转化诱导范文（精选5篇）
转化诱导 第1篇
一、后进生形成的根源
后进生形成的根源是多方面、复杂和长期的,受家庭、学校、社会的文化环境等诸多因素的影响。纵观“后进生”的形成问题,主要表现在以下几个方面:家长的溺爱或者是家庭重组使他们在情感和心理上留下创痕而变得冷漠与自私;社会信息化,各种各样的信息充斥着他们的生活,过分自我和追求个性,导致了他们相对比较缺乏团队忠诚感;学习压力过大,导致他们失去学习的兴趣甚至厌学;教师的不平等对待,导致他们找不到心理的平衡点。
案例1:小A同学在某位女教师的课堂上无视课堂纪律,带头捣乱,且玩弄手机,狂躁地像一头发疯的狮子,其他学生的注意力完全被他所吸引。课后,小A被该教师请进办公室“谈话”,而正巧,小A妈妈来了学校,看到这一幕之后,对该教师大发雷霆,且说了许多具有侮辱性的语言,该教师当场昏厥过去。案例2:2014年春天送你一首诗活动中,小B同学因又高又壮的身材影响到队伍的协调性,班主任没让她参加朗诵。小B失望地趴在桌子上哭,其他学生告知班主任这件事情之后,班主任答应小B尽量解决服装问题并让其参加,但最后小B还是没有和其他同学一样幸运地上台表演。在接下来的周日中,她写道:“我恨老师,说话不算数,你们给我记着,让我这么伤心。”
现在的初中生,正是活生生的“00后”,他们对社会充满好奇和不满,他们自信又脆弱,敏感而自私,他们是一个需要爱护和诱导的群体。然而,师生之间存在的代沟加深了交流的难度,不当的交流反而会加重他们的反叛。所以说教育者要正视后进生形成的根源,就需要用情感去经营。
二、以情感诱导后进生转化的一些教育策略
(一)我们要充满爱心
我们要以“爱”去教育学生、去感化学生。但这里的爱绝对不是家长对孩子的溺爱,也不是老师对“优生”的偏爱,而是对每一位学生的热爱。案例中的小A是我帮扶的对象,所以一开学我就找到他谈心。后进生对老师的戒备心很强,我先是对他在体育节和校园十佳歌手比赛中的表现进行表扬,待他渐渐卸下心防时,我问他接下来有何打算,他说:“老师,我将来想要当一名优秀的化妆师。”我马上对他的理想进行了肯定,并且跟他一起分析了化妆师必须具有的能力,这些能力必须在学习和生活中慢慢习得。聊到最后,这位学生说出了自己的心声“:我从小学到现在,因为贪玩、成绩差,很多老师都看不起我,所以我干脆破罐子破摔。”我很震惊,看似无法无天的一个人,内心竟然如此脆弱。“如果你是老师,你会选择怎样的学生当班干部?”我试探性地问着。“有能力的学生。”他回答地很坚定。“那你现在的职务是什么?“”体育委员。”我观察到他的神情有略微变化,他应该已经意识到老师对他的肯定与信任。接下来的一段时间里,虽然该生学习的主动性依然比较欠缺,但在课堂上的纪律好了许多。
(二)我们要注重身教
对学生来说教师是教育过程中的镜子,所以教师应该重视自身的榜样作用。现在,学生携带手机进校是件很普遍的事情,难免会有些学生控制不住自己的思想,在课堂上用手机发短信、聊QQ,老师因这些违规的行为欲没收学生的手机而引发师生间的矛盾乃常见之事。如果,老师在上课的过程中都能做到不接电话不打电话,那么在教育学生的时候,学生也就难以找到“老师上课的时候能用手机,我们为什么不可以?”这样的借口,老师是否也能底气更足一些呢?
我们办公室有一位同事,我从来就没见过他批评学生,也很纳闷,为什么学生在他面前就特别乖,也特别喜欢这位老师。在一次交流过程当中了解到,他在开学初就跟学生有许多“约定”,比如:“上课期间不准使用手机,且手机要处于无声状态,若老师违反约定,则由学生没收老师的手机,直到期末考试结束才归还手机;若学生违反约定,则由老师没收手机。在这样平等和谐的氛围中,学生还有什么理由不守纪律?
(三)我们要善于攻心
首先教师要控制自己的心,不要学生一犯错就罚抄书或是罚站等等,这样不仅有损教师的形象,还会招来学生的反叛。要知道教育改变的不是学生的身体而是心灵,错误是得用心灵去认识的,有效的惩罚也一定是触及心灵的。一切事出有因,教师要陪同学生一同面对犯错的根源并随时拨正他的思维航向,待他解除苦恼时,对老师的信任也就慢慢建立了。
(四)我们要秉承公正
每个人都需要别人的关注和重视,案例2中,教师如此随意地将那位学生的希望之火掐灭,因而她才会这么伤心、愤怒。在教学和班级管理中,我们时常从自己的角度出发,对某些聪明伶俐的学生以偏爱,而对另一些调皮、不合群的学生则表现地冷漠。事实上,对于后者,我们要更加关心,更加怜悯,也许你的一句肯定和鼓励的语言,都会让其心灵得到温暖与净化。苏霍姆林斯基曾经有一个十分精彩的比喻:要象对待荷叶上的露珠一样,小心翼翼地保护学生幼小的心灵。
三、结束语
转化诱导 第2篇
本研究进一步探索了诱导甘农薯2号和Favorita试管薯的技术途径;同时,以马铃薯试管薯薄片为转化受体材料,对农杆菌侵染的浓度和时间、共培养时间、抗生素浓度等进行了系统的研究。旨在为其种薯生产和遗传转化提供更好的优化体系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
以马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培品种甘农薯2号和Favorita为试验材料。转化载体pBISP为组成型启动子CaMV 35S启动子驱动的马铃薯无机焦磷酸酶(PPase)基因的表达载体(图1),由本实验室构建和保存。
1.1.2 试剂
6-苄氨基嘌呤(上海生工,纯度>99%);溴化乙锭(上海生工,纯度>98%);卡那霉素、羧苄青霉素、利福平购自兰州鹏程公司;赤霉素(Sigma, high purity);吲哚乙酸(Sigma, high purity);玉米素(Sigma, high purity);其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
超净工作台、高压灭菌锅、蒸馏水器、酸度计、空气浴摇床、低温冰箱、高速冷冻离心机、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统。
1.2 方法
1.2.1 试验材料的繁殖与壮苗
将甘农薯2号和Favorita试管苗在无菌条件下剪成带有2个腋芽的茎段,转接到MS+3%蔗糖+0.45%琼脂的固体培养基上。用150ml三角瓶培养,每瓶装50ml固体培养基,接种5个茎段,在(20±2)℃、2 000lx光照下培养3w,形成壮苗。
1.2.2 试管薯诱导的培养方法
固体培养诱导:将所得壮苗按繁殖方式剪成茎段并转移到固体培养基A(表1)上诱导结薯。每三角瓶内接种5个茎段,每个处理10瓶,重复3次。内装有50ml培养基,在(20±2)℃、2 000lx的光照下培养3w,然后转移至暗中于(20±2)℃条件下培养。6w后统计单瓶平均结薯数,薯块平均直径。
固液培养诱导:试管苗在MS+3%蔗糖+0.45%琼脂上生长3w时,向三角瓶内加入50ml的液体培养液B(表1),每个处理10瓶,重复3次。置于暗处在(20±2)℃下诱导试管薯。6周后统计单瓶平均结薯数,薯块平均直径。
液体培养诱导:将试管苗在MS+3%蔗糖的液体培养基上生长3w后,倒出三角瓶中的液体培养基,加入50ml的培养基C(表1),每个处理10瓶,重复3次。置于暗处在(20±2)℃条件下诱导。6w后统计单瓶平均结薯数,薯块平均直径。
1.2.3 试管薯的遗传转化与植株再生
1.2.3.1 诱导芽与生根选择压的确定
将直径为5cm左右的马铃薯试管薯从三角瓶里取出后切成厚度为1mm左右的薄片,分别接种于附加0、25、50、75mg/L卡那霉素(Kan)的芽诱导培养基上,培养基为MS+1mg/L IAA+0.2mg/L GA3+0.5mg/L BA+2mg/L ZT。培养4w后,确定抑制芽分化的最低Kan浓度。将无菌试管苗剪成带有2个腋芽的茎段接种于分别附加0、25、50、75mg/L Kan的MS培养基上,3w后观察无菌苗的生根状况,并确定抑制生根的最低Kan浓度。
1.2.3.2 农杆菌工程菌液的制备
从LB固体培养基上选取新鲜单菌落接种于50ml含Kan(50mg/L)和利福平(50mg/L)的LB液体培养基中,于28℃、200r/min避光振荡培养至对数生长期,然后转入无菌离心管中,于5000r/min离心6min,收集菌体用液体MS培养基重新悬浮即可用于转化,其处理所用菌液浓度OD600分别为0.2、0.5。
1.2.3.3 外植体侵染与植株再生
将直径为0.5cm左右的试管薯切成1～2mm的薄片,在制备好的农杆菌工程菌液中分别侵泡8、13min,且在室温下不断摇动,使菌液与薯片充分接触。然后用无菌滤纸吸去多余菌液,于25℃、黑暗条件下分别共培养2、3、4d后,将培养过的薯片转移到附加75mg/L Kan和400mg/L羧苄青霉素(carb)的芽分化培养基中,培养基为MS+1mg/L IAA+0.2mg/L GA3+0.5mg/L BA+2mg/L ZT +3%蔗糖+0.45%琼脂。置于光照度2 000lx,光周期16h/d,温度(23±1)℃的条件下培养3～4w即可分化出芽。待芽长0.5～1.0cm时切下转入生根培养基,进行生根筛选扩繁。为了比较侵染过程中不同处理对外植体形成抗性芽的影响,试验共设12种处理(表2)。
1.2.4 转基因植株鉴定
将待检测植株和对照植株的叶片用CTAB法提取植物总DNA。参照Sambrook等[9]的方法对抗性植株进行PCR检测。以nptII基因(抗性选择标记基因)的两个引物5’-GCTATGACTGGGCACAA CAG-3’和5’-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’进行PCR扩增,预期片段大小为676bp。反应程序为:94℃ 3min,94℃ 45s,60℃ 45s,72℃ 1min,循环35次,72℃ 5min,4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
2 结果与分析
2.1 培养方法对马铃薯试管薯诱导的影响
试管薯的诱导结果表明,在液体培养基中,经过25～30d的黑暗培养,部分植株开始结薯,其中甘农薯2号在40d后大量结薯,单瓶平均结薯6.5个,试管薯平均直径可达7.7mm,薯块质地紧密,适宜作遗传转化受体材料。而Favorita在30d后大量结薯,单瓶平均结薯数7.4个,块茎平均直径达7.3mm。固液培养基上的植株在30～40d后开始结薯,其中甘农薯2号在50d后大量结薯,单瓶平均结薯数4.4个,试管薯直径平均为5.8mm,薯块质地紧密,适宜作遗传转化受体材料。而Favorita在40d后大量结薯,单瓶平均结薯数5.8个,块茎平均直径达5.9mm。固体培养基上的植株也是40～50d后开始结薯,但单瓶平均结薯数和块茎平均直径都明显低于液体培养基(表3)。由此可见,液体培养法是适合于两个品种试管薯诱导较好的方法。
注:数字后不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
Note. The different letters following the numbers represented the significant difference at 0.05 levels.
2.2 试管薯遗传转化条件的优化
2.2.1 选择压的确定
试管薯薄片在芽分化培养基上经过4w的培养,对照组的外植体能直接分化长出绿色健壮小芽,在25mg/L Kan浓度的压力下,外植体分化芽的情况与对照无明显差异;在50mg/L Kan压力下,外植体分化出芽较晚且弱;而在75mg/L Kan的压力下,外植体尚不能分化出芽。因而确定芽诱导时的选择压为75mg/L Kan。
马铃薯植株经过3w的生根选择压培养,对照组的根生长较快,数量多,但随Kan浓度的增大,根的数量逐渐减少,生长迟缓。在25mg/L Kan的培养基中也能生根,但生长缓慢,根短且数量少。当Kan浓度为50mg/L时,植株出现黄化不能生根。因此转化植株生根时Kan选择压浓度确定为50mg/L。
2.2.2 染和共培养时间对试管薯遗传转化的影响
菌液浓度、侵染时间和共培养时间对马铃薯的转化有明显的影响(表4、5)。菌液浓度太低,在共培养未见到外植体四周出现菌液,经在含Kan的培养基上筛选后,获得的抗性芽也较少。当侵染时间(13 min)或共培养时间太长(4 d)时,常会因残留在外植体表面的根癌农杆菌生长过旺,以致覆盖整个外植体,最终导致外植体褐化死亡。
菌液浓度OD600=0.5、侵染8 min和共培养2 d为最佳转化条件,甘农薯2号和Favorita的转化频率分别为42.6%、36.8%(图2、3和图4、5)。
2.3 转基因植株鉴定
PCR扩增产物的电泳分析结果表明,转化植株可扩增到676 bp的特异性条带,而未转化的植株中无该片段的产生(图6),从而初步证明再生植株为转基因植株。
3 讨论
3.1 试管薯的诱导方法
马铃薯试管薯的形成和发育受多种因素影响,激素[1]、切段年龄[2]、培养条件[3]、N、P、K浓度倍数[4]、活性碳[5]等影响着试管苗结薯的数量和质量,并发现不同基因型马铃薯对培养条件特别是生长调节剂的反应是不一样的。就本试验而言,马铃薯甘农薯2号、Favorita的试管薯诱导中,固体培养基阻止了诱导剂的输导[10],而液体培养基为试管薯发育所必需的方式,且在液体培养基中加入5mg/L 6-BA,提高了试管薯的产量和质量,缩短了生产周期,表明6-BA对马铃薯块茎的形成有明显的促进作用。
M.λ-EcoT14Ⅰdigest DNAmarker(DL19329);1-6.transgenic plants;7.non-transgenic plants.
3.2 农杆菌介导的遗传转化体系的优化
转化诱导 第3篇
近来研究表明TGF-β1表现出和瘤细胞增殖、新生血管、细胞转移和免疫抑制等一定的相关性, 肿瘤微循环中的细胞因子TGF-β1可以启动肾细胞的转移过程, 对肿瘤的发生、发展起到调控作用[2], 因此TGF-β1可以作为抗转移的一个潜在靶点, 现就本研究的结果内容报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
786-0细胞株 (北京博奥森生物技术有限公司) , 1640培养基 (北京博奥森生物技术有限公司) , CO2培养箱 (Bekman, 美国) , 流式细胞仪 (BD, 美国) , TGF-β1 (北京博奥森生物技术有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组。
肾癌786-0细胞常规下培养、传代, 将细胞分为实验组 (腺病毒转染组) 以及正常对照组 (未转染) 分别培养。
1.2.2 携带h TGF-β1基因重组腺病毒的构建。
将携带TGF-β1基因的腺病毒 (Ad-h TGF-β1) 与穿梭质粒p DC 316-m CMV-EGFP连接、重组, 用Lipofectamine 2 000介导与骨架质粒共同转染293 T细胞, 进行培养传代扩增。
1.2.3 Ad-h TGF-β1转染后的检测。
用RT-PCR检测, 引物由博奥生物科技有限公司合成, TGF-β1上游5'-GCAACAATTC-CTGGCGATAC-3', 下游5'-AGGCAGAAGTTGGCATGGTAG-3', β-actin上游5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3', 下游5'-GT-CACGCACGATTTCCCGCT-3'。
1.2.4 细胞凋亡检测。
分别于干预作用后24、36、48、60、72 h胰酶消化细胞, 制备细胞悬液, PBS冲洗、离心3遍, 加入PI 5μL后置流式细胞仪读取数据。
1.3 统计学处理
应用SPPS17.0统计软件进行数据分析, 组间比较采用多因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
转染24 h后TGF-β1 m RNA的表达与对照组比较明显增强, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。实验组24、36、48、60、72 h的凋亡率分别为 (7.55±0.03) %、 (8.53±0.11) %、 (13.47±0.23) %、 (15.51±0.26) %、 (16.59±0.26) %, 与对照组细胞各时相点比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨论
肾癌的发生涉及多种癌基因协同作用, 当肾癌相关的原癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破, 控制细胞增殖的原癌基因持续或过高表达, 同时抑癌基因不表达或失活时, 便会形成肾癌[3]。研究表明TGF-β1与肿瘤的发生、生长密切相关, TGF-β1表现出与肿瘤的增殖、新生血管生成、迁移与转移, 以及免疫抑制作用的相关性[4]。本次研究采用腺病毒在肾癌786-0系中转染TGF-β1因子, 研究结果表明24、36、48、60、72 h的凋亡率与对照组细胞各时相点比较差异显著, 进一步证实TGF-β1基因的表达缺失可能是肾癌发生、发展的关键环节。因此深入研究TGF-β1与肿瘤的发生、生长的关系对于肾癌的早期诊断与基因治疗都有重大意义。
参考文献
[1]HRABE JE, O'LEARY BR, FATH MA, et al.Disruption of thioredoxin metabolism enhances the toxicity of transforming growth factorβ-activated kinase 1 (TAK1) inhibition in KRAS-mutated colon cancer cells[J].Redox Biol, 2015, 8 (5) :319-327.
[2]YUE B, QIU S, ZHAO S, et al.Lnc RNA-ATB mediated E-cadherin repression promotes the progression of colon cancer and predicts poor prognosis[J].J Gastroenterol Hepatol, 2015, 10 (21) :13206-13207.
[3]SEEGER P, MUSSO T, SOZZANI S.The TGF-βsuperfamily in dendritic cell biology[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2015, 26 (6) :647-657
转化诱导 第4篇
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
PFD由中南大学药学院合成,用含10%胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基(dulbecco’s modi- fied eagle medium,DMEM) 配制成终浓度为1 600、 800、400、200和100μg/ml PFD,分装后4℃避光保存。DMEM培养基(美国GIBCO公司),胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、胰蛋白酶、重组人TGF-β1、 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sig- ma公司,酶标仪(美国Bio-Rad公司),Rneasy Mini Kit试剂盒(美国Qiagen公司),逆转录试剂盒(美国Promega公司),SYBR Premix Ex Taq试剂盒(美国Taraka公司)。
1.2乳鼠CFB原代培养
取出生1~2 d Wistar大鼠,无菌条件下剪取心室肌,剪碎心肌,0.25%胰酶消化后,加入10%胎牛血清培养,调整细胞密度为1×105个/μl,差速贴壁1 h,去除心肌细胞获得成纤维细胞,继续培养细胞至融合状态后按1∶2传代,传代后成纤维细胞以波形蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定,纯度达到95%用于实验。细胞接种于25 cm2培养瓶中, 37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养,每2~3 d更换1次培养基,待细胞长满后,0.25%胰蛋白酶消化, 传代。取传2、3代细胞用于实验。
1.3 PFD对CFB增殖的影响
处于对数生长期的细胞接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液200μl,接种密度为1×104个/ml, 37℃、5%CO2孵箱中继续培养。待细胞贴壁后弃上清液,加入无血清的DMEM作用24 h,使细胞同步化。设空白对照孔,加入PFD(0、100、200、400、800和1 600μg/ml),每个浓度均重复6孔,37℃、5% CO2孵箱中培养24、48和72 h后,每孔加入MTT 20μl(5 ng/ml)。置孵箱中4 h后取出培养板,弃上清液,每孔加DMSO 150μl。用ELISA自动分析仪490 nm处测定各孔光吸收度值(opital density,OD),计算6孔的均数。通过上述实验,筛选出PFD抑制CFB增长的有效浓度范围和最佳作用时间。
1.4 PFD对TGF-β1诱导CFB增殖的影响
处于对数生长期的细胞接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液200μl,接种密度为1×104个/ml, 37℃、5%CO2孵箱中继续培养。待细胞贴壁后,弃上清液,加入无血清的DMEM作用24 h,使细胞同步化。加入TGF-β1(5 ng/ml),设空白对照孔,加入PFD (0、400和1 600μg/ml),各浓度均重复6孔。 37℃、5%CO2孵箱中培养48 h后,每孔加入MTT 20μl(5 mg/ml)。置孵箱中4 h后取出培养板,弃上清液,每孔加DMSO 150μl。用ELISA自动分析仪490 nm处测定各孔OD值,计算6孔的均数。
1.5心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的实时定量逆转录- 聚合酶链反应检测
1.5.1细胞总RNA的提取用Rneasy Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA,抽提的总RNA用紫外分光光度计测OD值,比值为1.9~2.0。取3μl RNA用1% 琼脂糖凝胶电泳,可见28、18和5 S 3条清晰的RNA带,提示RNA无污染和降解。
1.5.2 c DNA的合成用逆转录试剂盒合成c DNA, 再以该c DNA为模板进行实时定量逆转录- 聚合酶链反应(teal-tima-PCR,RT-PCR)。RT-q PCR的引物序列如下,β-actin正向引物:5'-GGCCAACCGTGA AAAGATGA-3',反向引物:5'-GACCAGAGGCATAC AGGGACAA-3';Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)正向引物:5'-TCAGGGGCGAAGGCAACAGT-3', 反向引物:5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTACAC- GA-3'。
1.5.3 RT-q PCR检测按SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) 试剂盒说明书进行操作。在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增,96孔板加样,设计复孔和标准曲线。用Sequence Detection System软件分析各检测样本的Ct值(达到一定荧光阈值的循环数),计算2-ΔΔCt,评价Col Ⅰ在CFB中的表达水平。
1.6心肌成纤维细胞Col Ⅰ的Western blot检测
1.6.1细胞总蛋白质的提取培养细胞弃去上清液,磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffer solution,PBS)洗涤后加入细胞裂解液,裂解30 min 。 4 ℃、 12 000 r/min离心15 min,取上清液,按Bio-rad蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量,取80 μ l上清液加20 μ l 5 × 变性缓冲液混匀,100 ℃ 下变性10 min 。
1.6.2I型胶原蛋白的Western blot检测灌制10%分离胶和4%堆积胶,取总蛋白40μg行上样电泳,电泳结束后260 m A电转印90 min至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)。封闭液(5% 牛奶)摇床上封闭2 h,分别加入羊抗Col Ⅰ多克隆抗体(1∶200),4℃摇床过夜。洗膜后再加羊二抗, 室温孵育1 h,加ECL液后显影、定影,以 β-actin为内参照。将胶片扫描后,采用Quantity One软件分析各条带灰度值,将各目的条带灰度值除以同一标本内参照 β-actin条带灰度值得到比值,将该比值作为Col Ⅰ蛋白表达量的半定量结果。
1.7统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 PFD对CFB增殖的影响
PFD能抑制CFB增殖,与对照组(PFD 0μg/ml) 比较,PFD作用24 h时,1 600μg/ml起效[(0.38± 0.09)vs(0.45±0.05)](t =-2.612,P =0.004);作用48 h时,PFD 400μg/ml[(0.36±0.03)vs(0.50±0.05)](t =- 4.200,P =0.000),PFD 800 μg/ml [(0.30 ±0.03)vs (0.50±0.05)](t =-5.171,P =0.000),PFD 1 600μg/ml [(0.28±0.03)vs (0.50±0.05)](t =-7.413,P =0.000) 起效;作用72 h时,PFD 400μg/ml[(0.62±0.15)vs (0.75±0.12)](t =-3.507,P =0.002),PFD 800μg/ml [(0.55±0.10)vs (0.72±0.12)](t =-8.017,P =0.000), PFD 1 600μg/ml[(0.54±0.07)vs(0.72±0.12)](t =- 7.725,P =0.000)起效。根据以上实验,筛选PFD作用的有效浓度范围为400~1 600μg/ml,抑制作用呈剂量依赖性,作用48 h抑制作用最明显。见图1。
覮,P <0.05
2.2 PFD对TGF-β1诱导CFB增殖的影响(MTT法)
根据上述实验结果,选用PFD400和1600μg/ml为低浓度组和高浓度组,作用时间选择48 h。TGF-β1(5 ng/ml)能刺激CFB增殖[(1.68±0.14)vs(1.36± 0.08)](t =2.373,P =0.003),PFD 400[(1.09±0.12)vs (1.36±0.08)](t =-1.203,P =0.003) 和1 600μg/ml [(0.97±0.17)vs(1.36±0.08)](t =-4.507,P =0.000)能抑制CFB增殖,高浓度组优于低浓度组[(0.97± 0.17)vs(1.09±0.12)](t =-1.207,P =0.005)。PFD 400 [(1.16±0.17)vs (1.68±0.14)](t =-5.086,P =0.000) 和1 600μg/ml[(1.05±0.12)vs(1.68±0.14)](t =-2.419, P =0.001)能显著抑制TGF-β1(5 ng/ml)诱导CFB增殖,低浓度400μg/ml即能起明显抑制作用, 1 600μg/ml的抑制效果强于400μg/ml[(1.05±0.12) vs(1.16±0.17)](t =-1.010,P =0.021)。见图2。 2.3心肌成纤维细胞Col Ⅰ的RT-q PCR检测
TGF-β1(5ng/ml)的心肌成纤维细胞ColⅠm RNA表达增加[(2.07±0.44)vs(1.00±0.38)](t =8.682,P = 0.000),PFD 400[(0.59 ±0.24)vs (1.00±0.38)](t =-4.914,P =0.002) 和1 600μg/ml [(0.41±0.21)vs (1.00±0.38)](t =-6.336,P =0.001)能抑制心肌成纤维细胞Col Ⅰ m RNA表达,高浓度组优于低浓度组[(0.41±0.21)vs(0.59±0.24)](t =-1.580,P =0.050)。 同时PFD 400[(0.76±0.36)vs(2.07±0.44)](t =- 9.023,P =0.000) 和1 600 μg/ml [(0.64 ±0.27)vs (2.07±0.44)](t =-9.988,P =0.000)能显著抑制TGF- β1(5 ng/ml) 诱导心肌成纤维细胞Col Ⅰ m RNA表达,高浓度组优于低浓度组细胞Col Ⅰ m RNA表达[(0.64±0.27)vs(0.76±0.36)](t =-1.523,P =0.402), 低浓度400μg/ml即能起明显抑制作用。见图3。 2.4心肌成纤维细胞Col Ⅰ的Western blot检测
TGF-β1(5 ng/ml)能刺激心肌成纤维细胞ColⅠ蛋白的表达,PFD 400和1 600μg/ml能抑制心肌成纤维细胞Col Ⅰ蛋白的表达,高浓度组优于低浓度组。同时PFD 400和1 600μg/ml能显著抑制TGF- β1(5 ng/ml)诱导心肌成纤维细胞Col Ⅰ蛋白的表达,低浓度400 g/ml即能起明显抑制作用。见图4。
1)与 PDF 浓度组比较,P <0.05;2)与 TGFβ 1 浓度刺激对照组,P <0.05;3)与 400 μ g/ml PDF 浓度组比较,P <0.05
1)与 PDF 浓度组比较,P <0.05;2)与 TGFβ 1 浓度刺激对照组,P <0.05;3)与 400 μ g/ml PDF 浓度组比较,P <0.05
1:PFD 0 μ g/ml+TGFβ 1 (0 ng/ml);2:PFD 0 μ g/ml+TGFβ 1 (5 ng/ml);3:PFD 400 μ g/ml+TGFβ 1 (0 ng/ml);4:PFD 400 μ g/ml+ TGFβ 1 (5 ng/ml);5:PFD 1 600 μ g/ml+TGFβ 1 (0 ng/ml);6:PFD 1 600 μ g/ml+TGFβ 1 (5 ng/ml)
3讨论
心肌间质纤维化是各种心脏疾病发展为终末期的共同通路,其主要特征是间质成纤维细胞的大量增殖、活化以及成纤维细胞分泌的细胞外基质成分大量沉积[1]。UMF是在慢性肾脏病基础上并发心肌肥大和心室重塑的主要病理基础。随着慢性肾脏病的进展,肾间质纤维化程度逐渐升高,尿毒症患者体内以TGF-β 为代表的促纤维化因子逐渐升高。 UMF是在除心肌机械压力和容量负荷外,炎症因子及致纤维化因子刺激,代谢毒物的毒性作用及营养物质的缺乏(如白蛋白和某些微量元素)或失衡等综合作用造成的心肌特异性病变。
PFD是新型的吡啶酮类化合物,具有抗肺[2,3]、 肝[4,5]、肾[6,7]及皮肤[8,9]纤维化作用,但目前PFD对尿毒症心肌纤维化的研究少有报道。本研究以TGF- β1刺激CFB,建立大鼠尿毒症心肌纤维化细胞模型。 本实验发现,0~1 600μg/ml PFD对CFB作用24、 48和72 h,能抑制CFB增殖。PFD在有效浓度范围内作用时间在24 h时,1 600μg/ml PFD起效;48 h时, 400~1 600μg/ml PFD即能起到明显的抑制作用,当作用时间延长为72 h时,400、800和1 600μg/ml有效,但作用强度不如48 h,作用强度呈浓度依赖性,未呈时间依赖性。
笔者继续选用400和1 600μg/ml PFD为低浓度组和高浓度组,以48 h为干预时间点,观察PFD对TGF-β1诱导CFB增殖和分泌胶原蛋白的影响。研究发现,TGF-β1能刺激CFB增殖、促进ColⅠm RNA和Col Ⅰ表达,在无TGF-β1刺激的情况下,PFD 400和1 600μg/ml能抑制CFB增殖、抑制Col Ⅰ m RNA和Col Ⅰ表达;同时PFD 400和1 600μg/ml能显著抑制TGF-β1诱导CFB增殖、Col Ⅰ m RNA和Col Ⅰ 表达,400μg/ml即能起明显抑制作用。文献报道, PFD可成浓度依赖性模式抑制血小板源性生长因子诱导的肝星状细胞增殖,最大浓度为1 875μg/ml[10]。 本实验中最大浓度为1 600μg/ml,与该浓度相近, PFD药物浓度再增加时血浆溶解度降低。说明PFD对不同成纤维细胞的作用浓度相似,作为抗纤维化药物,PFD抑制成纤维细胞增殖效果稳定可靠。
AZUMA等[11]在日本进行特发性肺纤维化的Ⅱ期临床实验中,107例特发性肺纤维化患者被随机分为两组,分别接受PFD(72例,1 800 mg/d)和安慰剂(35例)治疗。观察时间为9个月,发现PFD治疗组患者6 min运动实验最低氧饱和度、肺活量下降和急性加重的发病率较安慰剂组明显改善,该研究的PFD剂量为1 800 mg/d。SHARMA等[12]在2011年对PFD治疗糖尿病肾病的研究中发现,通过1年的观察,低剂量组(PFD 1200 mg/d)较高剂量组(PFD 2 400 mg/d) 和安慰剂组肾小球滤过率上升3.3~2.2 ml/ (min· 1.73 m2),差异有统计学意义。在77例患者中,低剂量组未进入透析,高剂量组1例进入透析,安慰剂组4例进入透析。该两项研究表明,PFD的人体实验最佳参考剂量为1 200~1 800 mg/d,同细胞实验基本一致,中等剂量组作用效果优于高剂量组。
转化诱导 第5篇
1 材料和方法
1.1 材料
大鼠GMC购自武汉大学保藏中心;Ang- (1-7) 和TGF-β1均购自美国Sigma公司;WST试剂盒购自碧云天生物技术有限公司, CTGF以及大鼠β-actin引物由上海生工生物工程公司合成;RT试剂盒由成都博瑞克生物技术有限公司提供;Taq酶由北京天根公司提供。
1.2 方法
1.2.1 GMC的培养
复苏细胞后将其加入RPMI 1640培养液并接种于培养瓶中, 放入培养箱。至细胞长至亚融合状态用0.25%胰酶消化, 传代, 取生长旺盛的细胞做实验。
1.2.2 WST法检测活细胞
将培养的大鼠GMC用无血清的RPMI 1640培养液制成 (5～10) ×104ml-1的细胞悬液, 接种在96孔板中, 每孔加入细胞悬液100ul, 无血清培养24h, 使其生长同步化, 当细胞生长融合至70%左右时加入干预因素, 药物干预24h后, 每孔加入WST 100μl, 37℃继续孵育4h, 终止培养, 在酶联免疫检测仪490nm波长处测定OD值, 用只加培养液不加细胞的空白孔调零。
1.2.3 CTGFmRNA表达测定
按说明书提取GMC总RNA, 逆转录为cDNA后进行PCR反应。扩增大鼠CTGF的引物序列:上游引物为5′-CTA AGA CCTGTG GAA TGG GC-3′, 下游引物为5′-GTC AAA GATGTC ATTGTCCCC-3′, 扩增片段长383bp;扩增大鼠β-actin上游引物为5′-CCTTCC TGG GCA TGG AGTCCTG-3′, 下游引物为5′-GGA GCA ATG ATCTTCATCTTC-3′, 扩增片段长205bp。PCR反应共35个循环, 取产物15μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳, 用凝胶成像扫描及分析系统, 测定目的基因与内参基因的积分吸光度比值, 用SPSS软件进行分析。
1.2.4 实验分组
(1) 对照组:不加入任何干扰因素; (2) TGF-β1作用组:在培养基中加入TGF-β1 (终浓度5ng·ml-1) ; (3) Ang- (1-7) 组:在培养基中加入Ang- (1-7) (终浓度10-6mol·L-1) ; (4) TGF-β1加Ang- (1-7) 组 (D组) :浓度同Ang- (1-7) 组。每组均为6个样本, 药物干预时间均为24h。
1.2.5 统计学处理
实验结果用±s表示, 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析 (F检验和q检验) 进行组间比较, P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ang- (1-7) 对TGF-β1诱导GMC增殖的影响
如表1所示, 与对照组相比, TGF-β1 (5ngml-1) 可明显促进GMC增殖 (P<0.05) ;Ang- (1-7) (10-6mol·L-1) 明显抑制GMC增殖 (P<0.05) ;同时Ang- (1-7) 组对TGF-β1的促细胞增殖作用也有显著的抑制作用 (P<0.05) 。
与对照组比较, *P<0.05;与TGF-β1组比较, #P<0.05
2.2 Ang- (1-7) 对TGF-β1诱导的GMCCTGF基因表达的影响
图1为CTGF基因mRNA表达量变化的电泳图。经过凝胶成像分析, 与对照组相比, TGF-β1 (5ngml-1) 可明显促进GMC CTGFmRNA的表达 (P<0.05) ;Ang- (1-7) (10-6molL-1) 明显抑制CTGFmRNA的表达 (P<0.05) ;而Ang- (1-7) 对TGF-β1所诱导的CTGF表达也有明显的抑制作用 (P<0.05) (表2) 。
M.分子量Maker;A.对照组;B.TGF-β1组;C.Ang- (1-7) 组;D.TGFβ1加Ang- (1-7) 组
与对照组比较, *P<0.05;与TGF-β1组比较, #P<0.05
3 讨论
CTGF是一种新发现的TGF-β1下游效应因子, 主要功能是刺激细胞增生和ECM合成, 介导TGF-β1促进组织器官纤维化的生物学效应[3]。肾脏纤维化是各种原因所致的终末期肾病的共同表现, 包括了肾小球硬化和肾小管间质纤维化, 是以ECM的过度积聚和沉积为特征的过程。GMC在肾小球硬化过程中起着十分重要的作用, 它不仅可分泌ECM的主要成分, 还可以通过影响基质降解酶系统来抑制ECM的降解, 从而导致肾小球硬化的发生发展。
Ang- (1-7) 是RAS家族一个具有多种生理活性的新成员, 是由天门冬氨酸、精氨酸、缬氯酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、脯氨酸组成的7肽, 主要由10肽的AngⅠ在中性肽链内切酶 (NEP) 或脯氨酰肽链内切酶 (PE) 的作用下, 去掉3个氨基酸或由血管紧张素转化酶2直接水解AngⅠ或AngⅡ而生成。Freeman等[4]首次发现Ang- (1-7) 对胎牛血清、血小板衍生生长因子、AngⅡ的促平滑肌细胞生长具有显著的抑制作用。最新研究表明, Ang- (1-7) 不仅可抑制DOCA食盐诱发高血压大鼠 (DOCA-saltmodelhypertensin) 的心肌纤维化和改善压力负荷过重所致的左室肥大和纤维化, 还可抑制AngⅡ诱导的心肌肥大和间质纤维化, 从而改善心肌重塑[5,6,7];Ang- (1-7) 在改善心肌重塑的同时可降低血浆中TGF-β的水平[6]。作者以前的研究也发现, Ang- (1-7) 可呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的GMC增生以及透明质酸 (HA) 及Ⅲ型前胶原 (PCⅢ) 等细胞外基质的分泌[2]。目前, Ang- (1-7) 对TGF-β1所致纤维化作用的研究还较少。
本研究发现, Ang- (1-7) 对基础状态下以及TGF-β1诱导下的GMC的增殖均有抑制作用, 表明Ang- (1-7) 对TGF-β1致纤维化效应具有直接的抑制作用;Ang- (1-7) 还抑制TGF-β1诱导的细胞系膜CTGFmR-NA的表达, 说明Ang- (1-7) 对TGF-β1促细胞系膜增殖的抑制作用可能是通过抑制CTGF的产生实现的。Ang- (1-7) 在治疗肾脏纤维化中可能具有重要意义, 进一步明确其作用机制, 将为临床防治慢性肾脏疾病提供新的方法。
参考文献
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[2]刘建, 马莲环, 王明勇, 等.血管紧张素- (1-7) 对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠系膜细胞增殖与细胞外基质分泌的影响[J].中国现代医学杂志, 2005, 15 (12) :1789-1802.
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[6]Grobe J L, Mecca A P, Lingis M, et al.Prevention of angioten-sin II-induced cardiac remodeling by angiotensin- (1-7) [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292 (2) :H736-H742.