PCR技术论文

PCR技术论文（精选12篇）

PCR技术论文 第1篇

试验依据Y染色体上的特异序列设计雄性特异性引物,选取Beta基因设计内标引物以避免扩增失败而造成误判。试验采用多重PCR技术对采集的样品进行性别鉴定,旨在建立一套简单、快速性别鉴定方法,现报道如下。

1 材料和方法

1. 1 试剂及仪器

TKM缓冲液 ( 10 mmol / L Tris - HCl,p H值为7. 6,10 mmol / L KCl,2 mmol / L EDTA,4 mmol / LMg Cl2) 、10% SDS、饱和Na Cl溶液、无水乙醇、70% 乙醇、TE缓冲液 ( 10 mmol/L Tris - HCl p H值为8,0. 1 mmol / L EDTA) ; 琼脂糖凝胶、TAE电泳缓冲液( 40 mmol/L Tris - acetate,1 mmol/L EDTA) 、离心机、水浴锅等。

1. 2 样品的获得

牛耳部样品来源于大庆养牛场( 取40个样本,20♀,20♂,样品只标样号,不标性别 ) 。

1. 3 基因组 DNA 的提取

分别从获取的样品剪取少量组织( 约1 mg) ,置于1. 5 mL的EP管中并剪碎,加入100μL TKM缓冲液。用200μL移液器将剪碎的组织充分分散后。再加入400μL TKM和37. 5μL 10% SDS,旋涡混匀。55℃孵育5 min。加200μL饱和Na Cl,旋涡混匀。12 000 r / min离心5 min。取上清液( 约500μL ) 加入新1. 5 mL EP管中 ( 预先加入900μL100% 乙醇) ,颠覆数次。12 000 r/min离心5 min。弃去上清液,加500μL 70% 乙醇轻轻转动后,吸去乙醇,倒置于滤纸上,置3 min,干燥。加100μL TE缓冲液,55℃置10 min,备用[1]。

1. 4 引物的设计

根据牛β基因序列和Y基因序列分别设计引物β - 1,2和Y - 1,2引物序列如下: Beefβ - 1,5' GGGACTCCAAGCTTCAATCA - 3'; Beefβ - 2,5' TGGAGGAGGAAGAAAAGAAC - 3'; Beef Y - 1,5' TGGGACTGGTGACAATTGTC - 3'; Beef Y - 2,5' GAGTACAGGTGTGCAGCTCT - 3'。

1. 5 多重 PCR 性别鉴定

50μL反应体系: 1μL DNA模板,2对引物各1μL,Mg Cl23μL,d NTP 4μL,10×PCR Buffer( Mg2 +free ) ,Taq酶0. 25μL,灭菌双蒸水补加至50μL。95℃预变性5 min; 95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环; 72℃延伸5 min。

1. 6 电泳

取PCR产物进行凝胶电泳检测,上样量为1μL,1. 5% 琼脂糖凝胶含0. 2μg / mL EB,1×TAE电泳缓冲液,100 V电压下,电泳20 min。用凝胶成像仪统检测、拍照结果。

2 结果与分析

2. 1 结果

多重PCR性别鉴定的结果见图1。

用所设计的β和SRY引物对9样品与已知性别的样品进行鉴定,雄性DNA样品可扩增300 bp的β基因和429 bp的SRY基因片段,而雌性DNA样品只能扩增300 bp的β基因片段。从PCR结果可知,4,6,8,9,11是雄性样品,5,7,10,12是雌性样品。另外共对已知性别的40个样品进行了PCR鉴定,正确率为100% 。验证了这2对引物在对牛的快速性别鉴定上是及其有效的。

2. 2 分析

从图1结果来看,选定的2对引物在所选用PCR条件下,在300 bp和429 bp处没有干扰带的出现,因此无背景干扰; 如果只用1对SRY引物进行鉴定,在一些样本中基因组DNA提取过程中可能会丢失,所以在单独使用一对特异性引物( SRY) 进行PCR反应时没有显示条带的不一定说明样品为雌性基因组DNA。而在使用2对引物同时进行PCR反应时,发现内参比带具有重要内部控制功能,内参比带可以确保基因组DNA是否有效提取。因而,选择Beta基因为内参比基因( 雌雄共有) ,因此有β和SRY 2条带的为雄性,仅有β1条带的为雌性,倘若1条带都没有说明基因组DNA提取过程中丢失,或没有取到目的细胞。

3 讨论

PCR能使极少的目的基因大量扩增,所以在实验操作过程中要避免交叉污染。多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增,因而,引物间的配对、引物间的竞争性扩增等均影响多重PCR的扩增效果,但如能调整反应的循环参数( 包括退火温度、退火及延伸时间等) 、PCR缓冲液成分、d NTP用量、引物的量及模板的量等,选择适宜的反应体系和反应条件,可极大地提高多重PCR扩增效果[2]。此外,DNA的抽提质量也是影响多重PCR扩增效率的一个重要方面,如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果。

摘要：为了建立一套简单、快速鉴定性别的方法,试验根据牛的Beta基因及SRY基因,设计2对引物(β-1,2和SRY-1,2),对牛96个牛肉DNA样本进行PCR性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了300 bp和429 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出300 bp 1条片段。40个牛血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雄性、雌性准确率均为100%。

关键词：多重PCR,快速鉴定,性别,基因,牛

参考文献

[1]JEAN F L,BRIAN O.BENOIT G A,et al.Quick sex determination of mouse fetuses[J].J Neurosci Meth,2000,95(2):127-132.

实时荧光定量PCR技术及其应用 第2篇

实时荧光定量PCR技术及其应用

实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术,该文简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用.

作 者：欧阳松应 杨冬 欧阳红生 马鹤雯 作者单位：解放军军需大学军事兽医系,长春,130062刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：24(1)分类号：Q52关键词：实时荧光定量PCR 基因 荧光探针 SYBR Green

PCR技术在动物检疫中的新应用 第3篇

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术自1985年建立以来，经过了20余年的发展，应用日益广泛，体现了其强大的生命力。对病原体核酸的扩增被广泛应用于动物病原体的检测中。并在动物检疫中发挥着越来越大的作用。

PCR作为现代分子生物学的核心技术，在科学研究和临床诊断中都发挥了巨大的作用。这项技术经过不断的开发和改进，已经应用到动物检疫领域的各个环节。给我们的工作带来极大的便利。在PCR技术基础上衍生出很多新技术，在动物检疫中逐渐被采用的PCR技术主要有多重PCR和荧光PCR技术。

1多重PCR技术

多重PCR最先被用于疾病的诊断是1988年Chamber-lain将其应用于人的杜氏肌营养不良(DMD)基因外显子的检测。随后，在人医上被广泛应用于各种疾病的诊断。1993年，WirzB将其用于猪瘟病毒和其他瘟病毒属的鉴别诊断，从而拉开了在兽医诊断领域应用多重PCR的序幕。随后该技术不断的被报道用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。

1.1方法的特点

多重PCR是在常规PCR的基础上发展而来的。因此，其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。理论上讲，引物条数可以不加限制，但是实际操作中，由于随着引物条数的增加，引物之间的相互作用变得更为复杂，二聚体和错配的几率大大增加，优化各种条件变得更为困难，从而影响引物的扩增效果。虽然目前已有同时用9对引物扩增出相应目标片段的报道，但是实际工作中通常以使用引物不超过5对为好。在把单重PCR合并成多重PCR之前要进行不同扩增子之间引物的分析，条件进一步优化。

1.2方法的应用

多重PCR在动物中使用相当普遍，主要用于病原体强弱毒株的区分、鉴别诊断和分型鉴定等。

1.2.1毒力强弱分析新城疫是家禽的一种烈性传染病。但有时却表现出慢性疾病的特点，无典型的临床症状。因而需要一种不仅能够诊断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR扩增结合序列分析的方法上，虽然也不失为鉴别诊断新城疫的准确可靠的方法，但测序比较烦琐，成本也较高，难以进行大批量操作。20世纪80年代末到90年代初。新城疫基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。通过对大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株FO裂解位点的序列差异设计合成了3对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录一聚合酶链式反应，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。

1.2.2鉴别诊断鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡新城疫(ND)是严重危害鸡群的4种主要呼吸道传染病。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，曾给养鸡业造成沉痛的打击和巨大的经济损失。由于这些病原引起鸡表现相似的临床症状和病理剖解变化，用传统的临床诊断方法难以区别，并且这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时。根据4种传染病的各自保守序列设计4重PCR，由扩增后得到的特异性片段的大小来诊断是哪种疾病引起。

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、典型猪瘟病毒(CS，FV)、圆环病毒(PCV)、细小病毒(PPV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的常见病原，在临床上常呈混合感染。多重PCR技术用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的诊断能同时检测5种病毒的感染。

1.2.3动物病原体的分型鉴定 猪链球菌分为35个荚膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型从发病猪和死猪体内最常分离到的血清型。其中以2型致病性和毒力最强，其他血清型有的毒力偏弱、危害较少。有的甚至在临床上并不导致疾病。因此，在实践中。需要将2型猪链球菌与其他型分开。2型和1/2型猪链球菌的毒力基因cps基因中有几段是其他血清型猪链球菌没有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同时检测这些独有基因和共有基因的多重PCR就可以将2型、1/2型猪链球菌与其他型分开。

流感病毒的基因组极易发生变异，其中以编码血凝素(HA)的基因的突变率最高，其次为神经氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16种HA和10种NA，不同的HA和NA之间可能发生不同形式的随机组合，从而构成许许多多不同亚型。据报道，现已发现的流感病毒亚型至少有80多种，其中绝大多数属非致病性或低致病性，高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株，特别是H5亚型禽流感病毒可以导致人的死亡，具有重要的公共安全意义。鉴别诊断H5与其他亚型的多重PCR技术已经在动物检疫中广泛使用。

2荧光PCR技术

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosys-terns公司推出，可以分为探针法和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为准确。荧光PCR把PCR的灵敏度和特异性大大提高，灵敏度接近检测方法的极限，荧光探针增加了检测的特异性。

2.1 荧光PCR技术特点

第一是实现了实时检测。能在反应结束后得到PCR扩增动力学曲线。从而很直观地反映整个PCR过程的动态变化。检测点以Ct值为标准，当荧光信号达到Ct值时，PCR反应体系内各种成分均处于最佳饱和状态。受各种干扰因素的影响最少，最能反应体系中模板的起始含量。第二是具有良好的稳定性和重复性，Gerard报道用荧光定量PCR方法，重复40次反应。其Ct值的变异系数为1，6％。如使用电泳后凝胶扫描定量。其变异系数高达31％，两者相差19倍多。第三是用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，因为荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度。第四是在荧光定量PCR过程中，除加样一次开盖外，其余过程在闭管情况下进行，反应结束后在电脑上显示，不需要后期的凝胶电泳，有效杜绝了产物污染造成的假阳性问题，同时避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。第五是操作简单、快速，工作效率高。整个过程由电脑控制，从加样到结果出来只需要2h左右，内置9600型PCR扩增仪，可同步完成96个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的

检测处理，有利于操作规程的标准化。

荧光PCR也可以设计多重，即多重荧光PCR，通过不同的探针标记不同的发光集团实行荧光分类从而实行多重检测的目的。目前，市面上流行的荧光PCR仪中，ABI公司的7500最多可以检测5个通道的荧光，也就是说最多可以进行5重荧光PCR检测。

2.2荧光PCR的应用

荧光PCR由于具备更多的优势，因此在动物检疫中受到更多的青睐。除了需要对PCR产物进行下游处理的试验外，几乎所有PCR进行的工作都可以由荧光PCR来完成。进出口检验中对方法的灵敏度要求很高，要求有微量的病原体就能够检出，荧光PCR正好可以发挥它的优势。

2.2.1 动物病毒检测 荧光定量PCR技术在动物病毒性疾病的诊断及定量检测中已经被广大临床诊断实验室所接受，现在国内外已经有很多实验室都建立了快速检测病毒的方法，病毒分离结果一致。英国科学家Schweiger报道应用荧光PCR对咽喉拭子等呼吸道标本中禽流感病毒进行型别、亚型鉴定，结果表明敏感性高于常规的病毒分离、培养方法。深圳四基生物工程公司与北京出入境检验检疫局研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒。基于该技术的检测试剂在全国各个出入境检测实验室得到了广泛使用，为有效控制禽流感疫情在国际间的传播起到显著的作用。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。患病动物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。FMD的暴发和流行除了对畜牧业生产造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品供应也造成很大的影响，故各国对FMD的检验检疫非常严格。FMD检测可以通过病毒分离、补体结合实验(CFF)、病毒中和实验(VNT)和动物接种实验等方法。然而，这些方法费时费力。特异性和灵敏度也无法满足需要。急需一种快速、准确的检测技术。在我们国家，检验检疫系统中首先建立了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测技术，之后形成检验检疫行业标准，成为进出口动物及动物产品的重要检疫规范。

此外，荧光PCR新城疫病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法已经建立。部分口岸实验室也在应用。

2.2.2动物细菌病检测 2005年6月，四川省资阳、内江相继暴发猪链球菌病，截止到8月20日，累计报告人感染猪链球菌病病例204例。死亡38例。这些事件不但造成了人员伤亡，而且引发了全国性的食品安全恐慌，造成巨大的经济损失。全国多个动物检疫实验室建立了荧光PCR检测2型猪链球菌的检测技术，其中珠海出入境检验检疫局建立的多重荧光PCR检测技术同时检测2型猪链球菌的荚膜多糖基因cps2I和溶菌素释放蛋白基因MRP，对于控制疫情、减少扩散起到积极作用。

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人兽共患病，炭疽芽孢杆菌可通过消化道、呼吸道及皮肤接触感染人和动物，具有高度致病性，特定条件下炭疽芽孢杆菌可以形成芽孢，抵抗力强，在外界环境中可存活数十年。2002年美国出现的炭疽生物恐怖事件更是给人们敲响了警钟，快速准确的检测技术对于炭疽的监测和控制具有重大意义。张玲建立了SYBR GREEN I染料法荧光PCR技术，实现了炭疽杆菌的快速检测。2005年陈苏红等针对炭疽杆菌的pX01和pX02质粒建立了Taqman探针荧光PCR检测技术，使检测的特异性和灵敏度大大提高。根据实验数据，他们的研究都取得了不错的效果，有望在实践中，特别是进出口检验中发挥越来越大的作用。

另外，大肠杆菌0157、霍乱沙门氏菌也都建立了相应的荧光PCR检测技术，对保障进出口动物健康和食品安全具有重要作用。

3小结

PCR技术在食品检验中的应用 第4篇

1 常规PCR检测

常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、d NTP、适当缓冲液和Mg Cl2溶液的反应混合物中, 在热稳定DNA聚合酶的催化下, 对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火 (复性) 、延伸等三步反应为一个周期, 循环进行, 使目标DNA片段得以扩增。其三个基本反应步骤为: (1) 模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离, 使之成为单链, 以便它与引物结合, 为下轮反应做准备; (2) 模板DNA与引物的退火 (复性) 模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; (3) 引物的延伸DNA模板———引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下, 以d NTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这就完成了一个PCR循环, 新合成的链都可作为下一次反应的模板, 因此扩增产物的量是以指数级方式增加[5,6,7]。

2 多重PCR

多重PCR是PCR技术的一种, 是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物, 同时扩增多个目的基因或DNA序列。首先将双链DNA热变性成单链DNA, 然后, 人工合成的引物与单链DNA靶序列结合, 在4种碱基d NTPs底物存在下, 在DNA聚合酶作用下, 引物沿着DNA单链从5′末端到3′末端方向延伸, 合成新的双链。新合成的双链又作为模板, 重复上面的聚合酶反应, 合成新的DNA双链, 经过20~35个循环扩增出大量拷贝。

2.1 多重PCR的特点。

高效性;系统性;经济简便性。

2.2 多重PCR在食品微生物检测中应用。

(1) 多重PCR在食品病原微生物检测中的应用。食品污染的病原菌主要包括肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、耐药球菌等, 在检测这些微生物过程中, 很容易受到其它微生物和本身变异株的干扰, 造成假阳性和准确率不高的现象。目前, 越来越多的研究使用多重PCR检测这些病原菌。 (2) 多重PCR在食品非致病菌检测中的应用。乳酸菌 (LAB) 是真空环境下的主要微生物, 真空食品包装中的乳酸菌含量一般很低, 但它可以在储藏过程中繁殖。采用多重PCR方法检测真空包装中的微生物对检测食品腐败有重要意义。 (3) 多重PCR技术在食品微生物检测中存在的问题。多重PCR在食品微生物的检测中可能存在多对引物之间的相互抑制, 引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增。因此, 在多重PCR的应用中, 如何合理设计引物, 优化最佳多重PCR体系及反应条件可以减少非特异性扩增、假阴性、假阳性结果。

2.3 RT-PCR。

逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 的原理是提取组织或细胞中的总RNA, 以其中的m RNA作为模板, 采用Oligo (d T) 或随机引物利用逆转录酶反转录成c DNA。再以c DNA为模板进行PCR扩增, 而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级, 使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

2.4 巢式PCR。

巢式PCR (nesting PCR) 是指先后用两套引物进行扩增的PCR技术, 用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第一套引物扩增15~30个循环, 再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增15~30个循环。

2.5 免疫-PCR。

免疫-PCR由Sano等首创, 是指用DNA分子作为标记物, 在做一般的免疫反应的同时进行PCR扩增和电泳分析的免疫试验。在免疫-PCR中, 多用生物素作为连接分子。生物素具有两个独立的结合位点, 一个可与DNA分子结合, 另一个能与抗原2抗体复合物上的亲和素结合, 由此将DNA分子和抗原-抗体复合物专一性地连接在一起, 形成抗原-抗体-亲和素-生物素-DNA复合物, 然后加入PCR扩增系统, 标记的DNA便可。

2.6 荧光定量PCR。

实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术 (FRET) 应用于常规多聚酶链式反应仪中, 通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用, 能量从供体发色团转移到受体发色团, 受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比, 检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度, 从而达到定量目的。

2.7 热起动PCR。

热起动PCR指的是使Taq DNA聚合酶只在样品温度超过至少70℃时才发挥作用的PCR。热起动可减少非靶序列的扩增, 从而提高反应的特异性。热起动的基本方法是在进行PCR反应之初, 将Taq DNA聚合酶、氯化镁和引物这些DNA合成所必需的关键性试剂先不要加入样品管内;而将样品管加热, 待温度上升至70℃以上时。再将上述试剂加入, 开始PCR反应。

3 结论

食品安全受到人们的广泛关注。食品在生产、包装、运输、销售等环节都会受到微生物得感染, 对微生物的检测是食品安全检测中的一个中要组成部分, PCR技术的广泛使用可以很好的对微生物进行检测, 解决人们的食品安全问题。而PCR技术也随着近几年技术的不断进步, 不断进行了改进, PCR技术都在食品检验中发挥了重要作用。

参考文献

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[6]刘辉, YANGLi-ping, 张滨等.PCR及其改进技术在食品检测中的应用[J].食品与机械, 2008, 24 (4) :166-169.

PCR技术论文 第5篇

摘要：PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，该技术已经广泛地应用于水产、微生物检测、临床微生物、基因表达、肿瘤免疫、微小残留病变的检测，DNA拷贝数的测量、基因组变异和多态性等许多方面。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。关键词：PCR技术；分类；研究现状；应用； Research and Application Status of PCR Technology Class 1 Bio-engineering 10

Student: Lao Yangyan

Student ID: 1031250019

Tutor: Wei Dongmei Abstract: PCR is an in vitro enzymatic synthesis，amplification of specific DNA fragment.Because of its high-strength specificity and sensitivity，detection speed and good accuracy，it has been widely applied in many fields such as the aquatic，microbial detection，clinical microbiology，gene expression，tumor immunology，detect ion of minimal residual lesion，measurement of DNA copy number，genome mutation，polymorphism and so on.This article summarize 4 kinds of PCR technology，with its application status is analysed.Keywords: PCR technology；Category；Progress research；Application 引言

聚合酶链反应(PCR)技术问世20多年以来, 已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断的完善, 不仅广泛应用在基础研究领域, 在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。1985年，美国Karray等学者首创了PCR 技术，并且由美国Cetus 公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR 技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2]。随着PCR 技术的不断发展，在常规PCR 技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、单分子PCR 技术、变性梯度凝胶电泳技术。目前应用最多的为荧光定量。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。并对PCR的前景进行了展望，让其更好的服务于人们的生活。PCR技术原理

PCR 技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列（模板）在酶促作用下进行扩增。PCR 的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[3]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00 ~200万倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。PCR技术的分类

在传统PCR 技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR 技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。2.1 实时荧光定量PCR技术 1996 年，学者经过研究，在传统PCR 技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR 技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR 技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR 技术研究史上从定性到定量的飞跃[4]。荧光定量PCR 技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR 反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[5]。实时监测这一特点是常规PCR 技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR 技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR 技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[6]。一个PCR 循环反应结束之后，定量PCR 仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[7]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR 产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[8]。2.2 多重PCR 技术 多重PCR（mutiplex PCR）技术是PCR 技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR 管内的多个模板反应，在一个PCR 管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[9]。在同一反应体系中，多重PCR 技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR 的扩增效果[10]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR 缓冲液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR 扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR 扩增效果[11]。2.3 单分子PCR 技术（SM-PCR）

单分子PCR 技术是在传统PCR 技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[12]。单分子PCR 技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC 的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[13]。由于单分子PCR 技术反应的变性温度（96~98 ℃）大多比常规PCR 技术（94 ℃）略高，因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间（5~15 s）、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。2.4 变性梯度凝胶电泳PCR技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)PCR-DGGE 技术是基于核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列分开的一种技术方法[14]。在进行变性梯度凝胶电泳时，序列不同的DNA片段因为碱基组成和排列的差异，在聚丙烯酰胺凝胶中解链时需要不同的变性剂浓度，并会发生空间构型的变化，最终导致电泳迁移率的差异。将通过PCR扩增之后得到的等长双链DNA分子，在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，电泳迁移率的差异会使不同序列的DNA片段停留在凝胶的不同位置，从而形成相互分开的条带图谱[15]。从理论上讲, 只要选择的电泳条件足够精细, 就可以分开仅有1个碱基差异的DNA片段[ 16]。PCR技术的应用

3.1 PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR 技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK 以及PEPCK表达量的影响[17]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据[18]。孙淑娜等研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b 及HAS2 的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR 技术，检测了P450aromA和P450aromB 在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，除了具有常规PCR的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观。

多重PCR技术是通过对普通PCR技术的改进而建立起来的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。与常规的PCR相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测。

PCR-DGGE技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。近些年来，此技术在食品中检测微生物后应用也有报道。3.3 PCR技术在临床微生物中的应用

许多传染病的特点是具有高度的变异率，这会严重影响对致病菌的评估，分子信标可以用于病原菌的定量。它的优点是: 一个没有荧光的淬灭物可以用于4个不同的荧光染料，这样就可以同时检测和定量4个样本。在许多应用领域需要同时对多个核酸进行定量，这将大大降低检测的花费和所需的时间。这个方法的另一个好处在于加样的误差被最小化了，而且所有核酸都是在相同的条件下同时扩增，这样它所获得的数据就更加精确可靠。当然，多通道检测比单通道检测更为复杂也需要解决可能出现的更多问题。广东省花都市人民医院、中山医科大学基因诊断中心采用荧光定量PCR 检测技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒等5个项目进行了定量测定，结果表明定量PCR方法可靠性和重复性好，且操作简便、快速，结果判断客观。除此以外，目前已有用此方法对人类免疫缺陷病毒，肝炎病毒，结核杆菌，巨细胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原体进行检测的报道。

3.4 PCR技术在畜牧兽医领域的应用

家育DNA多态性研究是近年来兴起的分子水平遗传标记选择技术, 对于开展品种问遗传差异程度、种群间亲缘关系、个体问遗传相似性, 亲子鉴定等方面的工作, 对于开展数量性状的间接选择, 早期选择, 提高数量性状选择效率等研究均具有重要的意义和潜在的应用价值。PCR技术的出现大大推动了上述研究的进程。以PCR技术为基础的DNA多态性分析和检测技术, 如PCR-RFLP(限制性长度多态性), PCR-SSCP(多聚酶链反应产物的单链构象多态性)和AFLP(扩增片断长度多态性)等, 已经在猪DNA多态性研究中得到了应用, 并且有可能迅速推广到育种实践中去。

3.5 PCR技术在转基因食品检测中的应用

转基因食品，是利用基因工程技术将有利的基因转移到微生物,，植物或动物细胞内，使他们获得有利的特性，再由这些转基因物种生产或处理获得的食品及添加剂。由此可增加食品的种类，提高产量，改进营养成分的构成，延长货架期等，目前，转基因作物及其产品的安全性问题越来越引起消费者的重视[25]。为了保护人类的健康，世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求，对食品中的GMOs存在与否进行标示。因此，对食品中的GMOs 进行监测，建立安全性检验的技术与方法，成为管理和审批工作的重要基础。在众多的监测方法中，PCR 是最常用以及最适用的监测转基因食品的方法。PCR 方法中，常用的几个特定序列分为三类：

1、调控序列：他们调节转入植物的基因的表达。由于大多数转基因食品的基因都含有CaMV 35S 启动子和NOS 终止子，因此，在检测食品中是否含有GMOs 时，可以直接检测CaMV 35S 启动子和/或NOS 终止子的存在与否，如果存在，即可说明其中存在GMOs。

2、标记序列，用于帮助在遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞，组织和再生植株，一般是抗生素抗性基因。

3、目的基因，即转入的基因，如抗虫、抗除草剂基因。用PCR 方法鉴定植株中检出的目的基因，标记基因，报告基因，35S，NOS 等外源基因片段，为转基因食品的筛选鉴定及为安全性评价提供敏感直接的数据，成为转基因食品安全性检验中一项重要的技术手段。PCR技术的应用前景展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用；多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中将具有重要作用。未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面。

PCR技术论文 第6篇

关键词：反向PCR；巢式PCR；降落PCR；奥尼罗非鱼；MSTN基因；3′侧翼序列

中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0028-03

收稿日期：2013-07-05

基金项目：浙江省自然科学基金 （编号：Y3110432、Y3090561）；浙江省钱江人才计划（编号：2012R10076 ）；浙江省公益性技术应用研究计划（编号：2011C37078）；浙江省重点创新团队项目（编号：2012R10026-05）。

作者简介：李景芬（1977—），女，浙江湖州人，博士，主要从事分子生物学方面的研究。E-mail：lijingfen@hutc.zj.cn。奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）为奥利亚罗非鱼父本同尼罗罗非鱼母本杂交获得的良种，雄性率高，生长速度快，群体产量高，且抗病力强。因其肉白、富弹性、刺少而被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织向世界各国推荐养殖的优良水产品之一，也是全球旺销的水产品之一[1]。肌肉生长抑制素（MSTN，简称抑肌素）基因是转录生长因子β（TGF-β）家族的一个成员，最先在小鼠中发现[2]，并且已有研究证明该基因是哺乳动物骨骼肌生长发育的负调控因子。有研究表明，该基因的功能在鱼与哺乳动物上一致，即均可抑制骨骼肌生长，如转基因斑马鱼因MSTN被抑制而使肌纤维数量明显增加[3]；通过RNA干扰沉默MSTN基因的斑马鱼表现出体型巨大化[4]；MSTN基因显性失活形式的过表达导致转基因青鳉的肌纤维数量在成年后加倍[5]；青鳉MSTN基因的缺失，在幼鱼后期到成鱼初期表现为肌纤维数量的增加，随后出现肌纤维的肥大，呈现“双肌”表型[6]。因此，笔者选择反向、巢式、降落3种PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼序列，以有效获得这一未知序列，完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆，从而为研究奥尼罗非鱼MSTN基因功能和分子育种奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试的奥尼罗非鱼由浙江省淡水水产研究所提供。限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、HindⅢ，T4 DNA连接酶，rTaq DNA 聚合酶，dNTP，DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、大肠杆菌DH5α及质粒载体pMD19-T vector均购自TaKaRa 公司。AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep 质粒小量制备试剂盒、AxyPrep PCR Clean-up kit 均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。此外，还有EDTA、苯酚、三氯甲烷、异戊醇等。

1.2试验方法

1.2.1DNA的提取采用经典的苯酚-三氯甲烷法提取鱼血DNA。2.0 μL DNA 样品进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，再结合紫外分光光度计法检测所提取的DNA 的重量和浓度。

1.2.2DNA的酶切参照限制性内切酶说明书进行酶切试验，分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XbaⅠ 等6 种限制性内切酶对基因组DNA 进行酶切，酶切反应总体积为40 μL，37 ℃水浴酶切18 h。用电泳检测酶切效果，之后用AxyPrep PCR Clean-up kit 进行纯化，用20 μL ddH2O洗脱以去除限制性内切酶。

1.2.3酶切片段的连接与酶切片段的连接环化参照T4 DNA 连接酶说明书进行连接，反应体系为100 mL[包括 82 μL ddH2O、10 μL T4 DNA Ligase Buffer、6 μL 酶切产物（>50 ng/μL）和2 μL T4 DNA 连接酶]，16 ℃连接21 h，再用AxY PrepTM PCR Clean up kit 进行纯化，以10 μL ddH2O 洗脱，获得5个酶切库。

1.2.4引物设计与PCR 扩增已克隆到的奥尼罗非鱼MSTN基因序列设计引物，由上海英骏公司合成。反向、巢式PCR第1轮引物： 1S为5′-CTTCTTCCCTGTTGTCATCTCCCAGCAC-3′，1A为5′ -CTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGAC-3′；第2轮引物：2S为5′-TCGTACTGATCCAGAAGCTGCTGCA-3′，2A为5′-CCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAA-3′。引物1S和1A分别以各酶切库为模板进行第1轮反向、巢式、降落PCR，PCR体系 50 mL 包括10 PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/μL 1S 4 μL；10 pmol/μL 1A 4 μL、25 ng/μL 模板 2 μL、5 U/μL rTaq 0.4 μL、ddH2O 30.6 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性4 min；95 ℃ 变性30 s，73、71、69、67、65、63、61 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸3 min，每个退火温度均如此循环3次；95 ℃变性30 s；55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR结束后电泳。

对PCR产物进行30倍稀释，以稀释后的PCR产物为第2轮PCR的模版，PCR体系、程序同第1轮，只是引物为2S、2A，模版为4 μL，ddH2O 28.6 μL。PCR结束后电泳。

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1.2.5PCR产物克隆与测序用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR 扩增的目的片段。将纯化的DNA 片段与pMD-19T Vector连接，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR 法筛选重组子，摇匀，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取质粒，双酶切（BamHⅠ、HindⅢ）鉴定正确后送往上海英骏公司测序。

1.2.6序列分析采用DNAman 软件进行序列分析，与GenBank 数据库的相关序列进行核苷酸序列同源性比较。

2结果与分析

2.1奥尼罗非鱼MSTN基因3′侧翼序列的扩增与克隆

基因组DNA分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和XbaⅠ进行酶切，结果见图1。由图1可知，X泳道的基因组没切开，应舍弃；其余酶切较好，从上到下可看见弥散的条带，分别纯化后连接作为PCR的模板库。第1轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图2，未获得特异性的PCR条带。第2轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图3，从BglⅡ库中扩增到约1 450 bp的特异性条带，从NcoⅠ库中扩增出约 960 bp 的特异性目的条带，而从BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ库中均未扩增出特异性目的条带。将所获得的2条特异性目的条带进行克隆测序，将测序所获得的序列与已有的奥尼罗非鱼MSTN基因序列进行核苷酸序列比对，获得3′端1 376 bp 新序列。

2.2奥尼罗非鱼MSTN基因新获得序列分析

将所获得的新序列在网上进行在线Blast分析，该新序列与莫桑比克罗非鱼的MSTN基因序列相似度为99%，与点带石斑鱼和加州鲈的MSTN基因序列相似度为85%，与尼罗尖吻鲈的MSTN基因序列相似度为81%。目前已经得到了奥尼罗非鱼MSTN基因的全部序列，并已提交给GenBank，序列号为KC583258。

3结论与讨论

反向PCR技术是由Ochman等研究开发的[7-8]，主要用

于扩增与已知DNA序列相临的未知DNA序列。对含有已知序列及其相邻未知序列的基因组DNA样品用一种在已知序列中无酶切位点的限制性内切酶进行酶切，再用T4 DNA连接酶使酶切片段连接环化，之后以环化的DNA库为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物向夹在中间的未知序列部分进行扩增。该方法在很多研究中都有应用[7-12]，本研究利用该方法也成功得到了奥尼罗非鱼MSTN基因3′端 1 376 bp 的未知序列。

巢式PCR在医学检测和分子生物学方面研究应用较多[13-16]。该方法的原理是设计2对引物，第1次PCR采用能扩增较大片段的引物，扩增结束后，采用能扩增较小片段的引物，以第1次扩增的产物为模板进行第2次扩增，以增强扩增的特异性。本研究设计了2对引物，先用扩增较大片段的引物进行扩增，结果如图2所示，未扩增到单一的目的条带；再用扩增较小片段的引物以第1次扩增产物为模板进行第2次扩增，结果如图3所示，得到了非常单一、特异性的目的条带，达到了试验的目的。由此可见，巢式PCR能有效获得特异性目的片段。

降落PCR是一种多循环PCR，其原理是：随循环数增加，退火温度逐渐降低，当退火温度低于解链温度（Tm≈10 ℃）时，则固定于该退火温度进行扩增，从而达到最佳扩增效果[17-18]。起始退火温度可高于Tm（约为5 ℃），然后每个循环降低1～2 ℃或每几个循环降低1～2 ℃，直到退火温度低于Tm（约为10 ℃）。尽管退火温度最终降低到非特异性杂交的Tm，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩余循环中超过任何非特异性产物的扩增量。虽然降落 PCR 程序复杂，但能非常有效地降低或避免假阳性[19]，尤其对那些不了解的引物和目的模版匹配程度，比如在用简并引物进行扩增时，笔者就曾经利用降落PCR、简并引物顺利克隆了草鱼的PKR基因[20]。对于Tm 相近的PCR反应可在同一循环条件下进行，可大大提高工作效率[21]。对不确定退火温度基因的扩增而言，这是首选[22]。由此可见，降落PCR在基因克隆上有较强的优势，可用于普通PCR难以扩增的基因片段。反向PCR结合巢式PCR在低拷贝甚至是单拷贝基因的侧翼序列克隆时，可显示其较好的特异性和灵敏度[23]。本试验联合使用这3种PCR，有效获得了奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼这一未知序列，完成了奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆。

从本试验顺利成功的实施可以看出，反向、巢式、降落PCR相结合是扩增已知基因侧翼序列行之有效的方法。如只采用反向PCR（图2）不能获得目的条带，但结合巢式PCR就得到了特异性目的条带。但反向、巢式PCR相结合，用普通的PCR程序进行扩增，本研究没有扩增到到任何条带，而在此基础上采用降落PCR后扩增到了目的条带，说明3种PCR技术相结合可有效获得目的条带，提高效率。另外，该方法比较经济，避免了使用RACE法的高昂费用。笔者计算过该方法涉及到的试剂费用约需2 500元，而完成该试验每种试剂只用了一点点；而RACE法只1个10次的3′RACE试剂盒就2 000元左右。再者，该方法操作严格度低，虽然步骤繁琐，但都是在DNA上进行的，操作严格度相对宽松；而RACE法的对象是RNA，操作与DNA相比相对比较严格。由此可见，反向、巢式和降落PCR技术相结合是克隆已知基因旁侧序列经济、有效并可广泛使用的好方法，为科研工作者提供了克隆已知基因旁侧序列的新途径。

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PCR技术论文 第7篇

1数字PCR技术原理

PCR的原理,简单理解就是利用DNA(RNA同理)的半保留式复制,在不同温度下双链变性成为单链,按照碱基互补配对原则,利用聚合酶使目的核酸片段链式扩增,每次循环形成两倍数量的目的核酸分子,这样重复多个循环,目的核酸程指数增长,在几个小时之内获得百万个相同核酸分子,可以像“大海捞针”一样检测出样品中的阳性分子,但是这样的检测只能定性,无法定量分析。随后,人们探索出实时荧光定量的方法,通过在反应体系中加入荧光指示剂,每次循环检测荧光信号,设定荧光信号阈值(Ct值)及描绘标准曲线,间接地对PCR反应进行定量分析,这种方法很好地实现了定量分析,但受到序列含量、反应抑制等条件的影响,准确性有一定限制。

1999年,美国约翰霍普金斯大学的Kenneth Kinzler和Bert Vogelstein构建了一种新的PCR方法,他们将样品稀释并分散到多个384样品板中,设想每个孔中含有极少量的目标分子,或不含有目标分子,经过反应,阳性孔判定为“1”,阴性孔判定为“0”,即“有或无”,这种方法成为了数字PCR的雏形,但是实验工作量巨大,反应效果也不稳定。2003年,他们对这种方法进行了改进,使用乳化剂将样品分散成数万个小液滴,使用磁珠法辅助进行反应,最终得到了成功,早期的数字PRC方法主要局限在样品的分散难度较大,随着技术的发展,通过微滴式、芯片式等方法,可以很均匀地将反应液体分散成极微小的液滴,大部分液滴只可以含有一个目标核酸分子,或不含有目标核酸分子,然后通过荧光读数的方法, 就可以实现准确的定量分析。当然,反应体系中也会出现含有两个以上目标核酸分子的情形,这就需要在计算结果时使用概率统计的方式排除干扰,一般采用泊松分布原理进行计算。随后数字PCR开始商业化,市场上也出现了多种数字PCR仪,较成熟的有微滴式数字PCR仪和芯片式数字PCR仪。

2两种数字式PCR技术对比

微滴式d PCR将样品反应体系分散约数万个油包水液滴,这样每份样品可以盛放在独立的微孔板小孔中,每个样品板就可以同时进行多个样品的检测,芯片式d PCR将样品均匀地分布在芯片上的数万个微孔中,这样每个芯片就只能容纳一个样品。微滴式d PCR采用类似流式细胞仪的读数方式,每个油包水液滴依次通过荧光计数器来读数,读数后样品即消耗,而芯片式d PCR则可以整个芯片照相读数,读数后芯片可以保留。

3结语

与传统的PCR方法相比,数字PCR方法更加灵敏,可以在样品浓度较低时,发现目的片段,不需要依赖曲线和Ct值,将样品分散成数万个微滴,有或无进行数字化判定,定量分析更加准确,将样品分散成单独的微滴反应体系,也避免了其他物质的抑制效应,提高了实验的稳定性。可以预见,数字化PCR方法将会在动物疫病研究中发挥更广泛的作用。

参考文献

[1]Jeffrey M.Perkel,数字PCR革命[J].科学,2014.4.

[2]胡伟,等.微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量[J].法医学杂志,2014,10.

PCR技术论文 第8篇

关键词：PCR,简介,应用,畜禽,诊断

PCR一词, 我们可以在各种媒体上见到。PCR这个生物学上的专业术语, 已悄然走进百姓的生活中, 那么, 什么是PCR呢?

聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction) 即PCR技术, 是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法, 故又称为基因的体外扩增法。

1 PCR的历史

1983年春, Mullis孕育了PCR的原型。此后不久, 即1983年8月, Mullis第一次在他所从事研究的Cetus公司正式作了一个有关PCR原理的学术报告, 但并未引起重视。

Mullis于1985年首次在《自然》上发表有关PCR的论文, 这使更多的人认识了解PCR。在1986年5月, Mullis应邀参加了“人类分子生物学”专题讨论会, 在会上Mullis作了关于PCR的报告, 引起与会者强烈的反响, PCR终于被全世界科学家所重视。

在1986年6月有关PCR的主要专利被批准, 有关PCR的第一个试剂 (Taq聚合酶) 和自动PCR仪在1988年相继上市。1989年12月《科学》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。而1993年, 霍拉公司以3亿美元购买了Cetus的PCR技术。1993年Mullis因发明PCR技术获诺贝尔化学奖。

2 PCR的原理

PCR技术快速敏感, 简单易行, 其原理与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。PCR的反应如下:在微量离心管中, 加入适量的缓冲溶液, 微量的模版DNA, 人工合成的两个DNA引物, 四种脱氧单核苷酸, 一种耐热的多聚酶和Mg2+。将上述溶液加热, 双链DNA分子在临近沸点的温度下 (92~96℃) 加热时便会使双链DNA变性成两条单链的DNA分子;然后降低反应温度, 使两条引物在低温 (40~60℃) 和DNA聚合酶作用下, 分别与两条模板互补退火, 形成局部双链;再升高反应温度至中温 (70~72℃) , 此时DNA聚合酶以反应混合物中的四种脱氧单核苷酸为底物, 以两引物为复制起点, 在引物的引导下从引物的3'端开始合成与模版互补的新的DNA子链。

PCR的第一个特点, 是新合成的DNA链能够指导特定DNA序列的合成。PCR技术的第二个特点, 即特定的DNA区段得到了迅速大量的扩增, 这也是PCR反应的最后结果。实际中, 只要加入试剂并控制三步反应的温度和时间, 即可获得扩增效率惊人的产物。扩增的公式为:Nf=NO (1+Y) n, 式中:Nf表示n个扩增循环之后扩增序列的拷贝数;NO表示DNA模版中靶序列的起始拷贝数;Y表示每个循环的扩增效率。

PCR反应涉及多次重复进行的温度循环周期, 而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及中温延伸三个步骤组成。鉴于目前PCR技术已经获得了极其广泛的应用、测试的样品来源多种多样、所用的寡核苷酸引物长短不一等诸多因素, 因此要给出一个“标准”的温度循环参数, 是十分困难的。研究者要根据自己的实验材料和研究目的, 通过具体操作才能得出符合要求的、比较理想的温度循环参数。一般高温变性的温度是92~96℃, 时间是30s到1min;低温复性的温度是40~60℃, 时间是30s到1min;中温延伸的温度是70~72℃, 时间是30s到2min。

3 反应中几种组分的分析

3.1 模板

3.1.1 模板的来源

可来自生物体的各种新鲜或陈旧的组织, 如血液、精液、肌肉、毛发、粪便等也可来自细菌病毒标本, 还可通过人工合成, 质粒克隆, 以及m RNA反转录得到。

3.1.2 模板

DNA区域两端的16~24bp的序列必须是已知的, 由此才能合成两种引物, 并靠它们在待扩增DNA区域上的准确定位来实现扩增反应的特异性。

3.1.3 模板的类型单链、双链DNA及通过反转录得到的c DNA都可作为PCR反应的模板。

3.1.4 模板的用量

具体情况依DNA性质而定, 如对于质粒克隆的DNA, 一般用纳克量, 对于染色体DNA, 一般用微克量。

3.1.5 模板的纯度

一般对纯度要求不高。只要没有DNA交叉污染, 一定量的蛋白蛋或者有机物对实验影响不大。但在模板溶液中不能有影响扩增反应的物质存在, 如蛋白酶、核酸酶, 结合DNA的蛋白质、尿素、SDS、叶啉类物质、二价金属络合物 (如EDTA) 等。

3.1.6 两步PCR

对于相对较短的DNA片段 (100~200bp) , 可将退火、延伸温度合并为一个温度, 采用二温式两步PCR (94℃变性1min, 65~68℃退火延伸1min) 能产生与三步PCR同样多的产物。这可能是由于反应混合物在变性温度和退火温度 (94~50℃) 之间过渡时, 以达到了聚合酶的最佳反应温度 (70~75℃) , 在这么短的时间内与模版退火结合的引物已经充分延伸形成产物片段。这样既保证引物与模版结合的特异性, 又可使引物顺利延伸。与标准PCR相比, 二温式两步PCR操作更简便、快速, 特别适合于临床检验。

3.2 引物

两个寡聚核甘酸引物的设计是PCR的关键, 一般说来, 对目标DNA序列的信息知道得越多越有利于设计理想的引物。同时, 还要充分利用因特网信息及基因库的序列, 运用oligo, primer等许多软件包都能帮助更好地设计引物。

设计的总体原则是提高扩增的效率和特异性, 要求:

(1) 引物序列应位于基因组DNA的高度保守区, 且与非扩增区无同源序列。

(2) 引物的长度以15~30bp为宜, 过短或过长均可使反应的特异性下降, 同时引物过长还会增加成本。 (3) 引物的碱基应尽可能随机分布, 避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列, G+C碱基的含量在40%~75%之间。

(4) 引物序列的独特性。为了扩增出单一的、特异性的DNA片段, 所设计的引物序列不能在模板DNA序列中重复出现, 即引物序列的独特性或唯一性, 因此在设计时采用计算机辅助检索。

(5) 引物内部应避免形成二级结构, 特别是引物的末端应无回文结构。

(6) 一对引物的3'末端序列不能有明显的互补性, 以免形成引物二聚体, 导致PCR产量下降, 且引起引物比例失去平衡, 导致非特异性DNA的合成。 (7) 引物的内部稳定性, 在5'末端稳定而其3'末端不稳定的引物是进行PCR合成的好引物, 这样的引物结构可有效地排除DNA合成的错误起始。

(8) 引物5'末端碱基无严格限制, 在与模版结合的引物长度足够的条件下, 其5'端碱基可不与模版DNA互补而呈游离状态。

(9) 引物3'端的头1~2个碱基会影响DNA聚合酶的延伸效率, 从而影响PCR反应的扩增效率及特异性, 因此3'末端碱基最好选T、C、G而不选A。

(10) 引物3'端应为保守氨基酸序列, 即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp, 且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3'末端。

3.3 DN A聚合酶

DNA聚合酶在PCR反应中起着关键的作用, 因此DNA聚合酶的选择是至关重要的。下面介绍一下DNA聚合酶。

3.3.1 大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段

在早期进行的PCR反应中, 使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。这种酶是热敏感的, 由于这种酶来自大肠杆菌体内, 最适的生活环境为37℃。所以其在DNA变性的温度下会也发生变性, 故在每一循环中, 需重新加人, 这不但极不经济和花费时间, 而且随着DNA聚合酶的多次加入反应体系的黏度越来越大, 最终导致扩增反应无法持续。而且该酶的退火温度偏低 (37℃) , 易形成引物与模板的非专一性配对, 产生非特异性扩增。

3.3.2 Taq DNA聚合酶

1986年H.A.Erlich从一种生活在温度高达75℃的热泉中的细菌, 即水生栖热菌Thermus aquaticus中分离出Taq DNA聚合酶, 1988年R.K.Saiki等人成功将其用于PCR, 该酶具有良好的热稳定性, 在95℃以下无明显的不可逆变性, 所以无需在每轮反应中补加, 这使得PCR扩增得以连续自动进行。

3.3.3 Pfu DNA聚合酶

从海洋细菌pyrococlus furiosus中提出, 此酶具有5'→3'DNA聚合酶活性及3'→5'外切酶活性, 它即可使碱基错配率下降, 也可扩增较长的DNA片段, 使长PCR技术成为可能, 另外还可有效地掺人放射标记的核昔酸和类似物。此酶催化DNA合成的忠实性比Taq酶高12倍, 最适延伸温度为72~78℃。Pfu DNA聚合酶耐热性极好, 97.5℃时半衰期大于3h。

在无d NTP时, Pfu DNA聚合酶会降解模板DNA, 因此反应时最后加入该酶到反应混合物中。3.3.4 Tth DNA聚合酶是从嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus) 中分离到的, 95℃该酶的半衰期为20min, 具有5'→3'外切酶活性, 无3'→5'外切酶活性。其活性是Taq DNA聚合酶的100倍, 表现出有效的高温反转酶活性, 在70℃及Mn2+存在时能催化逆转录反应, 使RT-PCR成为可能。

3.3.5 Vent TM DNA聚合酶

从深海底发现的嗜热球菌 (Thermo coclus clitoralis) 中分离得到, 此酶的热稳定性极好, 97.5℃时半衰期长达130min, 还能扩增大于12kb的模板DNA, 并且还有校正功能, 因此比Taq DNA聚合酶有更高的保真度。

3.4 镁离子

Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的, 因此, 反应中优化Mg2+浓度是非常有益的。Mg2+浓度除影响酶的活性与忠实性外, 也影响着引物的退火, 模板与PCR产物的解链温度, 产物的特异性, 引物二聚体的形成等。适宜的Mg2+浓度也是PCR关键, 过低时, 酶活性显著降低, 过高时, 则酶催化非特异产物扩增。PCR过程中Mg2+浓度应保持在0.5~2.5mmol/L之间, 具体Mg2+浓度要依据反应体系来调整。

3.5 d N TP的浓度

PCR常用的d NTP浓度为50~200μmol, 且四种d NTP应以等当量浓度配制, d NTP浓度影响反应的速度、实验精确性和成本。d NTP的浓度与最适Mg2+浓度相关, d NTP溶液具有较强的酸性, 使用时应以Na OH将其p H值调至7.0~7.5。

3.6 缓冲液

目前最常用的缓冲体系常为10~50mmol/LTris HCL (p H8.3~8.8) 。

4 PCR用于畜禽疾病诊断

4.1 PCR技术在细菌性疾病诊断中的应用

如在仔猪水肿病中检测致病菌大肠杆菌的SLT-Ⅱe基因序列。根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因片段所设计的引物序列 (合成了一对长25bp的引物) , 检测沙门氏菌。此外, PCR技术还可用于检测流产绵羊胃内容物中的布氏杆菌DNA, 检测单核细胞增多症李氏杆菌及产VERO毒素的大肠杆菌等。

4.2 PCR技术在畜禽病毒病方面的应用

用于检测牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒 (PPV) 、兔出血症病毒、猪的伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒, 牛白血病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鹅和番鸭细小病毒等。

4.3 PCR检测其他病原体

PCR技术已广泛应用于疟疾、卡氏肺囊虫、爱美尔球虫、弓形体、溶组织内阿米巴、克鲁斯氏锥虫、衣原体、支原体、螺旋体、真菌等方面的诊断。

4.4 肿瘤研究

主要用于肿瘤细胞的染色体异常研究, 体细胞中肿瘤基因和肿瘤抑制基因突变的研究及用于检测RNA或DNA肿瘤病毒。

4.3 PCR检测其他病原体

PCR技术已广泛应用于疟疾、卡氏肺囊虫、爱美尔球虫、弓形体、溶组织内阿米巴、克鲁斯氏锥虫、衣原体、支原体、螺旋体、真菌等方面的诊断。

5 小结

PCR技术论文 第9篇

关键词：实时荧光定量,PCR,原理,应用

聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 自1989年开始应用以来, 不仅在分子生物学领域成为常规的方法和手段, 而且在遗传病的诊断、临床标本病原体检测等方面得到了广泛应用。由于传统的PCR技术只能对基因的监测作定性的分析, 也就只针对特定基因的探测做出有或无的诊断, 无法精确地定量出所表现的基因数量, 使得一些量化的问题始终无法解决。因此对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向[1,2,3]。直到1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, FQ-PCR) 技术。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃, 而且与常规PCR相比, 融合了PCR 高灵敏性, DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点, 直接探测 PCR 过程中荧光信号的变化, 以获得特定区段扩增产物定量的结果, 不需要 PCR 后处理或电泳检测, 完全闭管操作 (整个过程中仅有加入样品的一次开盖) , 一举克服了常规 PCR 技术的诸多难题[4]。目前FQ-PCR已经被广泛应用于基础科学研究、临床疾病诊断、疾病研究及药物开发等领域[5,6,7]。本文对实时荧光定量PCR的原理及其应用现状等进行综述。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程, 当PCR扩增反应结束后, 笔者得到样品的实际扩增曲线, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。为了定量和比较方便, 在FQ-PCR技术中引入了两个概念:荧光阈值和Ct值。荧光阈值是人为设定的值, 相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数存在线性关系。因此, 实时荧光定量PCR 仪都有软件, 只要获得样品的Ct值就可以从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数[8]。

2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类

在实时定量PCR技术中, 要实现PCR产物的实时检测, 进而定量起始模板的量, 一般借助于荧光物质产生的荧光强弱来实现。实时定量PCR的检测常用的有荧光染料嵌入法和探针法。

2.1 荧光染料嵌入法 SYBR Green是一种只与DNA双链结合的荧光染料, 在反应体系中加入过量SYBR荧光染料, 当它与DNA 双链结合时发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。具体工作原理见图1。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合, 用于任意反应体系, 检测成本低。不足之处是由于染料可以与所有的DNA 双链分子结合, 因此易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响, 使定量结果不可靠。所以, 其特异性不如探针法。针对这一问题可以通过热循环仪内设定的程序过程对扩增曲线进行分析, 以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号;也可以通过设计特异性引物, 优化PCR的反应条件, 减少或去除非特异性物产物和引物二聚体的产生以提高特异性进行定性诊断。

2.2 探针法 TaqMan 探针是应用最广的水解探针, Taq Man探针法是高度特异的定量PCR技术, 其核心是利用Taq酶的3’-5’外切活性, 并在PCR反应体系加入一个荧光标记探针, 切断探针, 产生荧光信号。TaqMan 探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团不同分为2种:常规Taq-Man探针和TaqMan MGB (minor groove binder) 探针。常规 TaqMan 探针的5’端标记荧光发射基团TAMRA (6-carboxyfluorescein, 6-羧基荧光素) , 3’端标记荧光淬灭基团 TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine, 6-羧基四甲基若丹明) 。当探针保持完整时, 3’端淬灭基团吸收或抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR 的退火期, 探针与引物所包含序列内的DNA 模板发生特异性杂交[图2 (A) ]。延伸期引物在Taq 酶作用下DNA模板延伸[图2 (B) ], 当到达探针处, Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性, 继而发生置换。切断探针后, FAM 远离TAMRA, 荧光信号得到释放[图2 (C) ]。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。PCR每复制一个特异性核苷酸片段, 就有一个探针被切断, 同时一个荧光报告基团被释放, 产物与荧光信号产生一对一的关系, 且光密度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系, 因此该技术可对模板进行准确定量[9]。但有一定不足, 主要表现在: (1) 由于采用荧光和淬灭基团双末端标记, 因此淬灭难以彻底, 本底较高。 (2) 报告基团的水解利用的是Taq酶的5’-3’外切活性, 因此定量时容易受酶活性影响。探针标记成本较高, 不便普及应用 (蔡霞, 2005) 。TaqMan MGB 探针与常规 TaqMan 探针相比, 其优点在于: (1) 探针在3’端采用非荧光淬灭基团, 本身不产生荧光, 可以使荧光本底信号的强度降低; (2) 探针上连接了MGB修饰基团, 使探针ΔTm 值提高10度左右。因此为了获得同样的Tm值, MGB探针可以比普通TaqMan探针设计的更短, 既降低了合成成本, 也使探针设计的成功率大为提高[10]。

注:R.荧光发射基团;Q.荧光淬灭基团;P.磷酸化。

3 实时荧光定量PCR技术的医学应用

目前 FQ-PCR已经被广泛应用于基础科学研究、 临床疾病诊断、 疾病研究及药物开发等领域。

3.1 检测微小残留病变

在监测治疗反应时, 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位, 这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。因此微小残留病灶的检测成为进一步调整治疗方案的关键步骤。real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备研究工具[11,12]。目前的研究证明用real-time Q-PCR来检测融合基因有助于对这些患者的微小残留病变进行定量, 以证明可以以此作为预后指示物或评估治疗方案的指标[10]。

3.2 检测病毒和细菌方面

扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高。李丹[13]等用FQ-PCR准确地定量检测孕妇血清中人巨细胞病毒的数量及其在临床的意义。目前运用较多的是用real-time Q-PCR来定量测定在器官移植中对使用免疫抑制剂的患者巨细胞病毒感染。研究表明在骨髓移植的患者中用real-time Q-PCR检测巨细胞病毒感染比传统的pp65抗原试验更敏感, 抗巨细胞病毒药物治疗能使血中的病毒含量下降[14,15]。

3.3 肿瘤学研究

肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化, 是一种多基因异常的疾病, 这些异常变化用定量 PCR 方法都可以检测出来。1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc, ccndl和erbB2基因进行扩增, 在108例标本中, 发现10%的myc基因, 23%的ccndl基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加, 拷贝数增加的最大值分别是4.6、18.6、15.1, 同时他们又将这些数据与Southern印记结果进行比较, 显示了较好的相关性。

4 结语和展望

PCR技术论文 第10篇

1 单引物PCR

用PCR法在属水平上鉴定布鲁氏菌，引物包括编码BCSP-31序列的(B4/B5),omp2(JPF/JPR),16SrRNA(F4/R2),IS711(IS313/IS639),16S-23S内源转录间隔区(Bru ITS-S/Bru ITS-A),per(bruc1/bruc5)，外膜蛋白(omp2b,omp2a和omp31),omp25/omp31家族的布鲁氏菌蛋白，分泌蛋白Vir B8和随机引物。不同引物的灵敏性和特异性差异很大，其中编码BCSP-31序列的(B4/B5)常用于人类布病的诊断:以血液为样本，增加反应的循环数，会对引物表现出很高的灵敏性。Leal-Klevezas DS等根据编码bcsp-31和外膜蛋白(omp2b、omp2a、omp31)序列设计了4对引物，以不同的组合用于4种不同的PCR体系中鉴别牛种、羊种、犬种和猪种布鲁氏菌，此法也被认为是检测人布鲁杆菌的理想方法。Hinic V等报道了一种7个单重PCR反应检测布鲁杆菌6个种型的方法(B.microti除外)，有很高的特异性，适合常规PCR和实时PCR，唯一的不足是不能区分猪种4型和犬种菌。Leal-Klevezas DS等用PCR区分出了牛布鲁杆菌1、2、4型。Sangari等依据ery位点序列设计的引物可用于鉴定S19,Vemulapalli R等依据wbo A基因突变区分RB5l疫苗株与其他种布鲁氏菌。

2 多重PCR

把不同的引物结合起来在种和部分亚型水平上识别布鲁氏菌，可以同时对有多个型别的目的基因进行分型。最早的多重PCR法是Bricker等在1994年报道的AMOS-PCR(Abortus Melitensis Ovis Suis)法。该实验用五种不同的引物在种型水平上鉴别出牛种(l、2、4型)、羊种(1、2、3型)、绵羊附睾种和猪种(l型)，使用此方法鉴定野生株与传统的生物分型法完全符合。为了区分牛疫苗株S19和从野生株分离到的RB51，在原始的AMOS-PCR的基础上加入了三对新的引物。根据这个AMOS-PCR格式，又设计加入了一对新的引物，来鉴定牛种3b、5、6和9型[1]。AMOS-PCR检测方法尽管只能对4个种的某些生物型布氏菌准确鉴定，但这些菌是国内主要流行菌株，鉴定结果与传统方法符合率较高，操作安全且简单快速，可以作为布氏菌快速鉴定的辅助试验之一[2]。López-Goni I等[3]用多重PCR法(Bruce-ladder)在种水平上鉴定所有的布鲁氏菌，包括6种陆生种、海洋种以及疫苗株S19、RB51、Rev.1。在此基础上，Mayer-Scholl等[4]改进的多重PCR已能鉴别目前已知的9个布鲁氏菌种。

随机扩增多态性DNA PCR可用于鉴别种和型水平上的引物[5]。据此设计的19对引物用于多重PCR能特异性鉴别布鲁氏菌沙林鼠种、鳍型布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌和田鼠型布鲁氏菌，同时还能区分牛种的1、2、4型与3、5、6、9型以及猪种1、3、4型和2、5型，这种方法鉴定的结果与以前的布鲁氏菌分型结果(包括所有参考菌株和118株野毒株中的大多数)相一致。但犬种菌表现为两种图谱，一组为其特异图谱，另一组图谱与猪种3、4型一样，未检测到交叉反应[6]。钟旗等[7]以布鲁氏菌属鉴定的Vir B8-PCR法与AMOS-PCR种鉴别方法为基础，建立了布鲁氏菌牛种I型B1-PCR的鉴别方法，进一步建立了区分鉴别A19疫苗株与布鲁氏菌牛种Ⅰ型野毒株感染的诊断方法。

近期，有报道[8,9]认为通过特异性引物的两步PCR是一个简单、快速和相对廉价的方法，建议用来诊断人布鲁氏菌感染，有效地减少诊断延误。

3 实时荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。它最大的优点是快速、不需要电泳分析，可以避免污染。它的灵敏性取决于特异性的探针[10]。布鲁氏菌细胞、血清、血液、以及石蜡包被组织都可作为实时PCR检测的样品。实时PCR可以用于诊断人的布鲁氏菌病并且通过血清学检测可以区分隐性和显性感染[11]。使用B4、B5引物和荧光染料(SYBR Green I)在水平上诊断布鲁氏菌病的实时PCR可以与PCR-ELISA的结果相比[12]，此法适用于布病病人血清或全血样本。但结果显示，实时PCR对血清比对其他样本更灵敏。用引物和bcsp31 Taqman探针的定量实时PCR通过血清可以鉴别隐性和显性感染，该实验最低可检测到10 fg布鲁氏菌DNA。这对布病的早期诊断以及鉴别布病慢性期与急性期都有帮助[13]。

三种在水平诊断人布病的实时PCR，以全血和石蜡包被组织为样本。分别根据16S-23S rRNA间区、omp25和omp31序列设计引物和探针。结果证明以16S-23S rRNA间区设计的引物和探针在人布病临床诊断中灵敏度最高[11]。另有研究对比了分别以IS711、bcsp31、per设计的Taq Man探针和引物的实时PCR，结果表明依据IS711设计的Taq Man探针和引物在鉴别布鲁氏菌时有良好的灵敏性、特异性、高效性和可重复性[14]。四个基于引物和Taq Man探针的单实时PCR用于在型水平辨别和区分猪种布鲁氏菌，能区分4种单核苷酸多态性。实验结果表明每一型的等位基因是唯一的，但是一些猪种3型的野毒株与猪种1型的等位基因谱是相同的[15]。

荧光定量PCR作为传统PCR的延续与发展．其应用范围更广，应用价值更高。但是实验需要特殊的仪器和严格的实验室分区，这样就从空间上缩小了其应用范围。此外，封闭检测不能得到扩增片段的大小，提高灵敏性的同时污染风险也自然提高。定量实验中，内源控制物的选取与标准品制备时没有统一标准造成不同实验室之间的数据不能进行直接比较[16]。

4 小结

虽然布鲁氏菌的检测技术已经有了很大的发展，但是，仍然没有一种单一的PCR方法能在任何情况下进行快速、准确的诊断。从样本中分离到布鲁氏菌是诊断布病的金标准，然而基于识别特异性核酸片段的PCR方法更有实际意义。但是，大多数PCR方法的DNA模板都来源于培养的布鲁氏菌或者直接从组织中提取，其质量和纯度非常重要，尤其是在多重PCR中，DNA样本中任何来源的抑制剂都会对结果造成影响，经常会出现假阴性结果。

PCR测序证实为马红球菌感染个案 第11篇

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.671 文章编号：1004-7484（2012）-08-2955-02

马红球菌（Rhodococcus equi）主要对动物治病（马、猪、牛），被认为是人类少见的机会致病菌。近年来，人类马红球菌感染的报道逐渐增多，尤其发生于免疫受损的人群。今年四月我院儿科收治了一位2岁患儿，“间歇性咳嗽、发热20余天入院”，血培养阳性，最后经南方医院检验科PCR测序证实为马红球菌感染，现将该患儿的诊治过程，血培养分离鉴定过程报告如下：

1 患者资料

1.1 简要病史 患儿，男，1岁，20余天前无明显诱因出现咳嗽，伴有间断性发热，最高体温40.2℃，曾在外院就诊，诊断为支气管炎，予以头孢美唑、阿奇霉素针剂、氨溴索静脉滴注，期间病情有好转几天，但停药后咳嗽症状又加重，仍有反复发热。于当日因“间歇性咳嗽、发热20余天”由门诊抱送入院。自起病以来，患儿精神、睡眠欠佳，大小便正常。后用阿奇霉素联合头孢曲松，稍有好转，体温仍有波动，38左右，偶有咳嗽。到家属被告知血培养阳性，目前治疗疗程未到时，家长表示已了解病情，坚决要求出院，随签字患儿出院。

1.2 查体 T39.8，P135次/分，R50次/分，Wt7Kg，咽部充血，扁桃体I度肿大，双肺呼吸音粗，肺底可闻及细湿性啰音，心、肝脾正常。

1.3 辅助检查 血清肺炎支原体抗体阴性，血常规：WBC26.7*109/L，N82.1%，L10.7%。X线检查：双肺纹理增多，模糊，右中下肺大片状模糊阴影，密度不均匀，边缘模糊。血培养阳性，API CORYNE鉴定为低分辨率红球均属。

2 检查方法

2.1 血培养分离鉴定

2.1.1 标本采集 严格无菌操作抽取患儿静脉血3mL，无菌注入双向培养瓶，及时送往检验科微生物室37培养。

2.1.2 培养观察、鉴定

2.1.2.1 37℃培养第三天，双向培养基固相有大小0.5-1mm、不透明、圆形菌落生长，液相微浑浊。革兰氏染色镜检为G+杆菌，细菌形态呈多形性。随转种哥伦比亚血平板、伊红美兰平板37℃纯培养，24小时后，血平板上出现大小0.5-1mm、灰色、不透明、湿润如水迹样菌落，革兰氏染色镜检为G+球菌。此时双向培养基里的培养物革兰氏染色镜检多为G+球菌。37℃培养48小时后血平板上的菌落颜色变为深黄色，粘稠度增加。

2.1.2.2 转种伊红美蓝、巧克力平板均不生长，转种普通营养平板生长良好。

2.1.2.3 触酶阳性，氧化酶阴性，通过API CORYNE板条鉴定出低分辨率红球均属%ID 59.3 T0.86。

生化反应：硝酸盐还原+、碱性磷酸酶+、比嗪酰胺+、七叶灵（水解）-、明胶-、不分解任何的糖类、用金黄色葡萄球菌做CAMP-。

2.1.3 PCR测序结果如下：

GGGAGGAGTCGGATACTGGGCGTAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCCGTGAAAACTTGGGGCTCAACCCCAAGCTTGCGGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATACCGGAAAGCCGTAGAGATACGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAGTCGTACAGGCAGCCCAAATATAAA。

2.2 藥敏试验 棒状杆菌没有药敏板条，马红球菌还没有药敏标准，用ATB STAPH 2（00）板条做的药敏24小时和48小时结果见下表：

3 结果

3.1 根据其血培养新鲜菌落为G+杆菌，形态具有多形性，陈旧培养物为G+球菌，在血平板培养48小时后，菌落颜色变深黄，生化反应触酶+、硝酸盐还原+、氧化酶-、不分解任何糖类，API CORYNE鉴定结果以及抗生素敏感试验，都与刘玲梅等和叶东方、伍伟国报道的马红球菌生物特性相符。在普通营养平板、血平板上生长良好，而在伊红美蓝、巧克力平板上不生长。现在还未见有马红球菌在巧克力平板上生长的文献报道。本菌株在巧克力平板上是不生长，是共性还是个性，因病例太少不能说明。

3.2 经过PCR测序，也证实该菌为马红球菌。

3.3 患儿咳嗽、发热，血清CRP106.37mg/L，WBC26.7*109/L，N82.1%，说明存在细菌感染，此时血培养阳性与临床症状相符；李庆，刘祥泉，赵禾，等报道的马红球菌的治疗疗程与感染个体的免疫情况、感染部位和病程长短有关，5-60天不等[4]，患儿在院外、院内都用了阿奇霉素和头孢类药物，病情有所好转，但仍有体温波动、间断咳嗽，而马红球菌对红霉素、左氧氟沙星、万古霉素敏感，对青霉素耐药，所用阿奇霉素属敏感药物，但因为在外院是间断用药、在本院疗程太短患儿家长就要求出院，疗程不够疗效自然不明显，患儿血清肺炎支原体抗体阴性，肺X线出现大片模糊阴影，这与马红球菌对肺泡吞噬细胞持续破坏[2]相吻合；该患儿1岁，Wt7Kg，其免疫状态加大了其被感染的机会，以上说明血培养阳性菌就是该患儿的致病菌。

综上所述，该患儿感染了马红球菌。

4 讨论

现文献报道的马红球菌的感染主要是有免疫损伤、免疫缺陷的人群，仅有少数病例属于免疫功能正常的患者[5]，该病例是位免疫力低下的小儿。所以，在临床工作中，对于免疫力低下人群的肺部感染，也要考虑到马红球菌感染的可能；而临床微生物检验工作中遇到新鲜培养物为G+杆菌，形态具有多形性，陈旧培养物为G+球菌，在血平板培养48小时后，菌落颜色变深黄，生化反应触酶+、氧化酶-，就要考虑马红球菌的可能，应快速报出药敏结果，以便指导临床选择有效抗菌药物，对患者进行足够疗程的有效治疗。另外，对于痰液标本，因菌较杂，应将平板培养48-72小时，再观察菌落呈色变化，以防漏检。

参考文獻

[1] 刘玲梅，崔龙秀，金凤玲.血培养中马红球菌的分离和鉴定.兰州医学院学报，1996，22（1）：53.

[2] 叶东方，伍国伟.艾滋病患者并发肺部马红球菌病九例临床分析.中华临床感染病杂志，2008，1（4）：235-236.

[3] 刘志远，刘贵建，潘健，等.马红球菌致老年女性肺部感染一例.中华临床医师杂志，2011，5（1）：301-302.

[4] 李庆，刘祥泉，赵禾，等.中西医结合治疗马棒状杆菌感染38例.中国中西医结合杂志，1998，18（2）：91.

PCR技术论文 第12篇

1 PCR在肉中致病微生物检测的应用

加强畜禽肉和水产品的检验检疫,保证其食用安全,是预防食源性疾病暴发的重要途径。PCR技术有快速、特异、敏感等特点,因而该技术在肉食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。大量研究表明,PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度,而多数情况下则表现出更高的灵敏度,而且检测周期大为缩短。建立荧光PCR方法、实时PCR方法、多重PCR等方法可简便、快速、灵敏地实现对肠出血性大肠杆菌,单增李氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的细菌学诊断快速、简便、经济,有较大的应用价值。

随着分子生物学技术的不断发展,多重PCR、标记PCR、不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于畜产品检测中,它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。

2 PCR在鲜肉及肉制品肉的种属来源鉴定的应用

随着社会经济的快速发展,消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高,席卷欧洲“马肉风波”、疯牛病、禽流感等疾病的出现以及宗教、经济健康原因和市场监管,都急需一种快速、准确的检测方法以对肉制品、宠物食品和肉骨粉等所含肉的成分进行种属鉴定。当前,对研究者、消费者、食品工业和政策制定者等各个方面来说,食品的真伪都是一个热点问题,尤其是肉类工业。PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点,在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。目前所采用的感官检验和免疫学方法可鉴别生鲜肉的种属,但对热加工处理的肉类,由于其感官性状、蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏而难以鉴别,因此熟肉种类与饲料中牛羊肉成分的种属鉴别一直是亟待解决的难题。

动物品种的鉴定方法主要从蛋白和核酸两个层次进行。以蛋白为基础的方法主要包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)等电聚焦电泳和免疫学方法。以核酸为基础的方法包括物种特异引物多重PCR、荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)等。

20世纪80年代,国外开始对肉的种属鉴定进行研究,初期的研究对象主要是生猪肉和牛肉。采用的方法主要有DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦等。这些方法中,DNA杂交和免疫扩散灵敏度高。但DNA杂交试验方法复杂,耗时长;免疫扩散不能够检测出有亲缘关系的肉类品种,比如山羊与绵羊,水牛与普通黄牛。同时对经过加工的制品检测效果不佳;等电聚焦速度快,但灵敏度稍差,成本高,工作量大且不易准确定量。

物种鉴定的关键因素是选择合适的分析基因。肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理后,DNA发生断裂,提取的DNA减少。Arslan A研究证实,烹煮、烘烤、压力处理、油煎等烹饪过的牛肉制品通过提取其线粒体中271bp的DNA片段,而后经过PCR扩增也可以鉴别出来,但是高温的非水烹调肉可能用PCR无法检测,因为高温使肉碳化、DNA变性。

目前用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体(mtDNA)上,包括细胞色素b(Cytb)基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。T.Matsunaga等(1999)利用Cytb来设计引物扩增基因片段,并将山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马的基因混合,正向引物(Forward primer)在Cytb的保守DNA序列上设计,反向引物(Reveserprimer)采用几个物种各自特有的DNA序列来进行多元PCR反应,所得的扩增片段可用于鉴别几种物种。高琳(2008)等以动物线粒体DNA中Cytb区段的保守序列为目的基因进行PCR-RFLP,从6种生肉及7种加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分。所有样品经PCR扩增均产生359bp的片段。扩增子采用Alu I限制性酶切所产生的片段差异可用于区分猪肉和牛肉。

肉骨粉是牲畜屠宰后其毛纤维、皮革、角质、骨骼、脏器等非食用组织经由高温蒸煮后再挥干水分的成品,是重要的动物蛋白饲料,在养殖领域使用极为广泛。目前国内外已经建立了许多从饲料里鉴别动物源性成分的方法,其中以PCR方法最为灵敏和准确。李文静等分别运用特异性引物,针对牛、羊、猪和鸡的线粒体基因中的某一片断进行扩增,建立了鉴别四种动物源性成分的PCR方法,用每种动物的特异性引物跟其它动物的DNA进行PCR扩增,结果没有扩增出非特异条带,说明选用的牛的引物和自己设计的三种引物都具有特异性,检出的牛肉骨粉的最低含量约为0.001%。证明该方法具有快速、灵敏度高和特异性强等优点,可以作为鉴定肉骨粉种类的常规方法。