱对DPPH自由基活性的清除

1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH·)是一种很稳定的自由基[10],鸡骨草叶总生物碱对DPPH自由基活性具有较好的清除能力;样品体积为400μL时,其清除率是90%。样品体积越大清除率就越大,两者呈量效关系,样品体积在300~400μL范围内,总生物碱对DPPH自由基活性具有较强的清除作用。见图2。

2.4.3 总生物碱对ABTS自由基活性的清除

鸡骨草叶总生物碱对ABTS自由基活性具有显著的清除作用,样品体积在100μL时,清除率为85.53%。在20~100μL范围内,鸡骨草叶总生物碱对ABTS自由基活性的清除作用随着样品体积的增加而增强。见图3。

3 讨论

本实验在综合了前人对鸡骨草成分提取的研究[4]以及一般总生物碱的提取、含量测定的研究基础上,运用较为简单的超声辅助乙醇溶剂提取法提取鸡骨草叶总生物碱,并对其含量进行了测定[21]。

生物碱含量 第7篇

关键词：香兰素衍生物,高效液相色谱法,含量测定

香兰素衍生物是由香草醛经过取代反应及甲氧基化反应合成的[1]。目前广泛用于医药、香料、农药、有机合成及药用辅料等领域。另经研究发现,香兰素衍生物能清除自由基,具有良好的抗氧化活性[2,3],对细胞基因组织损伤和细胞凋亡均有良好的保护作用[4],能够促进DNA双链断裂损伤修复,有效防护细胞凋亡和基因损伤[5],作为一种食品添加剂和香料,其毒性较低,气味芳香,服用顺应性好[6],作为一种低剂量辐射损伤保护剂,极具开发前景。本文建立了一种高效液相色谱法测定其片剂中香兰素衍生物的含量,此方法简便、快捷,具有较高的专属性和灵敏度,为片剂质量标准的制订提供了有力的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters2695四元泵,2996二极管阵列检测器,美国Waters公司),Empower数据处理系统(美国Waters公司);BP211D型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-3200超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),LDZ5-2医用离心机(北京医用离心机厂)。

1.2 试药

香兰素衍生物片(规格:50 mg,批号:100304、101019、111028,军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供),香兰素衍生物对照品(批号:091206,军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供),甲醇(色谱纯,安徽时联特种溶剂有限公司);水(杭州哇哈哈集团有限公司);冰醋酸(分析纯,北京化工厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-0.002%醋酸(40︰60);流速:1.0 mL/min;检测波长:306 nm;柱温:35℃;进样量20μL。

2.2 专属性实验

2.2.1 空白辅料按照处方量配制辅料,精密称取辅料约15 mg,置25 mL量瓶中,加适量甲醇,超声30 min,放冷至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.22μm)过滤。精密移取滤液5 mL,置25 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见图1(A)。取流动相甲醇-0.002%醋酸(40︰60)20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见图1(B)。结果表明,片剂辅料无干扰。

2.2.2 香兰素衍生物对照品储备液制备精密称取香兰素衍生物对照品约20 mg,置50 mL量瓶中,加适量甲醇溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成1 mL含香兰素衍生物约0.4 mg的溶液,即得。

2.2.3 对照品溶液制备精密移取“2.2.2”项下香兰素衍生物对照品储备液5 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见图1(C)。

2.2.4 样品溶液制备取香兰素衍生物片10片(批号:101019),研细,精密称取片粉约25 mg(相当于香兰素衍生物约10 mg),置25 mL量瓶中,加适量甲醇,超声振荡30 min,放冷至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.22μm)过滤,精密移取上清液5 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见图1(D)。

A.流动相;B.辅料;C.对照品;D.样品;1.香兰素衍生物

2.3 线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分别置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度的标准溶液。分别取20μL注入液相色谱仪。以溶液浓度X(mg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标作线性回归,得回归方程为Y=1.15×108X+3.66×106(r=0.999 6,n=7)。结果表明:香兰素衍生物浓度在0.02～0.14 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密移取“2.2.2”项下储备液5 mL置25 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得对照品溶液。取对照品溶液20μL注入液相色谱仪,连续进样6次,记录色谱图,香兰素衍生物峰面积RSD为0.07%,表明此方法精密度良好。

2.5 重复性试验

取香兰素衍生物片10片(批号:101019),研细,精密称取片粉约25 mg(相当于香兰素衍生物约10 mg),共6份,按“2.2.4”项下操作,制得样品溶液,分别取20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,以外标法计算香兰素衍生物百分含量,平均含量为99.1%,RSD为0.70%(<1%),表明方法重复性良好[7]。

2.6 稳定性试验

取“2.2.3”项下的对照品溶液及“2.2.4”项下的样品溶液,在室温下放置2、4、6、8、10 h,分别取20μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,峰面积RSD分别为0.28%和0.05%,结果表明溶液在10 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

采用回收法,精密称取片粉约25 mg,分别加入对照品适量,置50 mL量瓶中,按“2.2.4”项下操作,测定回收率。见表1。

2.8 样品含量测定

精密称取样品片粉适量(约相当于香兰素衍生物10 mg),按“2.2.4”项下操作,记录色谱图,按外标法以峰面积计算含量,结果三批样品含量分别为标示量的99.3%,100.8%和99.6%,平均含量为99.9%,RSD为0.79%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取对照品溶液在200～800 nm范围内进行扫描,在215、230、306 nm处有最大吸收。在215 nm处流动相有较强的背景吸收,易干扰测定。230 nm处为一肩峰,吸光度值变化较大,也不适合作为检测波长。故检测波长定为306 nm。

3.2 流动相的选择

参考有关文献[8,9],考察了乙腈-水系统,甲醇-水系统,甲醇-异丙醇-水系统,甲醇-水-乙二胺系统及甲醇-水-冰醋酸系统。试验结果显示,乙腈-水系统出峰时间过早,但是甲醇-水系统峰形不够理想。在甲醇-水系统中加入异丙醇,对峰形均无明显改善,而在系统中加入乙二胺后,主成分出峰时间过早。最终通过改变冰醋酸的浓度,使峰形对称度良好并且理论塔板数大于5 000。最终确定了流动相组成为甲醇-0.002%醋酸(40︰60)。

3.3 溶剂的选择及样品处理

香兰素衍生物在甲醇中溶解,在水中几乎不溶,故先加入适量甲醇,并超声30 min,使片粉中的主药成分充分溶解,再加入甲醇稀释至刻度,以减少样品溶液中淀粉等多糖类辅料的溶解,延长色谱柱使用寿命。在进样前以孔径为0.22μm的滤头过滤,防止样品中不溶于甲醇的成分影响测定结果或堵塞液相色谱系统。

参考文献

[1]张万宏,李财林,雷志刚.对羟基苯甲醛合成方法概述[J].化工生产与技术,2006,13(1):45-47.

[2]郑红.香兰素衍生物Dimovanin的辐射防护剂作用机制研究[D].合肥:安徽医科大学,2006.

[3]郑红,汪思应,严雨倩,等.香兰素衍生物对辐射损伤细胞保护作用的初步研究[J].辐射防护,2008,28(4):226-231.

[4]黄睿,贺性鹏,徐勤枝,等.香兰素衍生物VND3207对γ射线照射人淋巴母细胞基因组损伤和凋亡的保护作用[J].辐射防护,2009,29(4):225-231.

[5]陈倩倩,汪黎,尚增甫,等.香兰素衍生物VND3207对α粒子辐射诱发人成纤维细胞基因组DNA损伤的防护研究[J].科技导报,2010,28(4):31-36.

[6]史晓佩,王潇,孔福全,等.⁷Li离子辐照对SH-SY5Y细胞的损伤效应及香兰素衍生物的辐射保护作用[J].中国原子能科学研究院年报,2009:184-186.

[7]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:665.

[8]刘玉明,张术,黄来龙,等.毛细管气相色谱法测定肤疾安药物中香兰素的含量[J].药物分析杂志,2010,30(2):336-338.

氯苄基砜衍生物含量测定方法学研究 第8篇

1 仪器与试药

Waters Alliance 2996/2695高效液相色谱仪 (美国) ;BP211D型电子天平 (德国SARTORIUS) ;UV2510紫外可见分光光度计 (日本岛津) 。CBS对照品 (批号20111103, 纯度99.96%) CBS供试品 (自制, 批号:20110916, 20110929, 20111021) 均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。乙腈 (色谱纯) 购自山东禹王实业有限公司;三氟乙酸 (色谱纯) , 水为纯化水 (哇哈哈有限公司) , 其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Phenomenex C18 (250×4.6mm, 5μm) ;流动相:乙腈-0.1%三氟乙酸 (45:55, V/V) ;检测波长:279 nm;流速:1.0 ml/min;进样体积:20μL;柱温:40℃。在该色谱条件下, 理论板数按CBS峰计算不低于10000, 分离度大于1.5, 色谱图见图1。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制

精密称取对照品10 mg于100 m L量瓶中, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 溶解并制成每1 m L约含CBS0.1 mg的溶液, 作为对照品贮备液。

2.2.2供试品溶液配制

精密称取样品10 mg, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 溶解并制成每1 m L约含CBS0.05 mg的溶液, 作为供试品溶液备用。

2.3 专属性考察

2.3.1 酸降解物

取CBS样品配制得1 mg/m L贮备液。精密量取贮备液1 m L于10 m L量瓶中, 加1.0 mol.L-1盐酸3 m L, 80℃水浴加热5.5小时, 加1.0 mol.L-1氢氧化钠3 m L调至中性, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 定容至刻度, 进样20μL, 记录色谱图2 (a) 。

2.3.2 碱降解物

取CBS样品配制得1 mg.m L-1贮备液。精密量取贮备液1 m L于10 ml量瓶中, 加1.0 mol.L-1氢氧化钠3 m L, 80℃水浴加热5.5小时, 加1.0 mol.L-1盐酸3 m L调至中性, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 定容至刻度, 进样20μL, 记录色谱图2 (b) 。

2.3.3 氧化产物

取CBS样品配制得1 mg.m L-1贮备液。精密量取贮备液1 m L于10 m L量瓶中, 加30%双氧水3 m L, 80℃水浴加热5.5小时, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 定容至刻度, 进样20μL, 记录色谱图2 (c) 。

2.3.4光降解物

取CBS样品在4500 xl光照条件下放置10天后, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 配制得100μg.m L-1溶液, 进样20μL, 记录色谱图2 (d) 。

2.4 线性范围的考察

分别精密量取“2.2项下”对照品贮备液1.0 m L、2.0m L、4.0 m L、5.0 m L、6.0 m L、8.0 m L, 置10 m L量瓶, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 稀释至刻度, 分别配制成10、20、40、50、60、80μg.m L-1的梯度对照品溶液, 取上述溶液及贮备液20μL, 在“2.1”色谱条件项下分别2次进样。以对照品进样浓度 (X, μg.m L-1) 为横坐标, 以对照品峰面积 (Y) 为纵坐标, 绘制标准曲线, 进行回归分析, 结果表明CBS在10μg.m L-1~100μg.m L-1的范围内具有良好线性关系。回归方程为Y=10018X+54521, r2=0.9990 (n=7) 。

2.5 检测限与定量限的确定

以信噪比3:1时注入仪器的量为检测限, 以信噪比约为10:1时注入仪器的量为定量限。结果CBS的检测限为1.2ng, 定量限为4.0 ng。

2.6 精密度试验

取“2.4”项下浓度为50μg.m L-1的对照品溶液, 按上述色谱条件连续进样6次, 其色谱峰面积的RSD为0.6%。结果表明测定时仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批的LF原料药按“2.2”项下方法制备浓度为40μg.m L-1、50μg.m L-1和60μg.m L-1的高中低3个浓度的标准溶液, 每个浓度平行配制3份, 共9份, 在“2.1”色谱条件项下分别进样测定, 平均含量为100.91%, RSD为0.93%, 表明本法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

取室温下放置的高、中、低3个浓度的供试品溶液, 在0, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h分别进样20μL, 测定峰面积, 计算高、中、低3个浓度的峰面积的RSD分别为1.3%、1.5%及0.43%。表明供试品溶液在室温放置72h内稳定性良好。

2.9 有关物质

取样品10 mg, 加不加酸流动相溶解并稀释制成每1m L约含0.1 mg的溶液, 摇匀, 作为供试品溶液;精密量取1 m L, 置100 m L量瓶中, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 稀释至刻度, 摇匀, 作为对照溶液。照含量测定项下的方法试验, 精密量取对照溶液20μL注入液相色谱仪, 调节仪器灵敏度, 使对照溶液中主成分峰的峰高约为记录仪满量程的10%-30%;再取供试品溶液20μL, 注入液相色谱仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍, 供试品溶液的色谱图中如有杂质峰, 用各有关物质峰面积与对照溶液主成分峰面积 (1%) 做比较, 计算有关物质的量, 单个杂质不得大于1.0%, 总杂质不得高于1.5%, 结果见表1。

图2破坏试验结果 (a) 为酸破坏, 结果显示基本没有新的降解产物出现, (b) 碱破坏和 (c) 氧化破坏结果显示有较多新的降解产物出现, (d) 中主要为保留时间为10.1min的降解产物出现。

3 含量测定

精密量取供试品储备液5 m L置10 m L量瓶中, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 稀释至刻度, 摇匀, 得到50μg.m L-1的样品溶液。精密量取20μL注入高效液相色谱仪, 记录色谱图。另取对照品储备液5 m L置10 m L量瓶中, 加不加酸流动相 (乙腈:水=45:55) 稀释至刻度, 摇匀, 得到50μg.m L-1的对照品溶液, 依“2.1项下”色谱条件测定。按外标法以峰面积计算其含量, 结果见表1。

4 讨论

4.1 波长选择

采用全波长对样品进行测定, 通过考察各成分的分离情况及各色谱峰的丰度, 最后选定检测波长为279 nm。

4.2 流动相确定

比较3种流动相系统及其不同的流动相比例, 包括乙腈:0.1%三氟乙酸、甲醇:0.1%三氟乙酸、乙腈:醋酸水溶液, 比较的醋酸浓度有0.1%, 0.05%醋酸水溶液;乙腈:0.1%三氟乙酸系统考察等度及梯度系统。结果表明, 各种流动相中以乙腈:0.1%三氟乙酸系统最佳, 其图谱上各个色谱峰的分离度较好, 保留时间适中, 因此选择此流动相系统作为样品HPLC检测的流动相。

4.3 色谱柱考察

选择不同填料、规格及厂家的色谱柱进行比较, 包括Phenomenex LUNA C18Colum (250mm×4.6mm, 5μm) 、Diamonsil C18Colum (250mm×4.6mm, 5μm) 、Agilent Zorbax C18Colum (250mm×4.6mm, 5μm) 。结果表明, 各种色谱柱中以Phenomenex LUNA C18Colum最佳, 所得色谱图分离度良好, 柱效较高, 因此选择此色谱柱作为样品HPLC检测色谱柱。按本文的色谱条件对样品进行测定, 样品均能与其他成分很好的分离, 测得理论板数、分离度及对称因子, 结果见表2。

4.4 其他

比较不同柱温与流速, 柱温升高, 分析时间缩短, 峰型改善;流速低于1.0 m L.min-1分析时间延长, 高于1.0m L.min-1分析时间缩短。因此选择柱温40℃与流速1.0m L.min-1。

综上所述, 经过试验确定CBS的HPLC分析方法, 同时测定3批次该原料药。上述方法准确、稳定, 操作简单易于实施, 可用于CBS的质量控制。

摘要：目的 建立氯苄基砜衍生物 (CBS) 含量测定高效液相色谱法, 并进行方法学研究, 验证方法的可靠性及科学性;方法 色谱柱为Phenomenex LUNA C18250×4.6mm 5μm;流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸 (45:55, V/V) ;流速1.0mL.min-1;检测波长279 nm;柱温40℃;进样体积20μL;结果 精密度RSD为0.6%, 线性范围为10μg·mL-1100μg·mL-1 (r2=0.9990) , CBS平均含量为100.91% (n=6) , 有关物质与主峰分离良好。结论 该方法简便、灵敏、准确, 可用于CBS的质量控制。

关键词：氯苄基砜衍生物,方法学研究,高效液相色谱法

参考文献

[1]许爱琴, 孙玉文, 冯全生, 等.现代中医防辐射研究进展[J].现代中西医结合杂志, 2010, 19 (30) :3361-3363.

[2]杨镇州.抗辐射药物研究进展[J].重庆药学, 2004, 33 (3) :467-469.

[3]Mihel BD, et al Mechims of DNA Damagese Repair.Academic, 1986:325-328.

[4]Nenot JC.Radiation accidents over the last 60 years.Radiol Prot2009, 29:301-320.

[5]国家药典委员会.中国药典[M].第二部.北京:中国医药科技出版社, 2010.

生物碱含量 第9篇

1 材料与方法

样品的采集与预处理方法参见文献[1],生物体经预处理后成为待测样品。准确称取适量待测样品于坩埚中,小火蒸干、低温碳化后,高温灰化完全,用稀硝酸溶解,转移至比色管中定容、待测。Pb的含量采用原子吸收光谱法测定,仪器为日立Z-8000/Z-2000型塞曼效应原子吸收分光光度计。测定结果以湿体质量表示,数据的统计分析应用SPSS软件。

Pb的风险评估参照国际食品法典委员会所描述的4个分析步骤[2],危害识别和危害描述确定Pb对健康的影响、危害,对由此产生的不良健康影响进行定性分析、描述。根据水产品的膳食摄入量估算Pb的暴露量,描述其安全性。采样站位图见图1。

2 结果与讨论

2.1 生物体Pb的含量

此次调查选取生物样品共63个,包括鱼类样品30个、甲壳类样品18个、头足类样品15个。统计分析的结果显示,大亚湾海域生物体Pb的含量服从正态分布(图2),其含量范围和平均值分别为0.10～0.54 mg·kg-1和(0.33±0.10)mg·kg-1。其中鱼类、甲壳类和头足类生物样品Pb的含量均值分别为0.28、0.43和0.30 mg·kg-1,变化范围分别为0.10～0.51、0.32～0.54和0.17～0.34 mg·kg-1。头足类样品Pb的含量均低于食品中污染物质限量[3]标准和无公害水产品有毒有害物质限量[4]标准中Pb的限量值[w(Pb)≤0.5 mg·kg-1],带鱼、赤虾和梭子蟹各有1个样品Pb的含量超过标准的限量值。与国内其他海域生物体Pb的含量相比(表1),大亚湾海域生物体Pb的含量处于较低水平。

对此次调查的生物体按所属目别分别统计,不同类群生物体Pb的含量统计结果列于表2。

从表2的数据可以看出,大亚湾海域生物体Pb的含量以鱼类最低、头足类次之、甲壳类最高。统计分析结果表明,甲壳类生物体Pb的含量明显高于鱼类和头足类样品。在同一类群的样品中,不同目别的生物体Pb的含量没有显著差异。

鱼类与头足类生物活动于海洋的水层中,甲壳类生物栖息于沉积物的表层,海洋沉积物Pb的含量远远高于海水中Pb的含量。Pb不是生命过程中所需要的元素,生物体内的Pb源于外界环境的污染,是生物体被动吸收的结果。生物体暴露于受污染的海洋环境中,通过摄食等生命活动,肌体组织中的Pb不断积累。甲壳类生物栖息环境中Pb的含量高,鱼类与头足类生物栖息环境中Pb的含量低。甲壳类生物与鱼类、头足类生物样品中Pb含量差异,反映了生物栖息环境对其组织中Pb含量的影响。

2.2 生物体Pb含量的风险评估

风险评估由国际食品法典委员会所描述的4个分析步骤组成[2],即危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述。危害识别确定某种或某一组食品中可能产生不良健康影响的生物、化学和物理因素。危害描述对食品中生物、化学和物理因素产生的不良健康影响的特性进行定性和/或定量分析。暴露评估对可能经食品摄入的及其他相关途径暴露的生物、化学和物理因素进行定性和/或定量评估。风险描述是在前述3个过程的基础上,对特定人群中产生已知或潜在不良健康影响的可能性及严重性进行定性和/或定量估计。

2.2.1 危害识别与描述

现代医学证实,Pb及其化合物都具有一定的毒性,主要抑制细胞内含巯基的酶而使人体的生理和生化功能发生障碍,引起小动脉痉挛,损伤毛细血管内皮细胞,影响能量代谢,导致卟啉代谢紊乱,阻碍高铁血红蛋白的合成,改变红细胞及其膜的正常性能,阻抑肌肉内磷酸肌酸的再合成等,从而出现一系列病理变化,其中以神经系统、肾脏、造血系统和血管等方面的改变更为显著[10,11,12,13]。Pb通过消化道,被吸收到血液循环,很快分布于全身组织和器官。随后95%以上以不溶性磷酸盐形式沉积于骨骼组织中[14]。当由于感染、创伤、劳累、饮用含酒类的饮料或服酸性药物等破坏体内酸碱平衡时,骨内不溶解的三盐基磷酸铅便转化为可溶的二盐基磷酸铅移至血液;而血液中Pb浓度大量增加,可发生Pb中毒症状。调查结果表明,血Pb含量与儿童身高、脾气暴躁程度的评价呈负相关,儿童思维判断和表达自我能力的发育因血Pb升高而延缓[15]。国内外大量研究表明,婴幼儿和儿童的血Pb水平与智商(IQ)值显著相关,当血Pb水平每增加100 μg·L-1时,智商降低1～3分[16]。

2.2.2 暴露评估

暴露评估描述Pb的暴露途径,并估计其总暴露量。根据对健康的不良影响是急性还是慢性,暴露评估也分为急性暴露评估和慢性暴露评估。急性暴露评估是一顿饭或24 h内的暴露情形,以及以最高残留水平计算的高暴露值。慢性暴露评估是6个月以上至终身暴露的情形,根据平均残留水平计算的平均暴露值。文章根据大亚湾生态环境调查的实际数据,进行慢性暴露评估。对于水产品中的Pb,其暴露途径只有膳食摄入。其他环境污染的暴露途径的摄入量该文将不作评估。儿童对Pb比较敏感,对Pb的吸收率较成年人高5～10倍。而且Pb对儿童的危害较成年人严重,评估过程中的易感性差异主要考虑人群的年龄差异,即成年人与儿童的差异。

暴露量的计算公式如下:

undefined

式中E为暴露量;C为Pb含量;I为膳食量;k为吸收率;Bw为体质量。

文章采用粗略的点评估方法,评估大亚湾海洋生物体Pb的膳食暴露量,计算结果见表3。对于上式中参数的取值,做如下说明。C以大亚湾海洋生物体Pb含量的“平均值±标准偏差”表示;膳食量I是暴露量计算公式中不确定性最大的变量,此处设为4个等级,分别以I1～I4表示。根据广东地区的水产品消费量[17]和中国居民膳食营养状况调查,分别取值为60、45和30 g,代表广东省、全国城市与农村的水产品每日消费量。沿海地区水产品消费量高于其他地区,并参照沿海地区水产品消费量的有关报道,假定水产品每日膳食量的上限为200 g;k取值1,表示通过膳食摄入的Pb吸收率为100%;Bw分成年人和儿童,分别取值为60和30 kg。

2.2.3 风险描述

Pb的安全摄入量值是以暂定每周耐受摄入量(PTWI)表示。PTWI的计算公式为:PTWI=TDI×7。其中TDI为每日耐受摄入量。根据大亚湾海域水产品中Pb的含量,以每日膳食暴露量代替TDI计算出的PTWI值见表3。世界卫生组织/世界粮农组织的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)推荐的Pb的PTWI值是25 μg·kg-1-Bw[18,19,20,21]。与该数值相比,在假定的每日最大水产品膳食量情况下,Pb在体内的暴露量低于JECFA的推荐值,通过水产品膳食摄入的Pb的量处于安全范围。

3 小结

大亚湾海域生物体Pb的含量服从正态分布,平均值为(0.33±0.10)mg·kg-1。受生物的生活环境影响,甲壳类生物样品中Pb的含量明显高于鱼类和头足类样品。与无公害水产品质量限量标准相比,大亚湾海洋生物体Pb的含量低于限量标准值。

大亚湾海洋生物体中的Pb通过膳食进入体内,其暴露量主要与水产品的膳食量有关,膳食量高则Pb的暴露量高。成年人Pb的暴露量高于儿童。与JECFA推荐的Pb暂定每周耐受摄入量相比,在假定的每日最高水产品膳食量水平下,Pb的暴露量处于安全范围。

摘要：文章分析讨论了大亚湾海洋生物体铅(Pb)的含量与变化特征。统计分析结果显示,大亚湾海域生物体Pb的含量服从正态分布,其平均值为(0.33±0.10)mg.kg-1。甲壳类Pb的含量明显高于头足类和鱼类。根据风险评估的4个步骤,确定Pb的毒性,描述了Pb对人体健康的不良影响,采用粗略的点评估方法计算了Pb的膳食暴露量,并简述了Pb的风险。结果表明,大亚湾海洋生物体Pb的膳食暴露量处于安全范围。

生物碱含量 第10篇

1 材料与方法

1.1 田间试验

田间试验设于贵州大学实验农场(26°25′26″N,106°40′25″E),该农场土壤母质为黄土性母质,属黄壤土,种植制度为烟草—冬小麦轮作,连续种植2年。本试验供试作物种类为烟草,其品种为云烟85,是贵州烟草的主要品种。试验开始时耕层(0 cm~20cm)土壤理化性质为:p H6.65、有机质21.946g/kg、全氮1.215 g/kg、全磷0.885 g/kg、全钾12.135g/kg、碱解氮85.806 mg/kg、速效磷12.613 mg/kg、速效钾156.322 mg/kg。

试验肥料为烟草专用肥、菌液和菌肥,其中烟草专用肥N、P2O5、K2O养分含量比例为10∶7∶21,其施用量按每公顷15000株施用纯氮105kg来计算;菌液由爱睦乐环保生物技术(南京)有限公司提供,施用时按1∶2000稀释;菌肥是经菌液发酵牛粪和秸秆15d后制成的,有效活菌数≥0.25亿个/g。

试验设7个处理:Ⅰ)不施肥;Ⅱ)烟草专用肥;Ⅲ)烟草专用肥+微生物菌液;Ⅳ)烟草专用肥+20%菌肥;Ⅴ)烟草专用肥+40%菌肥;Ⅵ)烟草专用肥+60%菌肥;Ⅶ)烟草专用肥+80%菌肥。具体施肥量见表1。所有肥料于移栽烟苗前6d(4月19日)一次性施入,生长过程中不再追肥。每个处理重复3次,随机区组排列,共21个小区,小区面积为30m2(6m×5m)。

1.2 土样采集与分析

试验于4月25日移苗。分别于烟草还苗期(5月2日)、伸根期(6月8日)、旺长期(7月10日)、成熟期(8月21日),采用五点法对称取样,用取土钻钻取根周围5 cm~10cm,深0 cm~20cm的土壤,剔除石砾和植物残根等杂物,混合制样,过2 mm筛后,捡去可见有机物,放入4℃冰箱内保存,用于测得土壤微生物数量和酶活性。另取部分土壤风干,过筛(100目和10目),用于测得土壤养分含量。

1.2.1 土壤养分含量测定

土壤碱解氮含量用扩散法,土壤速效磷含量用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法,土壤速效钾用NH4OAc浸提-火焰光度法。具体操作方法参见鲍士旦编《土壤农化分析》[8]。

1.2.2 土壤微生物数量测定

土壤微生物数量测定采用稀释平板法[9]。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基进行选择性培养并计数;真菌采用马丁氏培养基进行选择性培养并计数;放线菌采用高氏1号培养基进行选择性培养并计数。

1.2.3 土壤酶活性测定

土壤脲酶活性用苯酚-次氯酸钠比色法测定、磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定、过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定[10]。脲酶活性以24 h后每百克土NH3-N的毫克数表示;磷酸酶活性以24h后每克土壤中释放出酚的毫克数表示;过氧化氢酶活性以1h后每克土消耗0.1 mol/L高锰酸钾毫升数表示。每个土样重复测定3次。

1.3 数据处理和统计分析

数据为3次重复的平均数,以烘干土壤重量计。试验数据经Excel 2003整理后,采用SAS9.0进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 施肥对土壤养分含量的影响

2.1.1 施肥对土壤碱解氮含量的影响

从表2可以看出,在烟草不同的生长时期,不同的施肥处理对土壤中碱解氮的影响是有区别的。在整个生长周期中,处理Ⅰ的碱解氮含量呈下降的趋势,且始末两个时期相比较,含量差异极显著;其他处理组,在伸根期前,土壤中的碱解氮含量均增加,之后呈下降趋势。烟草在生长前期,对氮肥的需求量较大,如果土壤中可吸收的有效态氮量过少,会直接影响到烟草的产量和品质。我们可以清楚的看到,在生长前期,所有处理组不但满足了烟草对氮肥的需要量,而且还有一定量的积累,以备下一阶段吸收利用,这有助于烟草的正常生长。

另外,在还苗期,土壤中的碱解氮含量差异不显著,其差异不显著主要是因为氮素转换需要一定的时间。诚然,烟草在还苗期,需氮量相对来说较少,其量易得到满足;同时这也避免了由于缩二脲含量过高,导致烧苗的后果。从种植前后来看,碱解氮含量差异不是很明显,说明现有的施肥处理能够达到满足土壤养分收支平衡的目的。

2.1.2 施肥对土壤速效磷含量的影响

从表2可知,不同的施肥处理,对不同时期烟草的生长是有影响的。在整个烟草生长周期中,处理Ⅰ中速效磷含量有稍许的降低,但差异不显著;其他处理速效磷含量均呈上升的趋势,其中在伸根期和成熟期增长的幅度较旺长期大。从生长的始末期来看,还苗期所有处理的速效磷含量差异均不显著,而成熟期后,处理Ⅲ的含磷量相对较高,且较显著。这可以说明,处理Ⅲ在短时间内,在一定程度上能够促进土壤中闭蓄态磷向有效态磷的转化,从而有效地抑制了磷的老化。

2.1.3 施肥对土壤速效钾含量的影响

从表2可以看到,在烟草不同的生长时期,不同施肥处理对土壤速效钾含量是有影响的。从整个烟草生长时期来看,处理Ⅰ的土壤速效钾含量呈下降趋势,且处理内差异显著。这主要是由于烟草是喜钾作物,在生理周期中需要较多的有效态钾,否则不能够正常的生长。处理Ⅱ-Ⅶ的土壤中速效钾含量均呈上升的趋势,且处理Ⅶ、Ⅵ、Ⅲ组内差异显著。虽然烟草在生理过程中对钾的需要量大,但采收烟草后的速效钾含量较种植前的高,说明这种施肥处理不仅满足了当季烟草对钾肥的需要,而且还有部分残留在土壤中,增加了土壤中的养分含量,这对于培肥土壤是一项行之有效的措施。

(单位:mg/kg)

2.2 施肥对土壤细菌、真菌和放线菌数量的影响

2.2.1 施肥对土壤细菌数量的影响

从表3可以看出,对于烟草生长的不同生理时期,施肥处理对土壤细菌数量是有影响的。从总体上来看,在旺长期前,土壤中细菌的数量呈增长的趋势,且增长的幅度较大,在旺长期达到最大值。然而,烟草经历旺长期后,进入成熟期,土壤中细菌开始大量死亡,细菌数量急剧下降,达到烟草整个生长期的最低值。

在烟草的还苗期阶段,土壤中细菌数量差异不显著,而在旺长期差异是显著的,这主要是由不同施肥处理引起的。施用菌肥和菌液处理的细菌数量明显高于只施用烟草专用肥的处理,这说明施用一定的菌肥和菌液有利于增加土壤中细菌的数量。进一步将菌液与菌肥相比较,我们可以清楚的看到,施用菌液处理的细菌数量高于施用菌肥处理的。这说明在短期内,菌液更有利于促进土壤中细菌数量的增加。

2.2.2 施肥对土壤真菌数量的影响

从表3可知,烟草在不同的生长时期,施肥处理对土壤中真菌数量是有影响的。所有处理土壤中真菌数量变化趋势相近,具有良好的相似性。在烟草整个生理周期内,土壤真菌数在旺长期达到峰值,在成熟期处于最低谷。

在烟草的还苗期,土壤中真菌数量差异不是很明显,随着移栽时间的推移,土壤中真菌数量逐渐增加,旺长期的土壤真菌数量大概为还苗期的3倍。大量新生的真菌能够帮助分解土壤中的有机残体,形成一定量的腐殖质,有利于烟草的正常生长。在旺长期,所有处理土壤中真菌数量差异最明显。施肥处理的土壤真菌数量显著高于不施肥处理的;施用菌液和菌肥的处理土壤真菌数显著高于只施用烟草专用肥处理的;较施用菌肥处理相比,施用菌液处理的土壤真菌数量更高。

2.2.3 施肥对土壤放线菌数量的影响

从表3可以看出,在烟草不同的生长时期,不同的施肥处理对土壤中放线菌数量的影响是有区别的。从整体趋势上来看,所有处理变化规律一致,均呈先增加后减少的态势,在旺长期达到最大值,在成熟期跌至谷底。

在烟草的还苗期,所有处理的土壤放线菌量差异不是很明显。随着生长时间的增加,土壤中放线菌的数量也开始增加,到了旺长期土壤中放线菌数量差异较大,这是由于不同施肥处理所导致的。我们可以看到,施用有菌液和菌肥的处理放线菌数量显著高于不施肥和只施用烟草专用肥的数量。就施用含有菌液和菌肥的处理来比较,施用含有菌液处理的放线菌数量略高点,但是不显著。

2.3 土壤酶活性对施肥的响应

2.3.1 土壤脲酶活性对施肥的响应

从图1可以看出,在烟草生长的不同时期,施肥处理对土壤中脲酶活性的影响是不同的。从总体趋势上来看,所用处理变化趋势基本上一致。在旺长期前,土壤中的脲酶活性呈上升的趋势,在旺长期达到最大,之后有所降低。

在烟草生长整个生命过程中,施肥处理土壤中脲酶活性均显著高于不施肥处理的。说明施肥能够刺激脲酶活性的增强。就施用菌液、菌肥与只施用烟草专用肥进行比较,后者脲酶活性明显较低。进一步,将施用菌液和菌肥的处理进行比较。可以看出,施用菌液的处理,脲酶活性略优于施用菌肥的处理,这可能是因为菌液在当季更容易被吸收所造成的,至于以后土壤中脲酶的活性变化还有待于进一步监测分析。2.3.2土壤磷酸酶活性对施肥的响应从图2可知,对于烟草不同的生长时期,不同施肥处理对土壤中磷酸酶活性的影响是不同的。从还苗期到旺长期,所有处理的土壤磷酸酶活性呈上升的趋势,在旺长期达到最大值,在成熟期逐渐降低。

注:图中的不同字母表示同一时期处理间差异达到5%显著水平,下同。

在生长的初期阶段,各处理的磷酸酶活性差异不大,随着生长时间的增加,在成熟期差异逐渐显著。这可以说明,不同的施肥处理对土壤中磷酸酶的影响不是很大。诚然,这也与烟草生长过程中不需要大量的磷素有一定的关系。

2.3.3 土壤过氧化氢酶活性对施肥的响应

由图3可知,在烟草生长的不同时期,不同施肥处理对土壤中过氧化氢酶活性的影响是不同的。从整体上来看,所有处理的变化趋势基本上相近,从还苗期到旺长期,过氧化氢酶活性有所提高,进入成熟期,活性开始逐渐降低。

在生长的初始阶段,土壤中过氧化氢酶活性差异不大,进入旺长期后,差异变得显著。这主要是由不同的施肥处理带来的结果。施肥处理的过氧化氢酶活性高于不施肥的,说明肥料对增加过氧化氢酶有一定的促进作用。在生长的中后期,我们可以明显的看到,施用菌液处理的过氧化氢酶活性明显高于其他处理,表现出显著性。说明菌液在当季能够很好的刺激过氧化氢酶量的增加。至于后期效果,有待进一步监测分析。

2.4 土壤微生物数量、土壤酶活性与土壤养分间的相关性

2.4.1 土壤微生物数量与土壤养分间的相关性

在一定程度上,土壤微生物数量能够显示土壤中物质代谢的旺盛程度,是土壤物理化学特性的综合体现,也是土壤肥力的一个重要指标[11]。从表4可知,土壤微生物间的相关性程度相对密切,土壤细菌、真菌和放线菌3种微生物间呈极显著的正相关,其相关系数分别为0.893、0.905和0.949(p<0.01)。有文献报道,土壤真菌多为异养微生物,其在土壤中的主要作用是分解有机残体,能形成一定量的腐殖质[12]。但本试验土壤微生物与有机质的相关性差。之所以真菌与有机质相关性差,可能和种植烟草的土质本身所含有机物质不多有关系。土壤微生物与土壤中的碱解氮、速效磷和速效钾间有一定的相关性。这可以说明烟草根系在对养分吸收的同时,土壤微生物的数量也随之增大。因此用土壤微生物数量反应土壤养分浓度有一定的可行性。

注:*,**分别表示显著相关(p<0.05)和极显著相关(p<0.01),下同。

2.4.2 土壤酶活性与土壤养分间的相关性

土壤酶在土壤生态系统中起着非常重要的作用,它催化了土壤中一切生物化学反应,其活性大小是土壤肥力的重要标志[13,14]。土壤脲酶能够分解有机物,促进其水解生成氨,而氨是氮素营养的直接来源,因此其与土壤供氮能力有密切关系[5,15,16]。土壤磷酸酶可加速有机磷的脱磷速度,积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用[17]。过氧化氢酶是衡量土壤氧化过程的方向和强度的指标,其活性高低可以反映土壤解除呼吸过程中产生过氧化氢的能力[18]。

从表5可以看出,土壤酶活性间存在着一定的内在关系,磷酸酶与脲酶和过氧化氢酶间呈极显著正相关。脲酶与土壤养分均呈显著或极显著正相关;除有机质外,磷酸酶与土壤其他养分呈显著正相关关系;过氧化氢酶与有机质和速效磷呈极显著正相关。土壤酶活性的增强与土壤养分含量的提高间有着密切的联系,土壤酶对外界环境的变化更加的敏感,时效性更强,更能够及时的反应土壤现状。

3 结论与讨论

3.1 结论

本试验表明,不同施肥处理对土壤养分含量的影响是显著的,施肥能够明显的增加土壤养分含量。虽然各个处理对土壤各种养分含量的影响并不是很一致,从总体上来看,以施用烟草专用肥+菌液效果最为明显,烟草专用肥+80%菌肥次之。

不同施肥处理对土壤中微生物量的影响明显,在整个生命过程中,从还苗期到旺长期,微生物数量均在增加,在旺长期达到最大,之后迅速减少。微生物数量大小关系在旺长期尤其显著,表现为:烟草专用肥+菌液>烟草专用肥+80%菌肥>烟草专用肥+60%菌肥>烟草专用肥+40%菌肥>烟草专用肥+20%菌肥>烟草专用肥>不施肥。

土壤酶活性对不同的施肥处理响应程度有差异。从采样的时期来看,土壤酶活性在旺长期上升到峰值;就处理间来看,均表现出烟草专用肥+菌液这个处理的土壤酶活性最高;在成熟期,各处理均表现为烟草专用肥+菌液酶活性最高,烟草专用肥+80%菌肥次之。

不难发现,土壤微生物量和土壤酶活性相似性很大,均为烟草专用肥+菌液酶活性最高,烟草专用肥+80%菌肥次之。当然这是在短时间内的表现,随着时间的推移,会怎样变化,还有待进一步的研究。

3.2 讨论

本试验研究结果表明,施肥对土壤养分含量、土壤微生物数量和酶活性是有影响的。具体来讲,土壤养分含量对不同施肥处理的响应不同,施肥可提高土壤养分的含量,这与孙瑞娟等人的研究结果一致[19]。其中以烟草专用肥+菌液和烟草专用肥+80%菌肥处理的效果较好。就土壤养分来讲,虽然烟草对氮素需要量较大,但过多的氮素会影响烟草的烟碱含量,会降低烟草的品质,本试验施用的烟草专用肥+菌液和烟草专用肥+80%菌肥已经能够很好的满足其需要。土壤中速效磷和速效钾含量,较种植前稍微有所升高,但上升幅度不是很大,说明施用的菌液和菌肥对土壤中速效磷和速效钾含量的影响不大,可能是由于施用时间有限。

土壤微生物种类和数量对环境因子的变化和人为扰动的反应十分敏感,能够及时反应土壤的变化[20,21]。施肥处理对土壤微生物数量有一定的影响。所有处理的微生物数量变化趋势基本上相似,即从还苗期到旺长期数量增加,在旺长期达到峰值,之后急剧下降。在旺长期,大量的微生物的产生,有利于提高烟草对土壤养分的利用率[22]。在烟草生长末期,土壤中微生物数量急剧减少的原因,我们分析主要有两个:其一为进入成熟期后,烟草开始由营养生长向生殖生长过度,对养分的需要量有所减少,故而不再需要大量的微生物;其二是微生物本身数量多了,亦需要消耗大量的养分,群体竞争激烈,导致其量减少。

土壤酶活性对不同施肥处理有明显的响应,施肥可提高土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性,这与Zantua等[23]得到的结论一致。其中以烟草专用肥+菌液的效果最佳,表明该处理在促进微生物生长、提高土壤酶活性方面较好。不同施肥处理间土壤酶活性差异显著,这也表明土壤酶活性和施肥处理间有密切的相关性。就其土壤酶活性间来讲,土壤中脲酶、磷酸酶与过氧化氢酶活性间呈极显著的正相关。

就土壤养分与土壤微生物学特性来讲,显然土壤微生物学特性变化更为敏感,更能够及时的反应土壤肥力的变化趋势,具有更强的时效性,且土壤微生物学特性间共性更加的显著,这些都说明选用合适的土壤微生物学特性作为评价土壤肥力的指标比选用单一的土壤养分作为评价指标更加合理。由此可见,将土壤微生物学特性作为研究土壤肥力的评价指标是可行的,其对于建立烟草土壤微生物学特性评价体系具有重要的指导意义。

摘要：本文研究了施肥对烟田土壤养分含量和微生物数量及酶活性的动态变化的影响。试验结果表明:施肥对土壤养分含量有显著影响,施肥能显著增加土壤养分的含量,尤其以施用烟草专用肥+菌液最为显著。土壤微生物数量和酶活性对不同施肥处理响应是不同的,施肥能够显著增加土壤中微生物的数量、增强土壤酶的活性。将土壤养分与土壤微生物数量、酶活性进行回归分析可以发现,其间存在一定的相关性。与土壤养分相比,土壤微生物数量、酶活性变化更加敏感,其作为土壤肥力的评价指标更为合理。