成纤维细胞范文

成纤维细胞范文（精选11篇）

成纤维细胞 第1篇

1 仪器与方法

1.1 仪器、试剂

二氧化碳培养箱 (Sanyo, Japan) 、超净台 (将来进化设备厂, 江苏吴县) , 倒置光相差显微镜 (Nikon, Japan) , DMEM培养基 (Gibco, Germany) 、胰酶 (上海化学试剂公司) 、FCS (杭州四季青公司) 、角蛋白、波形蛋白单抗 (Dako, Denmark) 。

1.2 细胞培养

1.2.1 组织块原代培养法

(1) 刮取临床因正畸或阻生拔除牙齿的根中1/3的健康牙周膜, 立即投入含三抗 (青霉素、链霉素、庆大霉素) 的D-Hanks液内。 (2) 清洗刮取的牙周膜, 去除血污及不需要组织。 (3) 用镊子将组织块移入25mL培养瓶中, 倒置培养瓶于5%CO2、37℃培养箱中1h后, 加入含10%胎牛血清+三抗的DMEM培养基。放入培养箱继续培养。 (4) 隔日换液, 至细胞长满瓶底80%, 常规传代。

1.2.2 酶消化原代培养法

(1) 刮取临床因正畸或阻生拔除牙齿的根中1/3的健康牙周膜, 立即投入含三抗的D-Hanks内。 (2) 清洗刮取的牙周膜, 去除血污及不需要组织。 (3) 加入0.25%胰蛋白酶消化20min, 加入含10%FBS的DMEM终止消化, 二层无菌纱布滤除组织块, 1000ppr 5min离心去上清, 加入含10%FBS的DMEM进行培养。

1.2.3 传代

(1) 用吸管吸出培养瓶内培养液, 加入D-Hanks液冲洗两次。 (2) 倒掉D-Hanks液, 加入0.25%胰酶, 用量以覆盖细胞为度。 (3) 镜下观察消化过程, 见到细胞胞质回缩, 细胞相互分离, 出现缝隙时, 即倒出消化液中止消化。 (4) 加入两倍培养基, 用吸管反复吹打瓶壁, 使细胞完全脱落, 形成细胞悬液。 (5) 按1∶2比例进行传代。

1.2.4 细胞来源鉴定, 应用Envision免疫组化法进行鉴定。

(1) 细胞爬片4%多聚甲醛固定30min, PBS冲洗5min×3次。 (2) 滴加一抗 (角蛋白单抗, 稀释度1∶100;波形蛋白单抗, 稀释度1∶30) , 4℃过夜, PBS冲洗, 5min×3次。 (3) 滴加Envision反应液, 37℃, 30min, PBS冲洗5min×3次。 (4) 0.04%DAB+0.03%H2O2孵育约8~10min, 冲洗, 苏木精衬染1min, 冲洗。 (5) 脱水, 封片。 (6) 对照设置:用PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.5 生长曲线和倍增时间

(1) 取四代细胞用0.25%胰酶消化, 10%FBS+DMEM调整至3×104/mL, 接种于24孔板。 (2) 每24h取3孔, 进行细胞计数, 连续观察7d。 (3) 绘制生长曲线, 计算倍增时间。倍增时间公式为:DT= (t-t0) lg2/ (lgN-lgN0) 。公式中t0和t分别代表计算DT值的培养起始时间和终止时间, N0和N分别代表t0和t时的细胞数。

2 结果

2.1 形态学观察

光镜下观察, 见细胞自组织块周边爬出, 成梭形, 细胞排列有一定的方向性。多呈放射状或漩涡状排列, 或交织成网状 (图1~图2) 。倒置光显微镜下观察, 细胞呈长梭形, 核仁清晰, 胞质均匀。

2.2 生长特点

刮取得牙周膜组织一般3~7d后可见有细胞爬出。细胞生长初, 5d左右可进行传代, 10代后需7~10d长满瓶底, 一般于15代后, 细胞增殖明显减慢, 细胞趋于老化。HPDLF生长曲线都呈“滞缓-对数生长-平台”的S形曲线。接种后第1天细胞数略有下降, 第2天开始回升, 并进入对数生长期, 第6天细胞生长减缓, 细胞生长曲线呈“S”形 (图3) 。即有缓慢生长期、快速生长期和稳定期, 倍增时间为60h。

2.3 细胞来源鉴定

用Envision System进行波形蛋白和角蛋白单抗染色。光镜下观察, 抗波形蛋白阳性, 抗角蛋白阴性, 说明细胞来源于中胚层 (图4和图5) 。

3 讨论

细胞培养技术是细胞生物学的一项重要研究手段, 在生物学研究领域发挥着极其重要的作用。离体组织培养的原代细胞具有较好的原组织细胞的遗传特性和生物学特性, 对实验底物的反应与体内细胞有比较相近的反应。所以, 离体培养PDLFs对牙周生物学的研究有重大的作用。

目前PDLFs体外培养一般选用年轻的恒牙的牙周膜组织, 主要为因正畸拔除的前磨牙或因阻生拔除的第三磨牙, 取材部位普遍采用牙根中2/3的牙周膜组织。

原代培养方法有组织块贴附法和酶消化法两种, 目前国内多采用组织块贴附法进行PDLFs的原代培养, 一般认为, 组织块贴附法原代培养获取细胞同源性、一致性较好, 但培养成活率低, 且长满的时间慢。而酶消化法原代培养周期短, 一次可获得较大量细胞, 但消化的时间和条件难以掌握。贴附法损伤较小, 而细胞经酶消化后损伤较大, 本实验酶消化法效果不佳, 消化下的细胞数量少, 活性差, 悬液中的细胞不贴壁, 细胞成活率低, 徐燕等也曾有类似报道[3]。丁桂聪等认为, 胰酶消化超过20min, 能消化掉细胞表面的蛋白质, 使细胞表面的通透性升高, 活力下降[4]。另外, 细胞生长有密度依赖性的特点, 可能因为消化后的细胞数量过少, 细胞不易贴壁生长。

贴附法原代培养方法细胞生物学特征较消化法稳定, 且牙周膜组织体积小, 采用贴附法做人牙周膜成纤维细胞原代培养更合适。由于组织块贴附法培养原代细胞, 会混有其他细胞, 如上皮样细胞等, 3代以前为适应期或不稳定期, 通过自然纯化及胰酶消化纯化, 剩下形态结构、生长状态一致的人牙周膜成纤维细胞。4-8代为稳定期, 细胞形态一致, 胞体丰满, 胞质均匀, 核仁清晰, 可见核分裂相, 生长状况良好, 适合作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型, 以保证实验的重复性、可靠性。10代以上为衰退期, 细胞生长速度减缓, 胞体增大, 胞突变细, 胞质内颗粒增加, 胞核分裂相减少。

摘要：目的 人牙周膜成纤维细胞的细胞培养技术两种方法的比较。方法 采用组织块法和酶消化法进行人牙周膜成纤维细胞的原代培养, 绘制PDLFs的生长曲线。用Envision免疫组化方法进行细胞来源的鉴定。结论 组织块培养方法更适合PDLFs的原代培养。

关键词：PDLFs,细胞培养

参考文献

[1]章魁华, 于世风.实验口腔病理学[M].北京:人民卫生出版社, 2002:215.

[2]M.J.Somerman, S.Y.Archer, G.R.Imm, et al.A comparative study ofhuman periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro[J].J Dent Res, 1988, 67 (1) :66-70.

[3]徐燕, 李颂, 程继光, 等.人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞的培养和生物学特征[J].口腔医学研究, 2002, 18 (6) :375-377.

成纤维细胞 第2篇

早期研究使用的成纤维细胞生长因子(FGFs)主要来自牛脑和脑垂体的提取液，是大约150个氨基酸结构的酸性或碱性成纤维细胞生长因子(aFGF：FGF1或bFGF：FGF2)。其后分离的癌基因产物的细胞增殖因子与上述FGFs结构类似，也被分类在FGFs家族，并依次命名为FGF3~9〔1〕。目前已发现23种FGFs。现主要就多能FGFs结构和相关功能机制的研究进展进行综述。?

1发现和鉴定新的FGFs结构?

FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。FGFs是由约150~200氨基酸组成的多肽，相互之间的氨基酸序列有20%~50%是相同的〔2,3〕。其中心区域有大约120个氨基酸序列存在高度的同源性(30%~70%)。利用该区域的同源性，以人、小鼠或大鼠cDNA和基因组DNA为模板、采用同源序列PCR法进行新FGFs基因检测。当然，还可以采用T7噬菌体?cDNA显示法鉴定新FGFs。FGFs受体(FGFRs)是典型的膜结合酪氨酸激酶型受体。将FGFRs的胞外结构域在杆状病毒群(baculovirus)表达株表达，制成重组的细胞外结构域(可溶性FGF受体)。进而利用可溶性FGFRs与配体结合的特性，通过T7噬菌体cDNA显示法对互补cDNA文库进行筛选。?

通过同源序列PCR法，已经发现了6种新的FGFs基因(FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21)〔4〕。虽然T7噬菌体cDNA显示法能获得较多的阳性克隆，但不能确认是新发现的FGFs。随着人类基因组结构的解析及其DNA数据库被公开，通过基因检索进而又发现3种新的FGFs基因(FGF19、FGF22、FGF23)〔5,6〕，并发现FGF-22mRNA选择性表达于皮肤毛囊的内毛根鞘〔7〕。加上在探索视网膜特异性表达基因的过程中所发现的4种新的FGFs基因(即FGF11、FGF12、FGF13和FGF14)〔1〕，以及McWhirter等〔8〕在探索嵌合体同源结构域癌蛋白(chimerichomeodomainoncoprotein)E2A-Pbx1下游目标过程中发现的FGF15，迄今共鉴定出23种人或鼠FGFs。但是人FGF15和小鼠FGF19尚未被证实。人FGF19与小鼠FGF15显示很高的同源性(约50%)，且这两种基因都跟FGF3、FGF4基因的染色体邻接〔3〕，由此推断人FGF19是小鼠FGF15的相同体。由于人与小鼠其他FGFs结构之间的同源性达90%以上，因而除非FGF15和FGF19在进化过程中意外地发

成纤维细胞 第3篇

关键词：中药复方；鸡胚成纤维细胞；生长；安全浓度

中图分类号：S853.74文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）06-0149-03

收稿日期：2013-09-06

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2008BADB4B06）；江苏青蓝工程骨干教师资助项目。

作者简介：邢玉娟（1964—），女，山东济南人，副教授，主要从事中药药理研究。E-mail：1903048595@qq.com。

通信作者：胡元亮，教授，博士生导师，主要从事中兽医学研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn。有研究证明，中药为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类和铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激性强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2]，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[3-4]。

有试验证明，氧化苦参碱（oxymatrine，OM）和黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）在先于病毒加入细胞、后于病毒加入细胞和与病毒同时加入细胞等3种方式加入后均能抑制病毒生长，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在先于病毒加入和与病毒同时加入时有抑制病毒生长作用，栀子苷（geniposide，GP）只有在先于病毒加入时才能显现出一定的抑制病毒感染细胞能力的作用[5-6]。本试验选用体外试验对鸡新城疫病毒（NDV）呈现抑制作用的OM、APS、GP和GA，按一定比例分别组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4个中药复方，通过MTT（四唑溴盐）法[7-11]测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞（chickembryo fibroblast，CEF）增殖的影响，为下一步体内试验作准备。

1材料与方法

1.1试验药物

根据以前的试验结果[5]，将OM、GA、GP、APS 等4种中药按一定比例组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4个复方，分别用MEM培养液溶解稀释成1 000 μg/mL，高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。临用前吸取各药0.5 mL至24孔细胞培养板第1孔中，加入细胞维持液 0.5 mL，倍比稀釋至10孔。

1.2主要试剂

MEM细胞培养液，Gibco公司产品，按说明书配制，再加入犊牛血清（5%为细胞生长液、2%为细胞维持液），再按常规量加入0.03%谷胺酰氨和双抗（各100 IU/mL）；胰蛋白酶，进口分装，用PBS（pH值7.4）配制成0.25%的溶液，0.22 μm 混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用；MTT溶液，Sigma公司产品，用pH值为7.4的PBS液配制，使终浓度为2 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4 ℃冰箱保存，1 周内用完；裂解液二甲亚砜（DMSO），分析纯，江苏苏州工业园区正兴化工研究院生产。

1.3主要仪器

CO2培养箱，美国Revco公司生产；XSZ-DZ型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂制造；75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；96 孔细胞培养板和24 孔细胞培养板，德国 Nunclon 公司生产。

1.4试验方法

按文献[12-13]的方法制备CEF。用细胞生长液调整细胞数至100万个/mL，在96 孔细胞培养板中加入 100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待CEF刚形成单层时加药。试验组分别加入不同浓度的中药复方 100 μL/孔，每个浓度重复4 孔，每2种中药成分复方共用一块细胞板并重复2块细胞板；对照组4 孔，仅加细胞维持液；另设无细胞孔为测定时的空白调零孔，继续培养。加药后 48 h 测定细胞增殖情况。

1.5细胞增殖测定

用MTT法测定细胞增殖的情况：测定前4 h加入 50 μL/孔 MTT溶液；测定时快速翻转培养板，甩去孔内培养液，加入100 μL/孔裂解液，室温下振荡5 min使结晶物溶解；然后用酶联免疫检测仪测定D570 nm，作为细胞增殖的指标。D570 nm与活细胞的增殖呈正比，即D570 nm越大，细胞增殖越旺盛。

1.6中药对CEF安全浓度的判定

根据D570 nm测定结果判定中药对CEF的安全浓度，选择D570 nm与对照差异不显著的试验组的最高中药浓度作为安全浓度的上限[14]。

1.7数据处理

计算4 孔平均值和标准差，数据以“x±s”表示，用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较，并比较各中药组分对CEF增殖率的差异性。增殖率=（各组加药后的D570 nm-对照的D570 nm）/对照的D570 nm×100%。

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2结果与分析

2.14个中药复方对CEF增殖的影响

3.91～31.25 μg/mL OM-APS 的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1.95、62.50～500.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL OM-APS的D570 mm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS浓度在3.91～3125 μg/mL时对细胞增殖有显著的促进作用。综合以上结果可知，OM-APS的最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。表14个中药复方对CEF增殖的影响

浓度

（μg/mL）D570 nmOM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.000.305±0.005d0.313±0.015c0.332±0.009e0.325±0.020d500.000.345±0.051bc0.367±0.015b0.365±0.019cd0.372±0.017bc250.000.370±0.014abc0.388±0.013ab0.365±0.012cd0.375±0.023bc125.000.370±0.008abc0.387±0.006ab0.366±0.015cd0.388±0.017ab62.500.373±0.015abc0.383±0.015ab0.380±0.010abcd0.412±0.009a31.250.380±0.01ab0.380±0.010ab0.376±0.015bcd0.392±0.005ab15.620.380±0.010ab0.400±0.010a0.386±0.015abc0.382±0.026abc7.810.382±0.020ab0.370±0.010b0.403±0.005a0.360±0.008bc3.910.393±0.017a0.380±0.010ab0.400±0.008ab0.372±0.017bc1.950.372±0.012abc0.366±0.005b0.375±0.012bcd0.347±0.053cd对照0.336±0.028cd0.336±0.028c0.356±0.022d0.356±0.022bcd注：同列数据后不同字母者表示差异显著（P<0.05）。

1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm均显著高于对照，1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS-GP在1.95～500.00 μg/mL 时对细胞增殖有促进作用，OM-APS-GP的最大安全浓度为1 000 μg/mL（表1）。

3.91～15.62 μg/mL GA-APS的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的 D570 nm显著低于对照，1.95、31.25～500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05）。说明GA-APS在3.91～15.62 μg/mL能显著促进细胞增殖，但随浓度升高，促进增殖作用逐渐减弱，1 000.00 μg/mL 对细胞增殖有抑制作用。综合以上结果可知，GA-APS最大安全浓度为500.00 μg/mL（表1）。

62.50 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），125.00～500.00、3.91～31.25 μg/mL 的 D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1.95、1 000.00 μg/mL 的 D570 nm 低于对照但不显著。说明62.50 μg/mL GA-APS-GP对细胞增殖有显著的促进作用，且随浓度的升高或降低，促进增殖作用逐渐减弱。综合以上结果可知，GA-APS-GP最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。

2.24个复方对CEF增殖率的影响

对CEF增殖率最高的是OM-APS-GP，当其浓度为 15.62 μg/mL 时增殖率达到19.05%。OM-APS有8个浓度、OM-APS-GP有7个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2个浓度使CEF增殖率达到了10%以上（表2）。

OM-APS促进CEF生长的作用曲线呈马鞍形，有2个峰值，分别是3.91、250.00 μg/mL；OM-APS-GP的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是3.91、15.62、250.00 μg/mL；GA-APS的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是7.81、62.50、500.00 μg/mL；GA-APS-GP 的促生长曲线呈单峰状，在62.50 μg/mL达到峰值。

表24个中药复方对CEF增殖率的影响

浓度

（μg/mL）增殖率（%）OM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.00-9.23-6.85-6.74-8.71500.002.689.232.534.49250.0010.1215.482.535.34125.0010.1215.182.818.9962.5011.0113.996.7415.7331.2513.1013.105.6210.1115.6213.1019.058.437.307.8113.6910.1213.201.123.9116.9613.1012.364.491.9510.718.935.34-2.53對照0000

3结论与讨论

3.1中药复方对CEF的安全浓度

根据D570 nm测定结果可知，1 000.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00～1.95 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm均显著高于对照（P<005），1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的D570 nm显著低于对照（P<0.05）；500.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著。综合以上结果可知，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS、GA-APS-GP 对CEF的安全浓度分别为1 000.00、1 000.00、500.00、1 000.00 μg/mL。

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3.2中药复方对CEF增殖的影响

D570 nm能直接反映被测样品中活细胞的增殖情况，两者呈正相关。本试验中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），说明这4个中药复方在一定的浓度范围内均能促进CEF增殖。其中，OM-APS-GP促进CEF增殖的浓度范围最大，所选浓度范围对细胞生长均无抑制作用。综合增殖率和D570 nm 结果可知，这4 个中药复方促进CEF增殖作用的强弱依次为OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中药复方促进CEF生长的量效关系

从试验结果还可以看出，4个中药复方在高浓度（1 000.00 μg/mL）时对细胞生长均起抑制作用，随着浓度的降低，表现出促进生长的作用，但这种促进增殖的作用在达到峰值后又逐渐减弱，说明中药复方促进细胞增殖要有合适的浓度[15]。

本试验中OM-APS有8 个浓度、OM-APS-GP有7 个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 个浓度对CEF增殖率达到了10%以上，在前面的试验中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 个浓度达到10%以上，说明复方促进细胞生长作用优于单体，发挥了协同作用，这和王德云等的研究结果[16-17]一致。

参考文献：

[1]韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用[J]. 兽药与饲料添加剂，2006，11（2）：19-22.

[2]龚晓明，吴耀妹. 免疫佐剂研究的现状与趋势[J]. 中国兽药杂志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振環，胡元亮，马霞，等. 硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 南京农业大学学报，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陈玉库，邢玉娟，蔡丙严，等. 氧化苦参碱等七种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等. 7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J]. 中国兽医杂志，2011，9（9）：46-49.

[7]刘钊，杨占秋，肖红，等. MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J]. 武汉大学学报：医学版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]许斌，周双宬，黄玉仙，等. 氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒学报，2006，22（5）：369-374.

[9]程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州：华南理工大学出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，刘家国，等. 黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对新城疫病毒感染细胞的影响[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J]. 南京农业大学学报，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，莱因万德L A.细胞实验指南：上册[M]. 黄培堂，译.北京：科学出版社，2001.

[13]辛华. 细胞生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2001.

[14]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孙峻岭，等. 复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J]. 中国兽医学报，2006，26（2）：194-196.

[17]孙峻岭，薛家宾，胡元亮，等. 中药成分复方的佐剂作用及其与中药复方的功效比较[J]. 南京农业大学学报，2005，28（4）：109-112.金穗华，王振云，李慧. 家畜精子形态的判别与描述[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：152-156.

鸭胚成纤维细胞培养技术的改良 第4篇

1 材料与设备

1.1 材料

Hanks液;胰蛋白酶;DMEM高糖培养基购自Sigma公司 (USA) ;胎牛血清购自Hy Clone公司 (USA) ;11日龄非免疫受精鸭胚, 购自四川省原种鸭场。

1.2 设备

荧光倒置显微镜 (Olympus IX71, Japan) ;CO2培养箱 (Thermoforma USA) ;25 m L细胞培养瓶购自Corning公司 (USA) 。

2 方法

2.1 原代鸭胚成纤维细胞的制备

2.1.1 取胚体

取10~13日龄的鸭胚1~2个, 用照蛋器逐个观察, 画出气室, 取发育良好的活胚, 气室朝上置于蛋盘内, 分别用碘酒酒精棉球消毒蛋壳。

常规法将胚体剪去掉头、颈部前1/3、内脏和四肢, 放入平皿内, 直接用HANKS液冲洗2~3次 (洗去血液及黏性物质) 。

半胚法将胚体剪去眼睛和内脏团, 放入平皿内, 其他同常规法。

全胚法将胚体取出后, 直接用HANKS液冲洗, 不加处理。

2.1.2 剪切

用眼科剪将胚体在青霉素小瓶内充分剪碎为0.5~1mm, 用3倍体积的HANKS液反复洗涤2~3次至悬液清凉, 悬液用无尖的枪头洗出 (本步目的为洗去残余的血液) 。

2.1.3 消化

冷消化将盛有洗涤后的组织块倒入薄玻璃瓶, 加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液, 后将其放置4℃冰箱过夜 (或12~18 h) 。

热消化将盛有洗涤后的组织块倒入薄玻璃瓶, 加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液后, 直接放入37℃水浴锅中30min, 其间10 min轻轻混匀一次, 直至组织块边缘呈现絮状、蓬松茸毛状物时为止, 停止消化。

2.1.4 吹打

用无尖枪头尽可能地将胰酶洗弃, 加入预热的含2%小牛血清的DMEM液, 反复用10 m L的移液管吹打100~200次至匀浆, 加入含10%小牛血清的DMEM液, 静置2 min, 可以4层纱布过滤也可不过滤。

2.1.5 细胞记数

不过滤洗上清, 用CASY细胞活力记数仪或血球记数板记数后, 补加生长液, 使其细胞含量达1×106个/m L左右。

2.1.6 分瓶培养

按每瓶10~15 m L装入细胞瓶中, 置37℃恒温箱中静置培养。

2.2 继代鸭胚成纤维细胞的制备

倾去培养瓶中的营养液, 用预热的HANKS液润洗2~3次, 加入适量预热过的胰蛋白酶溶液, 左右轻轻晃动培养瓶, 发现细胞层有脱壁、裂痕或空洞现象时, 及时倾去胰蛋白酶, 加入适量生长液, 用枪头使劲吹打, 记数, 根据记数再分瓶培养。

2.3 观察细胞

观察细胞生长情况, 及时换液。

3 结果与讨论

3.1 三种取胚法对细胞生长情况的影响

三种取胚方法制备的单层细胞均以成纤维细胞为主, 但常规法制备的细胞产量低于半胚法和全胚法;全胚法和半胚法生产的细胞数量相差不大, 但全胚法中含有少量的肝细胞和细胞重叠现象, 而半胚法可以避免肝细胞可能带来的影响, 另外从生产工艺流程上, 半胚法减少了生产工序和被污染的机会, 因此建议使用半胚法来制备鸭胚成纤维细胞。细胞生长情况见表1 (本试验均取11日龄非免疫受精种鸭胚) 。

3.2 两种消化方法的比较

试验结果表明, 冷消化法生产的细胞数比热消化法要高20%左右。这是因为冷消化法时胰酶的活力较低, 而且作用时间长, 剪碎的组织块内外消化程度差不多;而热消化法消化时, 由于胰酶活力好, 作用时间短, 很容易造成组织块内外消化不一。虽然从细胞数量上考虑冷消化法优于热消化法, 但热消化法时间短, 容易操作者观察, 故实际操作中, 比较常采用热消化法。但是根据不同批次生产的胰酶活力和组织块大小, 应该灵活控制消化的时间, 不能死板地以消化30min为标准, 应该以组织块边缘呈现絮状、蓬松茸毛状物时为止, 停止消化。

3.3 过滤与不过滤对细胞生长的影响

过滤可以将骨、眼喙、内脏团和脚等过滤掉, 但由于纱布的吸水性太强, 会造成大量细胞的流失, 故一般不采用过滤的方法, 但是如果鸭胚日龄偏大, 在绒毛碎片存在的情况下, 建议应该考虑用纱布过滤, 因为绒毛碎片可能影响细胞的贴壁。

3.4 时间比常规方法大大缩短

由于采取半胚不过滤的制备方法, 使得制备细胞的时间比常规方法要缩短许多, 一般在实验室操作中, 采用2个鸭胚来制备鸭胚成纤维细胞只需要60 min左右, 大大缩短了细胞在外界暴露的时间, 也相对地提高了活细胞的比例。

备注:“+”常规法:肉眼可见比较致密的单层细胞, 显微镜下观察细胞贴壁生长良好, 细胞之间空隙少;“++”半胚法:肉眼可见致密的单层细胞, 显微镜下观察细胞贴壁生长良好, 细胞之间几乎无空隙;“+++”全胚法:肉眼可见致密的单层细胞, 显微镜下观察细胞贴壁生长良好, 细胞之间没有空隙, 但有极少量肝细胞和少量细胞重叠现象。

3.5 吹打次数对细胞的影响

在制备鸡胚成纤维细胞时, 吹打一般在50~100次, 而制备鸭胚成纤维细胞时, 最好吹打100~200次, 因为在制备好的原代鸭胚成纤维细胞中会有大量的巨大的团块存在, 虽然团块有利于细胞的生长, 但如果团块的体积太大, 会影响结果的观察;吹打100~200次, 可以避免巨大团块的生成, 将其吹打成一个个小团块, 易于观察。

3.6 原代与继代细胞的选择

由于团块和细胞生长状态的要求, 我们在试验中一般采用继1代的鸭胚成纤维细胞进行研究。但是鸭胚成纤维细胞不是传代细胞, 如果继代次数增多, 细胞的活力会受到很大的影响, 故继代不要超过3代。

3.7 对玻璃器皿和橡胶制品的处理

通过我们实验室多年试验观察, 除了通过用强酸处理细胞培养所用的玻璃器皿外, 洗洁精也可以作为细胞培养所用的玻璃器皿和橡胶制品的清洗剂, 洗洁精具有去油腻力强、过水容易, 对人体无害的优点。首先用洗洁精将实验材料泡1~2 d, 再先后用常水、蒸馏水和去离子水冲洗3~4遍即可。

成纤维细胞 第5篇

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的:建立在鸭胚成纤维细胞(DEF)中进行RNA干扰(RNAi)的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段.方法:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小于扰RNA(GFP-siRNA),用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒(Adv-GFP)介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果.结果:200 MOI(感染复数)Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31.20%+3.11%,对DEF的`活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98.56%.结论:在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段.

作 者：孟宇航 汤承 杨发龙 邓书 岳华 于学辉 MENG Yu-Hang TANG Cheng YANG Fa-Long DENG Shu YUE Hun YU Xue-Hui 作者单位：西南民族大学,生命科学与技术学院,四川,成都,610041刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：19(3)分类号：Q78 R394关键词：鸭胚成纤维细胞 RNA干扰 腺病毒载体 绿色荧光蛋白 鸭

乳腺恶性纤维组织细胞瘤1例 第6篇

[关键词] 乳腺；恶性纤维组织细胞瘤；免疫组化

[中图分类号] R737.9   [文献标识码] C   [文章编号] 2095-0616（2012）04-178-02

恶性纤维组织细胞瘤（m alignant fibrous histiocytoma，MFH）起源于中胚层，是一种侵袭性很强、发生于成人的软组织肉瘤，好发于四肢、手足末端、腹膜后，而原发于乳房者罕见，小于乳腺恶性肿瘤1%[1]，继发于放射治疗后亦罕见。国内外关于乳腺MFH报道均少见，且几乎为个案报道。笔者所在科室近日收治1例乳腺MFH，现报道如下。

1 临床资料

患者，女，48岁，既往体健，否认家族类似性疾病史。患者于2000年无意中发现左乳外上象限拇指大小无痛性肿块，与月经无明显关系，未予重视。2011年5月感肿块增至鸡蛋样大小，于13日行“左乳肿块切除术”。术后病理示：恶性纤维组织细胞瘤，腋窝淋巴结5枚无转移。术后未行放化疗。术后1个月后发现左乳切口处一无痛性肿块，大小约2 cm×2 cm×1 cm，穿刺细胞学涂片见大量梭形细胞，部分细胞体积增大，核仁易见，提示：恶性肿瘤细胞。于2011年6月24日行“左乳复发肉瘤扩大切除术+植皮术”。术后病理诊断：恶性纤维组织细胞瘤复发。免疫组化示：Vimentin（+），Cytokeratin（-），CD68（+），Actin（-）。术后半个月，发现左乳切口植皮区出现多枚大小不等肿块，最大约4 cm×3 cm×0.5 cm，最小约1 cm×1 cm×1 cm，质韧，无压痛，与周围组织分界尚清，右乳未及包块。入笔者所在科室后行CT示：胸壁软组织内多发团块状软组织密度影，纵隔内多发淋巴结影，肝实质多发低密度影。予“异环磷酰胺+顺铂+表柔比星”化疗1周期后病情无明显缓解，患者因经济原因未继续治疗，1个月后死亡。

2 讨论

MFH这一概念作为独立的临床病理学概念，最先由O'Brien和Stout[2]于1964年描述。MFH是最常见的软组织肉瘤，占所有软组织肿瘤的20%～24% 。通常发生于四肢骨端占70%～75%，下肢约59%，仅次于腹膜后，发生于乳房者极罕见。文献表明[3]，MFH起源于成纤维细胞或原始间叶细胞，其真正发病率不清楚，缘于其容易同其他肉瘤相混淆。乳腺MFH术前诊断较困难，据以往的文献报道[4]，MFH乳房X线摄影显

示高密度影且不伴有钙化；CT扫描表现可见肿瘤多团块状软组织密度影，内可伴坏死；超声通常表现为不均质低回声，伴坏死[5]。影像学检查不具有特异性，确诊有赖于组织学及免疫组化。但有学者认为，针吸细胞学检查可因经皮穿刺针吸活检多数吸出坏死组织或者组织过少而不能诊断[6]。镜下见：结节无包膜，由梭形、短梭形纤维母细胞样瘤细胞构成，呈编制状、车幅状排列，部分瘤细胞胞浆丰富、红染，见较多散在多核瘤巨细胞，核分裂易见。免疫组织化学提示MFH可出现波形蛋白、CD68等的表达。乳腺MFH生长迅速、侵袭性强、恶性程度高，容易局部复发和转移，其中复发率可达到44%，转移率42%[7]。主要通过血行转移到肺（82%）、骨骼、胸膜、肝脏，腋窝淋巴结转移不多见[4,8-9]。当出现淋巴结累及时，表明疾病出现广泛播散。

乳腺MFH尚缺乏公认一致的治疗方法，可在广泛切除病灶基础上联合放化疗[10]。手术方式可有改良式乳房根治性切除术和腋窝淋巴结清扫。术后放疗在减少局部复发中可能起很重要的作用。化疗的作用仍存争议，以表阿霉素、异环磷酰胺和氮烯咪胺等为主。

乳腺MFH的预后较差，中位生存期为58个月[11]，与患者年龄、肿瘤部位、大小、浸润程度、细胞异型性、核分裂多少、Ki-67增殖指数密切相关，其中病理类型、肿瘤大小与分期、治疗方式是影响患者预后的主要因素[12]。本例患者生存期短，复发、进展快，化疗耐药。更为有效的治疗方法诸如靶向治疗等需有待于进一步研究和探索。

[参考文献]

[1] Ajisaka H，Maeda K，Uchiyama A，et al.Myxoid m alignant fibrous histiocytoma of the breast：report of a case[J].Surg Today，2002，32：887-890.

[2] O'Brien JE，Stout AP.M alignant fibrous xanthomas[J].Cancer，1964，17（1）：1445-1455.

[3] 薛瑞峰，方志伟.恶性纤维组织细胞瘤研究进展[J].实用肿瘤杂志，2011，26（3）：311-313.

[4] Yao MS，Chan WP，Chen CY，et al.M alignant fibrous histiocytoma of the female breast：a case report[J].Journal of Clinical Imaging，2005，29：134-137.

[5] Leicher-Dubera，Duber C，Thelen M.M alignant fibrous histiocytoma[J].ROFO Fortschr Rontgenstr，1988，149：580-586.

[6] Li YT，Li HP，Fan ZL，et al.Diagnosis and treatment of 21 casens of m alignant fibrous histiocytoma[J].Clin Med Chin，2005，21（7）：634-635.

[7] Kaswan S，Gatmaitan PT，Garquilo GA.Primary m alignant fibrous histiocytoma of the breast[J].Am Surq，2009，75（1）：81-82.

[8] Tamir G，Nobel M，Hauben DJ，et al.M alignant fibrous histiocytoma of the breast[J].Eur J Surg Oncol，1995，21：210-211.

[9] Kurian KM，Al-Nafussi A.Sarcomatoid/metaplastic carcinoma of the breast：a clinicopathological study of 12 cases[J].Histopathology，2002，40（1）：58-64.

[10] 刘建，任宏轩.腹膜后炎症型恶性纤维组织细胞瘤l例[J].临床肿瘤学杂志，2011，16（4）：379-380.

[11] 王姿, 李志平.恶性纤维组织细胞瘤治疗及预后的研究现状[J].临床肿瘤学杂志，2011，16（1）：82-85.

[12] Blanchard DK，Reynolds CA，Grant CS，et al.Primary nonphylloides breast sarcomas[J].Am J Surg，2003，186：359-361.

成纤维细胞 第7篇

大量优质的种子细胞是组织工程和细胞治疗的基础。自体细胞具有体内移植后不引起免疫排斥反应, 是目前组织工程研究中应用最为广泛的一种细胞来源[2,3]。但自体细胞来源有限, 在体外难以大量扩增, 并且存在体外培养后性状改变等现象。静止贴壁培养方法为细胞体外生长提供的表面积有限, 由于细胞间的接触性抑制, 细胞生长速度较慢, 还需要消化传代等操作, 很难在较短的时间内得到足够的细胞。在对微载体和生物反应器三维培养细胞的研究过程中, 新的培养方法的优势渐渐被人们所认识[4]。利用微载体在旋转发生器 (RCCS) 中培养组织工程种子细胞, 由于有更大的可贴壁表面积, 解决了传统培养中接触抑制的问题, 从而可获得更多细胞。 同时, 悬浮状态下, 细胞营养混合更均匀, 细胞生长状况均一, 因而细胞生长速率快[5,6]。目前, 微载体生物反应器已经在骨组织、肝细胞等[7,8]体外培养中应用于贴壁细胞及微生物的大规模培养, 并已经成功应用于组织工程种子细胞的扩增。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

微载体 Cytodex- 3 (GE Healthcare公司, USA) ; 旋转发生器 (Synthecon公司, USA) ; DMEM 培养基、胎牛血清、胰酶 (Dako 公司, USA) ; 二甲基亚砜 (DMSO, 杭州四季青) 、平底6孔培养板 (Nunc 公司, USA) ;倒置相差显微镜及照相系统 (Olympus 公司, JPN) ;流式细胞分析仪 (Coulter 公司, USA) ; 70 μm细胞筛网 (Falcon 公司, USA) ;扫描电子显微镜 (Hitachi 公司, S- 3400, JPN) 。

1.2 人皮肤成纤维细胞 (hDFBs) 的分离培养及扩增

取新生儿包皮组织, 将其切成2 mm×5 mm 的条块, 在4 ℃下用含100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素的PBS 浸泡冲洗, 修剪多余的脂肪和肌肉组织, 用质量浓度2.5 g/L胰酶4 ℃消化, 机械分离表皮层和真皮层, 将真皮层吹散, 收获其中的成纤维细胞, 接种于培养瓶中, 用含100 ml/L 胎牛血清的DMEM 培养液扩大培养并传代, 取3～5 代生长良好的成纤维细胞使用。

1.3 DIO 标记人成纤维细胞

细胞示踪剂细胞膜绿色荧光探针DiO是一种亲脂性膜染料, 可以与磷酯双层膜结合后逐渐使整个细胞的细胞膜被染色, DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱, 仅进入到细胞膜后才可以被激发出很强的绿色荧光。DiO的激发光谱和发射光谱最大激发波长为484 nm, 最大发射波长为501 nm。在25 ℃条件下, 用质量浓度2.5 g/L 胰酶消化对数期生长的细胞, 用PBS洗涤2 遍, 离心5 min, 小心吸去上清液, 加入2 ml无血清DMEM培养液, 避光环境下加入浓度100 μmol/L的DIO溶液100 μl, 吹打均匀, 置37 ℃ 10 min后离心, 用含血清DMEM洗涤2 遍后制成细胞悬液。吸取100 μl悬液在荧光显微镜下检查标记的成纤维细胞染色效果和荧光强度, 并观察细胞的活力。

1.4 Cytodex- 3 微载体和旋转发生器的预备

Cytodex- 3 微载体的最适宜培养密度为5 g/L。按照实验设计, 称取数份0.1 g 和0.3 g Cytodex- 3 微载体, 用不含钙镁离子的PBS 室温浸泡3 h使其充分膨胀湿化, 小心吸取去除上清液, 再用PBS清洗3 次。高压蒸汽灭菌 (15 min, 115 ℃) , 浸泡于DMEM中置4 ℃冰箱备用, 使用前用温热的培养液再次冲洗。

选用的RCCS为55 ml容积的高截面纵横比容器 (high aspect ratio vessel, HARV) , 将各部件拆卸分解, 用去离子水清洗并浸泡过夜, 组装结合, 检查可靠性后打包, 高压蒸汽灭菌 (105 ℃, 30 min) 备用。

1.5 建立旋转发生器微载体培养体系

将预备好的0.3 g Cytodex- 3 加入旋转发生器, 加入30 ml含10% 胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养基。加入5×105 个DIO标记的成纤维细胞, 将旋转发生器加满上述培养液, 使用5 ml注射器抽排气体后关闭换液口开关。旋转发生器放入37 ℃孵箱中静置, 前10 h间断性转动 (每2 h转动1 min) , 使细胞与微载体充分接触、贴附。10 h后持续转动, 调整旋转发生器旋转速度, 使微载体能悬浮到培养液中。培养期间隔天换液, 换液前将旋转发生器静置1 h, 使微载体沉淀, 小心吸取上清后加入新鲜培养液, 每次换液量为20 ml。

1.6 扫描电镜观察细胞形态

样品先以PBS冲洗, 再以2%戊二醛37 ℃固定2 h, 然后以PBS轻柔清洗, 四氧化锇再固定。继以梯度酒精脱水 (50%、60%、70%、80%、90%、99%) , 再用乙酸异戊脂置换4 h以上, 临界干燥器干燥后真空喷溅铂金离子, 扫描电子显微镜观察。

1.7 细胞体外扩增的倍增时间计算

计算细胞倍增时间 (t) 。 t= (TN2-TN1) /log2 (A2/A1) 。公式中TN2 和TN1表示某次测量细胞数的时间差。A2:细胞培养终末点细胞数。A1 :细胞培养起始点细胞数。

1.7.1 平面单层培养细胞的倍增时间计算

采用常规培养方法, 接种5×105 个人成纤维细胞, 在细胞约80%汇合时传代, 至第6 天时消化获取所有细胞。倒置显微镜下血细胞计数器直接数细胞个数, 每样本3 个象限。

1.7.2 微载体旋转培养细胞的倍增时间计算

取出RCCS中全部微载体, 沉淀, 小心吸取出培养基, 再用pH7.6、含0.02% (质量体积比) 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的无Ca离子、Mg离子的PBS洗微载体5 min。弃去溶液, 加入胰蛋白酶, 37 ℃孵育, 间断搅动。15 min后, 加入含血清的培养基中止胰蛋白酶的作用。此时微载体上附着的细胞已经脱落。再通过70 μm细胞筛网过滤, 将微载体与细胞悬液分离。倒置相差显微镜下血细胞计数器直接计数, 每样本3 个象限。

1.8 流式细胞仪细胞增殖周期检测

hDFBs在RCCS中与常规平面培养环境下分别培养7 d, 微载体上细胞按照1.7.2中方法获取。待测细胞使用PBS漂洗后, 70%乙醇固定, 制成单细胞悬液, 存4 ℃ 冰箱。上机前0.5 h加碘化丙啶DNA染色。用流式细胞仪进行DNA分析, 经荧光光通量积分后得到DNA含量分布曲线, 计算增殖指数 (proliferation index, PI) , PI= [ (S+G2/M) / (G0/G1+S+G2/M) ]×100%。

1.9 统计学方法

数据以undefined表示。采用SPSS 13.0 软件进行统计分析, 行配对t检验。

2 结 果

2.1 倒置相差显微镜观察细胞在RCCS中生长情况

接种24 h后, 大部分细胞贴附于微载体表面, 培养液中只有少量散在细胞。微载体在培养液中均匀分布, 未发生粘连。随着培养时间增加, 微载体表面的细胞数量逐渐增多, 第5 天时, 多数微载体几乎长满细胞。大体观察悬浮微载体被增殖细胞粘结形成逐渐增大的颗粒时, 需要视颗粒大小加大旋转反应器旋转速度, 使微载体能够在培养基内悬浮生长, 不沉积也不与四周碰撞。

2.2 荧光显微镜观测

细胞接种后1 d, 可见微载体表面有细胞贴附, 有少量微载体上未贴附细胞。接种后3 d, 微载体表面细胞数量明显增加, 细胞分布比较均匀, 细胞形态伸展, 围绕微载体紧密贴附 (图 1a) 。接种后7 d, 可见微载体表面细胞密集, 数个微载体微粒聚合 (图 1b) 。

2.3 扫描电镜观测

接种后3 d, 微载体表面的细胞呈长梭形, 伸展后包裹住微球, 只有极少数未完全伸展, 细胞外基质较少 (图 2a、 b) 。接种后7 d, 微载体表面细胞密集, 大多数细胞呈半球形相互接触, 少数呈多角形以及不规则形, 完全包裹住微载体表面, 并分泌大量细胞外基质, 使微载体颗粒聚合成团块状 (图 2c、d) 。

2.4 细胞体外扩增的倍增时间

常规培养组hDFBs倍增时间为 (3.43±0.42) d, RCCS培养组hDFBs倍增时间为 (2.99±0.50) d (P<0.05) 。

2.5 流式细胞仪检测细胞周期

本研究结果显示 (表 1) , 经RCCS微载体系统培养的细胞组表现为G2+S期细胞数明显增加。普通重力环境下G2+S期细胞相对较少, 而细胞多数处于G0/G1期。两者之间PI值差异有显著性 (P<0.05) (图 3a、b) 。

a: 第3 天; b: 第7 天, 标尺为100 μm

a: At day 3; b: At day 7, Scale bar=100 μm

3 讨 论

常规的平皿接种传代培养方法是二维培养模式, 细胞增殖速度慢, 效率低, 不便于规模化培养。微载体培养法在细胞的规模化扩增方面取得了一定的成功。Ven Wezel 于1967 年最先使用微载体技术进行细胞培养, 经过三十余年的发展, 该技术目前已渐趋完善和成熟, 并广泛应用于体外细胞培养[9]。微载体技术培养细胞最显著的优点是其具有极高的比表面积, 例如:1g Cytodex- 3微载体的总表面积约为4600 cm2, 可置于100 ml生物反应器中培养细胞, 而普通培养瓶仅能提供约35 cm2的培养面积[10]。所以利用微载体技术培养效率高, 能在较小的培养空间内收获大量的细胞。此外, 微载体技术还有以下优点: (1) 兼有单层培养和悬浮培养的优点, 且是均相的三维培养, 细胞所处的环境均一; (2) 延长细胞的对数生长期; (3) 环境温度、pH值条件等容易调节和监控; (4) 培养操作便于系统化自动化, 减少污染[11]。

本研究中, hDFBs在微载体表面贴附生长, 培养初期, 细胞保持长梭形外观, 这与常规平皿培养所得的hDFBs的外观一致。在培养进入第6 天后, 形态变为扁圆形和不规则形, 细胞密度远远高于平面培养组, 而且保持着很高的增殖能力。在RCCS培养的后期, 细胞被大量细胞外基质包围, 细胞与细胞之间有着更加贴近体内环境下的生物学状态。

a: 第3 天 (×800) ; b: 第3 天 (×400) ; c: 第7 天 (×900) ; d: 第7 天 (×500)

a: At day 3 (×800) ; b: At day 3 (×400) ; c: At day 7 (×900) ; d: At day 7 (×500)

(±s, %)

a: 常规培养组; b: RCCS组

a: hDFBs cultured in culture plate; b: hDFBs cultured in RCCS

使用微载体在RCCS中旋转培养细胞, 获得比在普通培养方式更高的细胞培养密度和细胞增殖活性, 最终更表现在了极高的细胞群体增殖速度。因此, 微重力环境中微载体法培养hDFBs能在相同的时间内收获更多的细胞, 利于规模化获取组织工程的种子细胞。

参考文献

[1]Rheinwald JG, Green H.Serial cultivation of strains of hu-man epidermal Keratinocytes:The formation of keratinizingcolonies from single cells[J].Cell, 1975, 6 (3) :331-343.

[2]Lamme EN, Van Leeuwen RT, Brandsma K, et al.Highernumbers of autologous fibroblasts in an artificial dermal sub-stitute improve tissue regeneration and modulate scar tissueformation[J].J Pathol, 2000, 190 (5) :595-603.

[3]Wisser D, Steffes J.Skin replacement with a collagen baseddermal substitute, autologous keratinocytes and fibroblasts inburn trauma[J].Burns, 2003, 29 (4) :375-380.

[4]Ng KW, Leong DT, Hutmacher DW.The challenge to meas-ure cell proliferation in two and three dimensions[J].TissueEng, 2005, 11 (1-2) :182-191.

[5]Navran S.The application of lowshear modeled microgravityto 3-D cell biology and tissue engineering[J].《BiotechnolAnn Rev, 2008, 14:275-296.

[6]Botchwey EA, Pollack SR, Levine EM, et al.Quantitativeanalysis of three-dimensional fluid flow in rotating bioreac-tors for tissue engineering[J].J Biomed Mater Res, 2004, 69 (2) :205-215.

[7]Song KD, Liu TQ, Li XQ, et al.Three-dimensional expan-sion in suspension culture of SD rat's osteoblasts in a rotatingwall vessel bioreactor[J].Biomed Environ Sci, 2007, 20 (2) :91-981.

[8]Okamura A, Zheng YW, Hirochika R, et al.In-vitrorecon-stitution of hepatic tissue architecture with neonatat mouseliver cells using three-dimensional culture[J].J NanosciNanotechnol, 2007, 7 (3) :721-725.

[9]Malda J, van Blitterswijk CA, GrojecM, et al.Expansion ofbovine chondrocytes on microcarriers enhances redifferentia-tion[J].Tissue Eng, 2003, 9 (5) :939-948.

[10]单建林, 许建中, 周强, 等.微载体技术体外扩增人骨髓间充质干细胞[J].中国矫形外科杂志, 2004, 12 (15) :1158-1160.

成纤维细胞 第8篇

一般而言, 对细菌具有强大杀灭或抑制作用的抗菌单体对正常细胞也有不可忽视的毒副作用。即便是临床上常用的无抗菌活性的树脂单体, 如Bis- GMA, HEMA等, 其细胞毒性或致敏性也早已被人们重视[6,7,8,9], 因此, 有必要对自行合成的季铵盐型抗菌单体进行生物安全性评价。本研究采用噻唑蓝比色法 (MTT法) 检测该抗菌单体的体外细胞毒性, 依此初步评价其生物相容性。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 季铵盐抗菌单体

甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化铵 (DMAE- CB) (图 1) 。

1.1.2 细胞株

小鼠成纤维细胞株L929由第四军医大学组织工程中心提供。实验用细胞为传代48 h生长旺盛的细胞, 用细胞培养液配置为1×104 个/ml的细胞悬液。

1.1.3 实验试剂与仪器

1640培养液、2.5 g/L胰蛋白酶 (Gibco, 美国) ;25 %胰酶消化液 (Difco, 美国) ; MTT:3 - (4, 5 - 二甲基噻唑基- 2) - 2, 5二苯基四氮唑溴盐、DMEM培养基 (Sigma, 美国) ;DMSO:二甲基亚砜 (西安化学试剂厂) ;Model- 550 酶联免疫酶标仪 (Bio- Rad, 美国) ;YJ2875DA 型超净工作台 (苏净集团安泰公司) ;微量加样器 (Nichikyo, 日本) ;ER2182A电子分析天平 (A&D, 日本) ;CO2孵箱 (Heraeus, 德国) ;IX- 70 倒置相差显微镜 (Olympus, 日本) ;96孔细胞培养板 (Coster, 美国) 。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌单体溶液的配制

以DMEM培养基为溶剂, 配制浓度分别为100、60、40、20、10、5、2、1、0.5 μg/ml 的DMAE- CB溶液。

1.2.2 MTT测定

MTT比色法参照国家标准GB/T 1688615-1997“医疗器械生物学评价第五部分:细胞毒性试验体外法”进行。具体方法如下:

将细胞悬液接种于96 孔培养板, 每孔100 μl, 置于37 ℃、 5 ml/L CO2、饱和湿度的空气培养箱内培养24 h以使细胞贴壁, 每个实验组6 孔。24 h后吸弃原培养液, 用PBS洗涤2 次, 各浓度实验组分别加入抗菌单体溶液50 μl、含100 ml/L小牛血清的DMEM培养基50 μl, 空白对照组加含100 ml/L小牛血清的DMEM培养基100 μl, 阳性对照组加入100 μl二甲基亚砜。然后放入上述环境中培养48 h后终止培养。每孔加入50 μl DMEM培养基和浓度为5 mg/ml的MTT 50 μl, 培养4 h后终止反应, PBS清洗2 遍, 每孔加入100 ml/L二甲基亚砜200 μl, 振荡5 min, 用Bio- Rad550 酶标仪在490 nm波长下测定每孔的A值[10]。

1.2.3 细胞毒性评价

细胞相对增殖率 (relative growth rate, RGR) :以空白对照组的A值为100%细胞存活率, 各浓度组RGR=实验组A值/空白对照组A值×100%。根据RGR换算细胞毒性级 (cytotoxical grade, CG) , 共分5 级, 即RGR ≥ 100%, 毒性为0 级;RGR为75%～99%, 毒性为1级;GR为50%～74%, 毒性为2 级;RGR为25%～49%, 毒性为3 级;RGR为1%～24%, 毒性为4级;RGR为0, 毒性为5 级。结果评价:实验结果为0或1 级反应, 为合格;实验结果为2 级反应, 应结合细胞形态分析综合评价;实验结果为3～5 级反应, 为不合格。同时以相对增殖率计算抗菌单体的半数致死浓度LC50 (Median lethal concentration) 。

1.2.4 细胞形态观察

在倒置相差显微镜下观察空白对照组及LC50值附近浓度的细胞增殖情况。

1.2.5 统计分析

应用SPSS 13.0统计软件, 进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 MTT比色结果

各实验组RGR数值及毒性分级结果见表 1及图 2。在所设立的浓度梯度内, 浓度为2 μg/ml时, 毒性反应分级即已为2;超过此浓度时分级在3～4级;浓度为1 μg/ml及0.5 μg/ml时, 分级分别为1和0 级。抗菌单体浓度在100、60、40、20、10、5、2 μg/ml时, 细胞的相对增殖率与空白对照组之间均存在显著性差异 (P<0.05) 。依据相对增殖率计算得到抗菌单体的LC50为3.02 μg/ml, 与空白对照组间存在显著性差异 (图 2) 。

2.2 细胞形态观察

空白对照组细胞形态良好, 细胞折光性强, 大部分细胞为长梭形和多角形, 并可见圆形分裂细胞, 表明细胞生长旺盛。而在抗菌单体溶液浓度为2 μg/ml时, 细胞数目明显减少, 细胞形态不规则;而在抗菌单体溶液浓度为5 μg/ml时, 细胞数目更加稀少, 多数细胞形态严重受损, 视野内可见细胞死亡后残存的碎片。

注:含相同小写字母的组间无显著性差异 (P>0.05)

A: 空白对照组细胞形态良好, 细胞折光性强, 大部分细胞为长梭形和多角形, 并可见圆形分裂细胞, 表明细胞生长旺盛; B: 抗菌单体溶液浓度为2 μg/ml时, 细胞数目明显减少, 细胞形态不规则; C: 在抗菌单体溶液浓度为5 μg/ml时, 细胞数目更加稀少, 多数细胞形态严重受损, 视野内可见细胞死亡后残存的碎片

A: In the control group, the mouse fibroblast L929 had good shape and strong light refraction, presented long fusiform or polygon. The presence of round dividing cells showed their vigorous growth; B: The number of mouse fibroblast L929 decreased significantly, and the cell shape became irregular when the concentration of the monomer was set at 2 μg/ml; C: The number of mouse fibroblast L929 was smaller, and the shapes of majority of the cells were seriously injured, when the concentration of the monomer was set at 5 μg/ml

3 讨 论

细胞毒性试验是医用生物学评价体系中重要的检测指标之一, 几乎是各种医疗器械和医用材料临床应用前的必测项目。目前国内外常用的细胞毒性检测方法很多, 如琼脂覆盖法、细胞相对增殖率法, 噻唑蓝比色法等。由于噻唑蓝比色法 (MTT法) 较灵敏, 结果客观且重复性好, 所以被人们广泛应用于细胞毒性评价[11]。

目前临床上常用的树脂单体, 如Bis- GMA, HEMA等, 作为单体形式存在时均表现出较大的细胞毒性。Ratanasathien等[12]研究了常用于牙本质粘接系统的3 种单体对小鼠成纤维细胞Balb/c 3T3细胞系的细胞毒性, 结果表明, 单体双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯 (Bis- GMA) 的细胞毒性最大, 对小鼠成纤维细胞的半数致死浓度LC50=4.79 μg/ml, 其次是氨基甲酸酯双甲基丙烯酸酯 (UDMA) 的细胞毒性, LC50=8.68 μg/ml, 双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯 (TEGDMA) 的细胞毒性第三, LC50=35.7 μg/ml。甲基丙烯酸β- 羟乙酯 (HEMA) 的细胞毒性在所研究的4种单体中最小, LC50=468 μg/ml。Hanks等[13]报道了导致小鼠成纤维细胞Balb/c 3T3细胞系DNA合成能力降低50%时的单体浓度:Bis- GMA为6.66 μg/ml, UDMA为 5.98 μg/ml, TEGDMA为18.9 μg/ml。上述实验证明牙科常用单体的细胞毒性的大小顺序是:Bis- GMA﹥UDMA﹥TEGDMA﹥HEMA。但是, 上述结果均是体外实验, 并不能代表树脂基修复材料存在于口腔中的实际情况, 毕竟树脂材料固化后析出的单体量极其有限。最近有研究模拟口腔环境, 利用气相色谱/质谱技术定量测定了2 种复合树脂Tetric EvoCeram 和 Filtek Z250浸泡于唾液24 h后单体的析出量, 结果表明, 2 种材料中, HEMA的析出量均没有统计学意义, 而TEGDMA仅在Filtek Z250材料中有微量的溶出 (1.84 μg/cm-2) [14]。

本实验中, 依据相对增殖率计算得到抗菌单体DMAE- CB的LC50值为3.02 μg/ml, 与Bis- GMA的细胞毒性相似。理论上讲, Bis- GMA作为树脂基材料的基质, 在牙科修复材料的成分构成中, 用量远大于作为功能单体的抗菌单体的添加量。因此, 将这种抗菌单体加入到牙科树脂类材料当中并不会增大树脂材料的细胞毒性。此外, 国际上目前唯一已被应用于临床的抗菌单体MDPB在体外对人牙髓细胞的LC50值介于20～40 μg/ml之间, 与TEGDMA的细胞毒性类似。本课题组的前期研究证实DMAE- CB对7 种口腔细菌的MBC值介于1.2～9.6 μg/ml之间, 小于MDPB (MDPB对数种口腔常见致病菌的MBC值介于31.3～62.5 μg/ml之间[15]) 。

成纤维细胞 第9篇

磁小体表面的脂膜可选择性修饰,以磁性固载各种生物细胞,可使细胞磁性增强,可应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学方面。外包有膜的磁小体与人工磁粒相比,具有颗粒小,均匀、不聚集等优点,同时膜上蛋白质的存在又使它能更好的结合受体,适合人体的生理需要,因而在医疗卫生上具有极大的开发利用价值。目前对一些疑难杂症,特别是癌症的治疗,还存在许多问题,其中最突出的就是毒副作用,无论是生物疗法还是化学疗法,在攻击癌细胞的同时往往也伤及正常细胞,倘若能把药物或抗体固定在磁小体上,就可使磁微粒在外部磁场的诱导下,直接轰击靶区[5]。本实验通过MTT测定法观察大鼠L929成纤维细胞与磁小体作用后的生长情况,判断不同浓度磁小体对细胞的毒性和生长抑制作用,为其进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

倒置显微镜(OLYMPUS CK40,日本),超净工作台(北京半导体设备一厂),水套式培养箱(2123TC,美国),酶标仪(MK3,芬兰),离心机(LD4-2,北京)。

1.2 实验材料

大鼠成纤维(L929)细胞:由天津市医药科学研究所惠赠; 磁小体由天津大学材料科学与工程学院提供;液氮冻融消毒后使用。

1.3 主要试剂与耗材

RPMI1640培养液(GIBCO),标准胎牛血清(TBD),每毫升含100U的青霉素和链霉素,4℃保存,青霉素(齐鲁制药厂),链霉素(大连美罗大药厂)L-谷氨酰胺(Sigma),PBS(灏洋生物公司),噻唑兰(Sigma),DMSO(天津市瑞金特化学品有限公司),96孔培养板(GIBCO)。

1.4 方法步骤

1.4.1 磁小体无菌处理:

将磁小体置于液氮中24h。再将其分为1号和2号,分别接种于血平皿中35℃培养箱培养48h。观察结果:1号无细菌生长,2号有细菌生长。取1号管中的磁小体进行实验。

1.4.2 细胞播种:

将大鼠L929成纤维细胞传代扩增,加入20%血清,2mmol/L谷氨酰胺及100U/mL青链霉素的1640培养基,置于培养箱中培养。待细胞生长接近100%融合,用0.25%胰蛋白酶消化细胞层,用含20%血清2mmol/L谷氨酰胺及100U/mL青链霉素的1640培养基将细胞沉淀吹打均匀。调整细胞密度为4.9×104个/ml,于96孔培养板中每孔播种4.9×103个细胞,共设3个实验组别:(1)细胞阴性对照组4孔;(2)不加细胞的空白对照组4孔;(3)加入浓度为0.1mg/ml,0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 1.3mg/ml的磁小体共培养的细胞组各4孔。

1.4.3 磁小体加入:

培养24h后,分别向各试验孔中加入0.1mg/ml,0.5mg/ml,1.0mg/ml,1.3mg/ml的磁小体溶液,每种浓度加4孔,剩余1排(4孔)作为空白细胞对照,并在培养板周围孔中加入无菌的PBS保持湿润,然后置于37℃、CO2培养箱中,让磁小体与鼠L929细胞分别作用24、48、72h后取样做MTT检测。

1.4.4 MTT检测:

依次在96孔板各组别板孔中加入MTT溶液,在37℃、CO2培养箱中孵育4h后,吸出上清弃去(注意吸取上清时切勿把孔板底部的颗粒吸出)。每孔加入DMSO 150μl,快速震荡5min,调整酶标仪波长为560nm,测量吸光度,并按下式分别求出不同浓度磁小体对细胞的抑制率:抑制率=(空白细胞MTT值-实验组MTT值)/空白细胞组MTT值。

2 结果与分析

2.1 磁小体加入细胞后细胞形态学观察结果

如图1图2所示:细胞生长良好,细胞胞体较长呈长梭形,呈漩涡式密集生长。镜下黑色物质为磁小体颗粒,镜下观察磁小体颗粒与细胞不在同一观察平面。各孔加入MTT后,可见有针状蓝紫色结晶出现,即甲瓒(Formazan),加入DMSO振荡后,结晶溶解,但磁小体仍为黑色颗粒,未见有明显的变化。

2.2 MTT数据统计处理结果

实验结果见图3。结果以$\overline{x}\pm s$表示,采用方差分析和t检验判定差异显著性(不同浓度磁小体对大鼠L929细胞生长增殖的影响)。

2.3 磁小体对L929细胞的抑制率检测

将不同浓度磁小体在加入到96孔板培养后计算所得磁小体对细胞抑制率,在鼠L929细胞中加入不同浓度的磁小体24、48、72h后对细胞的抑制率,见表1。

注:计算公式为:抑制率=(空白细胞OD值-实验组OD值)/空白组OD值。

3 讨论

应用MTT法检测磁小体毒性是一种简便、有效经济的方法。国外许多学者报道用MTT检测法检测细胞活性,并认为用MTT法可代替活细胞计数,同位素标记进行细胞毒性试验[6]。然而影响MTT法的测定结果的因素也很多,接种细胞的数量、培养时间的长短、甲瓒溶解缓冲液的种类等都直接影响测定结果。本实验采用MTT法检测细胞成活率从而观察磁小体对细胞的毒性作用,通过MTT法检测判定细胞增殖生长的情况。间接反应了磁小体的毒性。实验所用磁小体是将其溶于水中加入培养液中观察其对细胞增殖的影响,通过观察实验结果,磁小体浓度为0.1mg/ml,与细胞共培养24h时抑制率达到7.97%,其余3组浓度递增的组别抑制率都为负值,所有组别加入磁小体共培养48h和72h后抑制率均为负值。证明磁小体对细胞生长没有明显的抑制作用,对细胞无毒性。关于抑制率出现负值的原因可能与磁小体最外层的脂质成分与MTT和DMSO发生反应,被DMSO溶解从而产生吸光度有关,在前面数据表格中已经体现。通过统计学分析,不同浓度的磁小体与大鼠成纤维细胞共培养后,观察细胞成活率即MTT值未见明显降低,甚至出现MTT值增加的趋势。大鼠L929成纤维细胞在加入不同浓度磁小体共培养24、48、72h后,进行方差分析,培养24h后,无明显差异,在培养48和72h后有明显差异,由于磁小体最外层的脂质成分与MTT和DMSO发生反应,加入磁小体培养的细胞比空白细胞的吸光度更大。另外,由于细胞播种时计数细胞存在误差以及增殖活性的不同,因此方差分析具有差异性也可以得到解释。因此证明了磁小体对细胞生长无毒性。

根据本实验的数据结果显示磁小体对细胞生长无明显抑制作用,表明磁小体对大鼠L929细胞细胞无毒性。

参考文献

[1]肖春玲.趋磁细菌与磁小体研究(J).井冈山师范学院学报,2001,22(6):19-21.

[2]陈明杰,卫杨保.趋磁细菌及磁小体研究的回顾和展望(J).微生物学杂志,1995,1(15):53-57.

[3]李文兵,余龙江,周蓬蓬,等.趋磁细菌的磁小体(J).中国生物工程杂志,2005,25(7):21-27.

[4]谭晖,冯定五,肖松文.趋磁性细菌载体磁分离技术(J).国外金属矿选矿,2002,2:2-5.

[5]代群威,董发勤,王媛.趋磁性细菌的研究与应用现状(J).生物磁学,2004,4(4):33-36

成纤维细胞 第10篇

1 bFGF及其受体的一般生物特性

bFGF是由146个氨基酸组成的阳离子多肽, 等电点9.6, 对热和酸敏感, 与肝素有很强的亲和力。在人体心血管系统中, 它存在于心肌细胞、非心肌细胞的胞质、胞核和细胞外基质中, 血管内皮细胞 (vascular endothelial cell, VEC) 、平滑肌细胞 (smooth muscle cell, SMC) 、心肌细胞均有合成b FGF的能力。b FGF通过与特异性受体结合而发挥作用。FGF受体 (FGF receptor, FGFR) 可分为两类:一类为低亲和力的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan, HSPG) 受体, 另一类为高亲和力的跨膜性酪氨酸蛋白激酶受体。目前已确定4种高亲和力受体:FGFR-1, FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4, 其中FGFR-1与b FGF亲和性最高, 也是b FGF发挥作用的主要受体。FGFR-1是存在于胚胎和成年心肌中的惟一高亲和性受体。b FGF和HSPG先结合是FGFR-1转导b FGF信号的前提条件, 因此b FGF对靶细胞的生物学效应是通过双受体系统介导的。bFGF与FGFR结合后, 激活受体的酪氨酸激酶活性, 引起细胞内一系列蛋白磷酸化, 导致PKC、MAPK的激活而促使信号向核内转导, 进而发挥b FGF的生物学效应[1,3]。

2 bFGF与动脉粥样硬化的关系

动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是冠心病的基础病因。研究发现bFGF在AS的早期、纤维脂斑期及进展期斑块中都有表达。不稳定型心绞痛和再狭窄患者AS斑块中的bFGF mRNA表达高达80%和100%, 直接使用b FGF, 也引起了AS性病变的出现。

以上结果表明bFGF与AS的发生、发展有密切关系。目前认为: (1) 与AS形成密切相关的一些细胞如VEC、VSMC等均可产生bFGF, 且AS斑块中死亡的细胞也可释放b FGF。 (2) 内皮损伤暴露其下的ECM, 促使储存的bFGF释放。 (3) bFGF对VEC和VSMC均有很强的促丝裂作用, 可刺激其增殖和移行, 促进损伤血管内皮再生修复[4]。 (4) bFGF致新生血管形成, 有利于为AS斑块的动脉提供营养。总之, 该因子与AS的形成与发展的确切关系复杂, 尚待进一步研究。

3 bFGF对急性心肌梗死和慢性心肌缺血的影响

对bFGF的研究发现, 急、慢性心肌缺血时, 新生毛细血管明显增多, bFGF和FGFR-1表达增加, 尤其在梗死边缘区的心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞中含量较高[5];国内外许多学者分别在猪、大鼠等动物模型上证实:从mg到μg量的bFGF均促进冠状动脉侧支血管的形成, 增加心肌的血管密度, 增加侧支血流量, 挽救急性心肌梗死边缘区域的濒死心肌, 使梗死面积缩小, 心室收缩能力改善[6,7]。bFGF挽救濒死心肌的解释有三种可能: (1) 诱导心肌细胞保护效应抵抗缺血。 (2) 促进心肌血管新生, 增加原有动脉的血流量; (3) 由于舒血管作用, bFGF可提高内皮依赖性和非依赖性血管舒张功能[8,9], 使潜在的侧支血管开放, 在心肌梗死早期改善心肌梗死边缘区的血供, 挽救这部分心肌从而缩小心肌梗死范围。

基于大量动物实验的成功, 目前已将bFGF用于冠心病的临床试验。Ruel等[10]在冠心病患者中应用bFGF后发现增加缺血心肌的血流再灌注, 提高射血分数, 改善了患者的临床症状。同时, 为了探讨其安全性, Unger等[11]在稳定性心绞痛患者中应用各种剂量的bFGF进行冠状动脉内一次性注射, 结果提示在3～30mg/kg的范围内bFGF是安全、有效的, 该治疗方法可为患者耐受。但由于bFGF的代射特点以及生物学效应的复杂多样性, 在实际应用中如何选择最适的剂量、最简便有效的给药途径、转运方式等尚在进一步探索之中。

4 bFGF与心脏重构

心室重构是导致心肌梗死后心力衰竭的主要因素, Sakakibara等[12]观察到FGF-2凝胶微球使大鼠和猪梗死心肌心室壁厚度增加, 心腔扩张减少, 血管增生明显, 心室重构改善。国内也有报道心肌内注射bFGF能逆转心室重塑过程中心肌肌球蛋白重链基因表型改变, 改善心肌梗死大鼠左心舒缩功能, 延缓心脏衰竭的发展[13]。这提示bFGF虽然介导了心肌肥厚的病理过程, 但最终效应可能还是改善了心脏重构。主要体现在以下几个方面: (1) bFGF诱导心肌细胞保护效应抵抗缺血缺氧, 抑制心肌细胞凋亡, 减少心肌细胞丢失, 从而防止心肌过度重构和纤维化[2]。 (2) bFGF能促进心肌梗死后心肌新生血管形成和侧支循环的建立, 通过改善心肌血供, 挽救濒死心肌来发挥限制和缩小梗死面积的作用, 从而预防和减轻心室重构。 (3) bFGF能刺激纤维细胞增殖、移行, 促进纤维化和肉芽组织形成, 利于组织修复, 同时调节胶原含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原比例, 从而改善细胞间质的重构[13,14]。因此, 正确认识和利用bFGF对改善心脏重构的有益影响, 为今后防治心肌梗死后心脏重构, 改善心功能开拓了新思路。

综上所述, bFGF在心血管系统分布广泛, 能引起多种心血管效应, 从而在冠心病的病理生理过程及其治疗中起到重要的作用。它作为一种“分子搭桥”方法治疗冠心病等研究日益受到关注。由于bFGF生物学效应的广泛性和复杂性, 其确切作用和调控机制尚未完全清楚。随着研究的不断深入和发展, bFGF在冠心病的防治上将具有广阔的应用前景。

成纤维细胞 第11篇

1 材料和方法

1.1 材料与主要仪器设备

试剂主要有姜黄素 (购自SIGMA公司) 、胎牛血清 (Biological Industries公司) 、vimentin单克隆抗体 (博士德公司) 、CCK-8 (Cell Counting Kit-8) (Dojindo公司) 。

采用的主要仪器设备包括:手术显微镜 (德国 Zeiss) 、光学倒置显微镜 (德国 Leica MPS-30) 、流式细胞仪 (美国 BD公司) 、Wellscan MK3酶标仪 (美国 Labsystem Dragon) 。

1.2 方法

1.1.2 人翼状胬肉成纤维细胞 (HPF) 的培养、鉴定胬肉组织标本为中山大学附属第二医院眼科手术切除组织, 采用组织块培养法原代接, 第3～6代细胞用于实验。按常规方法培养细胞[2], 并活体显微镜、组织学观察与进行细胞照相。利用盖玻片培养法进行HE染色, 并取第3代细胞按免疫细胞化学试剂盒说明书作Vimentin染色鉴定细胞。

1.2.2 CCK-8法检测姜黄素对人翼状胬肉成纤维细胞 (HPF) 的增殖的影响

1.2.3 统计学处理 所有数据用SPSS 11.0软件包处理, 实验结果数据计量资料用undefined表示, CCK-8对人成纤维细胞抑制率的浓度和时间关系及流式细胞仪检测姜黄素对成纤维细胞周期的影响均采用多组定量资料的单因素方差分析进行统计分析。

2 结果

2.1 人翼状胬肉成纤维细胞 (HPF) 的体外培养及生物特性鉴定

2.1.1 体外培养人翼状胬肉成纤维细胞的形态特征和生物特性

倒置相差显微镜下观察细胞, 可见原代培养的组织块约6～7d后细胞开始从组织块周边游离出来, 胞体狭长, 透亮, 胞浆丰富, 核圆形、椭圆形。胞膜清晰, 呈典型的梭形, 繁殖较快, 约2～3周细胞增殖基本融合, 细胞变长, 靠近, 呈放射状或漩涡状走行。

2.1.2 人成纤维细胞组织学观察HE染色及免疫细胞化学鉴定

细胞经HE染色, 可见细胞呈两头尖的长梭型, 不规则。胞核较大, 色浅蓝, 位于细胞中央;细胞胞浆丰富, 色淡红, 细胞膜清晰。细胞经免疫化学Vimentin染色, 可见阳性产物呈棕色, 均匀分布于细胞的胞浆中。根据组织的取材部位、细胞的形态并结合免疫细胞化学的鉴定可确定实验中所培养的细胞为人翼状胬肉成纤维细胞。

2.2 CCK-8法检测姜黄素对人翼状胬肉成纤维细胞 (HPF) 增殖的影响

CCK-8法检测姜黄素对人翼状胬肉成纤维细胞 (HPF) 增殖的影响结果见表1。

单因素方差分析表明各实验组与对照组相比, *:P<0.01;与临近浓度组比较, △:P<0.01;与临近时间组比较, ★:P<0.05。

即姜黄素浓度≥10 μg/mL时, 能抑制人翼状胬肉成纤维细胞的增殖 (P<0.01) , 并随药物浓度的升高、时间的延长, 姜黄素对成纤维细胞的抑制强度逐渐加大 (P<0.01) 。

2.3 流式细胞仪检测姜黄素对细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果见表2。

注:各实验组与对照组相比, *:P < 0.05。

流式细胞仪检测细胞周期的结果可见:姜黄素浓度在10～80 μg /mL的范围内, 姜黄素作用组均出现G0-G1期细胞百分比上升, S期细胞百分比下降, 说明成纤维细胞进入细胞增殖期减少。

3 讨论

本课题我们通过姜黄素作用体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞, 发现在0～80 μg/mL浓度作用24～96h范围内, 姜黄素可以抑制HPF细胞的增长, 且呈剂量和时间依赖性。姜黄素作为一种历史悠久的传统中药, 其药理作用广泛, 无明显毒副作用, 而且药源广泛, 价格低廉, 在对其他器官和组织的成纤维细胞方面的研究和应用中取得了一定的成果和进展。胡晓龙等[3]在研究姜黄素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用中得出:姜黄素对成纤维细胞的增殖有抑制作用;流式细胞仪检测发现, 随着药物浓度的增加, 成纤维细胞的凋亡率也在逐渐升高。高蔚等[4]在姜黄素对大鼠肺成纤维细胞 (MLF) 增殖和凋亡的影响中发现姜黄索对MLF有抑制作用, 存在剂量依赖与时间依赖性。流式细胞分析显示, 姜黄素处理组MLF凋亡率较阴性对照组显著升高, 并呈药物浓度依赖性。同样在研究姜黄素对体外培养人胚肺成纤维细胞 (HEF25) MRC25增殖、胶原表达和周期分布的影响中发现姜黄素能抑制MRC25细胞的增殖和胶原的增加, 并使细胞周期停滞在G1期[5]。本实验所得结果基本上与上述研究发现一致, 说明姜黄素对多种组织中成纤维细胞增殖都有抑制作用。但姜黄素抑制成纤维细胞的分子机制仍不清楚。目前, 国内外在对姜黄素抑制各种肿瘤细胞或类肿瘤细胞作用机制研究中发现可能与对细胞信号传导及各种细胞生长因子的影响有关[6,7]。MORAGODA L等[8]在研究姜黄素抑制肿瘤的作用机制中发现其可能是通过抑制细胞周期蛋白D和E的活性或者刺激caspase-3, caspase-8的活性来降低Bcl-xL的水平来诱导细胞凋亡。也可能与下调NF- kappaB, 抑制iNOS, COX-2活性有关。SPANDIDOS等[9]在对15例翼状胬肉组织的检测中发现, 有8例出现杂合子丢失 ( loss of heterozygosity, LOH) , 2例存在微卫星不稳性 (microsatellite instability, MSI) , 而LOH和MSI原来是在肿瘤细胞和癌前期病变的细胞中发生的, 因此Spandidos等认为翼状胬肉组织细胞可能具有与肿瘤相似的分子生物学特性, 可将翼状胬肉称为良性肿瘤性病变。而姜黄素对HPF的抗增殖作用的作用机制也是我们下一步需要考虑和研究的问题。

目前在研究体外培养细胞中研究细胞增殖的实验方法很多:①根据活细胞对某色素的代谢能力, 在特定波长中测定细胞代谢产物的吸光度, 从而间接反映细胞的增殖能力。如:Cell Counting Kit-8 (CCK-8) , MTT, AlamarBlue等;②在显微镜下计算细胞的数量:细胞计数法;③流式细胞仪检测细胞周期, 如果细胞周期中S期细胞百分比上升或下降, 则可说明细胞增殖水平的高低。在本实验中所用的Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 法评价姜黄素对人翼状胬肉成纤维细胞的增殖影响是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度, 无放射性的比色检测法。其利用了四唑盐- WST-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基) -3- (4-硝苯基) -5- (2, 4-二磺基苯) -2H-四唑单钠盐) , 它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中;不需要预配各种成分 (比较MTT法减少了加DMSO的步骤, 从而可进一步减少实验中因操作引起的误差) 。WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中, 生成的甲臜量与活细胞数量成正比。而且WST-8法检测细胞增殖实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS或WST-1。由于CCK-8溶液相当稳定, 并且对细胞没有毒性, 因此可以长时间孵育。因此, CCK-8比色检测法在检测细胞增殖中正成为一种主流方法。

本实验证明了姜黄素对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞有抗增殖作用, 为下一步进行动物实验提供了研究基础, 对姜黄素防治翼状胬肉的复发提供了初步的理论依据。

参考文献

[1]CoroneoM T, Di Girolamo N, Wakefield D.The pathogenesis of pterygia.Currop in Ophthalmol, 1999, 10:282-288.

[2]蓝育青, 宋欣, 肖剑晖等.载5-氟尿嘧啶聚乳酸纳米微粒对人眼球筋膜囊成纤维细胞抑制作用的研究.中华眼科杂志, 2009, 45 (1) :26-31.

[3]胡晓龙, 胡大海, 计鹏等.姜黄素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用.第四军医大学学报, 2009, 30 (1) :76-79.

[4]高蔚, 张德平, 华云峰.姜黄素对大鼠肺成纤维细胞增殖和凋亡的影响.实用医学杂志, 2008, 24 (14) :2393-2396.

[5]解克芳, 牛建昭, 王继等.姜黄素对人胚肺成纤维细胞的生长抑制及细胞外基质合成的影响.医学研究生学报, 2008, 21 (4) :339-342.

[6]Pan MH, Chang WL.Lin-Shiau SY et a1.Induction of apopto-sis by garcinol and curcumin through cytocrome c release and acti-vation of capspases in human leukemia HL-60cells.J Agric Food Chem, 2001, 49:l464-l474.

[7]Mukhopadhyay A, Bueso-Ramos C, Chatterjee D, et a1.Curcu-min downregulates cel survival mec hanisms in human prostate cancer cel lines.Oncogene, 2001, 20:7597-7609.

[8]Moragoda L, Jaszew ski R, Majumdar A P.Curcumin inducde modulation of cell cycle and apoptosis in gastric and colon cancer cells.Anticancer Res, 2001, 21:873-878.