纳米基因载体范文

纳米基因载体范文（精选8篇）

纳米基因载体 第1篇

关键词：季铵盐壳聚糖,基因载体,转染

0 引言

基因治疗是用正常功能的基因替代或修正缺陷基因从而达到治疗疾病的目的,现在通常认为,将遗传物质转移到机体内的治疗方法均可以称为基因治疗。将治疗性基因以一定方式高效导入所需部位,并使之在靶细胞中适时适量表达,从而达到治疗疾病的目的,这是理想的基因治疗模式。安全无毒且无免疫原性的基因载体是目前研究的重点,壳聚糖因其糖链上具有高密度的氨基而带正电荷,易与带负电荷的核酸相互作用形成复合物,因此常用作基因转移载体[1,2,3]。但转染效率低和非水溶性限制了其在基因传递和基因治疗领域的应用[4]。

笔者的前期研究表明用水溶性的N,N,N-三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC)制备的纳米载药体系不但能够进入细胞,而且还能进入细胞核[5]。因此,本实验选用TMC为载体,制备TMC/pDNA复合物纳米粒子,并对其体外性质进行初步研究,以建立载基因TMC纳米粒基因传输系统,为后期的体内及临床研究打下基础。

1 实验

1.1 原料与试剂

不同季铵化程度的TMC[6]为本实验室自制,质粒DNA由本实验室提取,Lipofectamine 购自美国Invitrogen公司,DNA marker购自TaKaRa公司,HepG 2细胞株由中山大学肿瘤医院病理科惠赠。

1.2 实验方法

1.2.1 TMC/pDNA纳米粒子的制备

TMC带有正电荷,具有水溶性,在中性水溶液中带正电荷,能通过静电作用与带负电荷的pDNA分子结合,然后包裹缠绕形成带正电荷的纳米粒子。本研究利用复凝聚法制备TMC-pDNA纳米粒。将TMC溶于水中配制成不同浓度的水溶液,取一定量不同季铵化程度的TMC溶液与10 μL的pDNA(607 μg/mL)加入Eppendorf管中,涡旋20 s,得TMC包裹的DNA纳米粒子。

1.2.2 TMC/pDNA纳米粒子的表征

将纳米粒子混悬液滴加到镀碳的铜网上,干燥后直接采用透射电镜观察纳米粒子的形貌。取10 μL纳米粒子混悬液滴加到高品质盖玻片上,室温晾干后采用原子力显微镜进行观察。取适量的TMC/pDNA纳米粒子,采用Zeta电位分析仪(Zeta PALS,美国Brookhaven公司)测定TMC/pDNA纳米粒子的粒径、粒径分布和表面电荷。

1.2.3 DNA结合滞留分析

将不同质量比、不同季铵化程度的TMC与pDNA按比例混合制备纳米粒子,其中DNA的恒定浓度为0.2 μg/μL,室温静置1 h。吸取样品或pDNA溶液20 μL(相当于pDNA 1 μg),加入0.5 U/mL DNaseⅠ,37 ℃水浴消化30 min后,再置于0 ℃冰浴中30 min以终止反应,采用含有溴化乙锭(0.5 mg/L)的1%琼脂糖凝胶进行电泳分析(100 V, 30 min),用紫外透射仪观察凝胶并拍照,考察纳米粒对pDNA的保护效果。

1.2.4 TMC/pDNA纳米粒的细胞毒性

用胰蛋白酶将对数生长期的HepG 2细胞消化后,吹打成单细胞悬液,用Dulbecco′s改良细胞培养基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)稀释成2×103个/mL之后,接种于96孔板上。24 h后,吸出培养基,分别向96孔板中加入200 μL经DMEM(未加抗生素)稀释的TMC/pDNA纳米粒子混悬液、200 μL DNA(20 μg)的DMEM(未加抗生素)溶液,同时设空白对照组。分别在培养24 h、48 h、72 h时向每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL);继续培养4 h,快速翻转倒掉培养液,每孔加入200 μL二甲亚砜溶液。振荡10 min后,用酶标仪测定A570 nm。利用测得的OD值计算细胞存活率。

细胞存活率undefined

1.2.5 TMC/pDNA纳米粒对细胞的转染

使用六孔板,分为样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔3组,每组均设复孔。转染前一天,挑选生长良好的细胞,胰酶消化HepG 2细胞并传代,以1×105个/mL密度植于铺有盖玻片的六孔板中,在37 ℃、5%的CO2恒温箱中培养过夜。因以Lipofectamine(Lipo)为阳性对照孔,培养基中均不含抗生素,转染前观察细胞生长情况,要求生长情况和密度一致。转染前1 h,吸去旧培养基,PBS冲洗,并加入不含血清的DMEM培养基800 μL,继续培养;1 h后,将200 μL含Lipo/pDNA、TMC/pDNA纳米粒子和pDNA的溶液分别加入到阳性对照孔、样品孔和阴性对照孔中,每个样品平行做3孔(每孔pDNA的终浓度为2 μg/mL);CO2恒温培养箱中培养6 h后吸去转染物,加入1 mL含10%新生牛血清的培养基,继续培养,分别在24 h、48 h、72 h时采用荧光倒置显微镜观察转染情况。通过在荧光显微镜下观察具有绿色荧光的转染细胞计算其转染效率, 以 100 个细胞为单位, 在同一张涂片上的不同视野下连续观测3 次。

2 结果与讨论

2.1 TMC/pDNA纳米粒的表征

图1(a)为TMC/pDNA纳米粒的透射电镜图,TMC与pDNA形成的复合物为球形的纳米粒子,结构紧密,尺寸比较均一,粒径在100～300 nm之间。图1(b)为原子力显微镜图,可以看出纳米粒子的分布比较均匀,无团聚现象。

表1为TMC与pDNA以不同质量比制备的纳米粒子的粒径、粒径分布及Zeta电位。

由表1可看出随TMC与pDNA的比例增加,粒径呈减小趋势,Zeta电位呈增大趋势。同时,从表2可以看出TMC与pDNA的比例为10∶1时,随季铵化程度增加,粒径减小,Zeta电位增加。

2.2 TMC及其纳米粒子对质粒的包封

以灭菌双蒸水代替TMC溶液,按照制备工艺的拆分条件制备质粒基因的考察溶液,分别考察TMC与pDNA的质量比、TMC的季铵化程度等条件对质粒稳定性的影响。采用琼脂糖凝胶电泳法考察不同制备条件下的电泳条带变化。

以TMC28.8与pDNA按质量比为0、0.5、1、2、4、8制备纳米复合物,取样进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示。由图2可看出,在较低质量比时可在凝胶上出现DNA滞留条带,随m(TMC)/m(pDNA)逐渐增大,游离DNA的量逐渐降低,当两者质量比为4时,质粒DNA被完全阻滞于加样孔中,即此时pDNA几乎全部与TMC结合。

纳米粒与基因结合有静电吸引、共价键结合、物理包裹3种方式,TMC带正电荷,能通过静电吸引DNA,也可以通过物理包裹DNA,可以用一步法在制备纳米粒的同时将质粒连接上,也可以先制备纳米粒,再连接质粒。

用不同季铵化程度的TMC与pDNA复合制备的纳米粒子的凝胶电泳图如图3所示。图3中泳道2～5和泳道6～10分别为TMC12.11/pDNA纳米粒子和TMC45.2/pDNA纳米粒子的琼脂糖凝胶电泳图。由图3可见,当m(TMC12.11)∶m(pDNA)=8∶1时,TMC12.11才能将质粒完全包封,而TMC45.2与质粒的质量比为3∶1时就能将质粒完全包封,TMC12.11对质粒的包裹能力较差,而TMC45.2的包裹能力则较强。这可能是因为随TMC的季铵化程度增大,其分子链上带的正电荷数目增加,增强了其与质粒的复凝聚作用。

2.3 TMC对质粒DNA的包封与保护作用

研究了在溶液中存在一定浓度的DNase Ⅰ时,纳米粒对质粒的保护作用,DNase Ⅰ的内切酶作用使得溶液中没有被包埋的质粒被降解成片段,被包埋的质粒可免受降解。图4为不同季铵化程度的TMC对质粒的保护情况,可以看出随TMC季铵化程度的增大,TMC对pDNA的保护作用增强。

图4(a)泳道2未加TMC,pDNA被DNaseⅠ降解为核酸片段,而加入TMC后由于TMC与pDNA结合形成纳米粒子,其对pDNA有保护作用从而避免pDNA被降解。TMC12.11对pDNA的保护能力较弱,在较低比例时,pDNA被消化成大小不同的片段,凝胶电泳图上可见连续分布的条带。TMC28.8对pDNA的保护作用增强,同等条件下pDNA被消化为较大片段,而TMC63.7能保护pDNA完全不被消化,这可能是因为季铵化程度高的TMC链上的正电荷较多,容易与DNA结合。TMC不仅能结合、浓缩DNA,还能有效地保护DNA,使其不被核酸酶降解,这样才能使DNA在胞内从溶酶体游离,并进入核内表达。DNase Ⅰ消化实验表明:不同季铵化程度的TMC对质粒均有保护作用,只是其对质粒的保护作用随季铵化程度的增大而增强。

2.4 细胞毒性

用质量浓度为2 mg/mL的 TMC12.11、TMC63.7以质量比为10∶1与pDNA形成的TMC/pDNA纳米粒子及DNA在不同时间段对HepG 2细胞的毒性作用如图5所示。由图5可见,与空白对照组相比,DNA及TMC/pDNA纳米粒子对HepG 2细胞的抑制作用均较弱,但TMC63.7/pDNA纳米粒子较TMC12.11/pDNA纳米粒子的细胞毒性强。TMC的细胞毒性主要是其能与细胞膜糖蛋白结合而反应,但是TMC/pDNA纳米复合物与细胞作用时,其阳离子能被pDNA中和。因此,细胞毒性可能会在TMC与DNA解离后发生。季铵化程度低的TMC与DNA的结合位点相对较少,在转染细胞后容易解离而被细胞排出,故与DNA纳米复合物的细胞毒性较低。

2.5 TMC/pDNA转染细胞

倒置荧光显微镜观察显示,从转染后24 h开始,样品孔和阳性对照孔HepG 2细胞能够观察到绿色荧光点,表明基因已经被纳米粒递送到细胞内,并开始表达产生绿色荧光蛋白。随着转染时间延长,在一定时间内绿色荧光点逐渐增多。以TMC28.8为载体,寻找最佳的TMC、pDNA转染比例,可以看出转染效率随其比例的增加而增加。m(TMC)/m(pDNA)=10∶1时在48 h达到最高的转染效率。用不同季铵化程度、m(TMC)/m(pDNA)=10∶1的TMC/pDNA纳米粒子转染细胞,结果可以看到在没有任何载体的转运下,质粒对细胞的转染效率极低(转染率15%),几乎观察不到荧光。使用Lipo 2000作载体,转染效率较高(转染率50%),结果见图6(b)。使用TMC作载体,m(TMC)/m(pDNA)=10∶1时,当TMC季铵化程度为12.11% 时达到最高转染效率(转染率为62%,见图6(a));但随季铵化程度升高转染效率降低,季铵化程度为63.7%时转染效率最低。同时可看到在m(TMC)/m(pDNA)=10、48 h时,TMC/pDNA对HepG 2细胞的转染效率最高。这可能是因为:(1)随TMC季铵化程度增加,TMC的表面电荷密度增加,TMC与DNA的结合力增加,DNA不容易被释放,从而不容易转染细胞;(2)季铵化程度增加,TMC的细胞毒性也增加,从而使细胞的死亡率增加,蛋白合成受到抑制[7];(3)纳米粒子的粒径也是影响转染的主要因素之一,TMC12.11/pDNA纳米粒子的粒径为223.9 nm, 这是构建体内长循环纳米粒子的较佳尺寸。

3 结论

(1)在壳聚糖分子上引入季胺基制成了N,N,N-三甲基壳聚糖盐酸盐(TMC),采用复凝聚法成功地制备了包载绿色荧光蛋白基因质粒的复合纳米粒子。纳米复合物的粒径在100～300 nm之间,带正电荷。(2)琼脂糖凝胶水平电泳结果显示TMC能与pDNA结合形成稳定的复合物,并能有效地包裹和保护pDNA,使之不受脱氧核糖核酸酶的消化。不同季胺化程度的TMC在HepG 2细胞中的转染效率与脂质体相似或较高,但细胞毒性较脂质体低。(3)当TMC与pDNA的质量比为10∶1、48 h时,对HePG 2细胞的转染效率最高(62%)。

参考文献

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[2] Elsie Khai-Woon Toh,Hsing-Yin Chen,Yu-Lun Lo,et al.Succinated chitosan as a gene carrier for improved chitosansolubility and gene transfection[J].Nanomedicine:Nano-techn,Biol Med,2011,2(7):174

[3] Marc Lavertu,Stephane Méthot,Nicolas Tran-Khanh,etal.High efficiency gene transfer using chitosan/DNA nano-particles with specific combinations of molecular weight anddegree of deacetylation[J].Biomaterials,2006,27(27):4815

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[5] Liu Fanna,Rao Huaxin,Zhang Ziyong.The synthesize anduptake study of quaternized chitosan nano-sized fluorescenceprobe[J].J Funct Mater,2008,39(5):857刘璠娜,饶华新,张子勇.季铵盐壳聚糖纳米荧光探针的制备及细胞渗入研究[J].功能材料,2008,39(5):857

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基因治疗中载体的研究 第2篇

基因治疗中载体的研究

基因治疗是当今研究领域中的热点课题之一，其中的难点之一是如何将目标基因导入靶点――即载体的选择。近年来，随着研究的深入，已从最初的理化转染技术发展到利用各种微生物的特性达到转染目的。笔者通过对近年来国外基因治疗研究中有关载体的.选择、各自的优缺点及其在不同临床治疗中的应用作一分析、比较，阐述了基因治疗这一新兴领域中关于载体的国外动态及其应用前景。

作 者：胥明 刘顺英 XU Ming LIU Shun-ying 作者单位：东南大学附属中大医院,刊 名：铁道医学 ISTIC英文刊名：RAILWAY MEDICAL JOURNAL年，卷(期)：29(2)分类号：A394关键词：基因治疗 载体

纳米基因载体 第3篇

为弥补以上非病毒载体的不足,基于纳米羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2,HAp)的基因载体研究越来越受关注。研究已证实:纳米HAp安全性高、生物相容性好,对正常细胞几乎没有毒性[6];纳米HAp可被细胞降解,降解时间与材料性能密切关联[7];通过尺度控制可实现物理靶向性;相对于病毒载体,纳米HAp无免疫原性,不会引起机体的免疫反应[8,9]。

纳米HAp用作药物载体或基因治疗载体已成为生物材料领域的研究热点之一,对拓宽非病毒载体的研究具有十分重要的意义。目前限制纳米HAp作为基因治疗载体的原因主要是转染效率低,提高转染效率是其关键问题。图1[10]为脂质体作为基因载体转染进细胞后的代谢过程,目前已证实多数非病毒载体包括纳米HAp,进入细胞后均具有类似的过程:当纳米HAp颗粒转染进入细胞后,部分HAp-DNA复合体进入细胞被溶酶体吞噬并降解,降低了纳米HAp颗粒转染效率[11,12]。纳米HAp的转染效率除与细胞有关外,还与HAp自身的理化性质(形貌、大小、晶型、表面电荷)密切关联,只有提高纳米HAp的转染效率并优化颗粒靶向性才能将其最终应用到临床。

纳米HAp携载治疗基因的抑癌效果研究已取得了积极成果,并且发现纳米HAp与部分抑癌基因如p53存在协同抑癌效应[13,14],然而纳米HAp较低的转染效率仍然是其达到理想抑癌效果的主要限制因素,因此寻找提高纳米HAp的转染效率的方法是目前研究的热点之一。

本文就纳米HAp用作基因载体转染细胞的研究现状以及影响其转染效率的因素做全面综述并对提高纳米HAp的靶向性的途径展开论述。

1 HAp-DNA的结合方式

目前制备HAp-DNA复合物有两种方法:一是在制备HAp的过程中将其与DNA以共沉淀方式形成HAp-DNA复合物;二是在制备纳米HAp后,通过纳米颗粒表面吸附DNA后形成HAp-DNA复合物。通过琼脂糖凝胶电泳和Z电位仪可以检测HAp负载DNA的效率。Bisht等[11]研究了上述两种方法对DNA的吸附能力,发现共沉淀方法合成的HAp-DNA复合物能有效抑制DNA酶对DNA的降解,而通过表面吸附的DNA则易被DNA酶分解。他们还发现在酸性条件下(pH=5.0)时,由于纳米HAp的分解,DNA能从HAp中释放出来;在碱性条件下(pH=8.0)时,HAp几乎没有分解,而DNA也不会从HAp中释放,如图2所示[11](其中:泳带1,Hind Ⅲ 酶切过的DNA;泳带2,pSVβgal DNA;泳带3-7,DNA在37℃释放0h、1h、2h、4h、24h的电泳结果)。

Xia等[15]在研究HAp结合DNA的过程时发现,将pDNA加入到纳米HAp悬液后涡旋10s,HAp能够充分负载pDNA。Wu等[16]在室温下,将1.43g/L pEGFPC2-NT3加入到等体积的表面呈正电性的HAp悬液中(1g/L),轻微充分摇匀,电泳发现HAp同样能够与DNA充分结合。HAp与DNA的结合能力与纳米HAp的形状、表面粗糙度及表面电荷密切关联。球形、面粗糙度大、表面带正电荷的纳米HAp颗粒会更加稳定地携载DNA。通过共沉淀方法制备的HAp-DNA复合物比较稳定,但结合DNA的量较少,且释放缓慢,另外具有复合物的溶液保存条件严格、时间短,制备步骤繁琐等不足。为便于临床应用,采用HAp先合成再携载DNA的方法更方便、经济、实用。

图2 DNA在pH 5.0(a)和pH 8.0(b)的溶液中的释放[11]Fig.2 DNA release at pH 5.0(a)and pH 8.0(b)shown by gel electrophoresis[11]

2 影响纳米HAp转染效率的因素

由于纳米HAp的转染效率较低,目前研究纳米HAp携载目的基因抑癌效果的研究尚少[13,17]。因此进一步研究影响纳米HAp转染效率的各种因素对HAp用于癌症基因治疗具有十分重要的理论意义。

2.1 表面电荷对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体的表面电荷是影响其转染效率最关键的因素。纳米HAp在偏中性(pH=7.4)溶液中重悬后表面呈负电性,当它携载目的基因转染细胞时,因与细胞表面负电荷[18]排斥作用,使纳米HAp的转染效率不高。多数研究表明,表面带有正电荷的纳米颗粒的转染效率明显高于表面带有负电荷或者不带电荷的纳米颗粒[19,20]。使颗粒表面带正电的方法主要是采用呈正电性的试剂对颗粒进行表面修饰,Chen等[16]采用PEI修饰纳米颗粒并使表面带有正电荷,研究发现,修饰过的基因载体的转染效率得到明显提高。Chen等[21]用12-氨基-十二烷酸对HAp颗粒表面进行带正电荷的表面修饰,研究发现,修饰后的纳米HAp表面电位明显提高(如图3所示,其中(a)12-氨基-十二烷酸,(b)酸性十二烷酸,(c)十二烷酸,(d)对照),用其转染成骨细胞,与带负电或中性电荷的纳米HAp相比,其转染效率明显提升,且修饰后的HAp能够明显促进成骨细胞的分裂增殖。

在纳米HAp的制备过程中添加辅助物质也可以对其表面改性,可改变纳米HAp的表面电荷并提高其转染效率。Chowdhury等[22]研究发现在制备碳酸磷灰石的过程中,添加锶和氟能够使其转染HeLa细胞的效率提高5~100 倍。Wang等[23]采用壳聚糖(CS)修饰纳米HAp表面,发现随着CS/HAp质量比的升高,其转染效率也逐渐升高。Nouri等[24]在含多种离子的模拟体液中合成了纳米磷酸钙颗粒,用其负载pEGFP/Luc后转染293T细胞,发现转染效率比在水溶液中制备的颗粒显著升高。Kimura等[25,26]利用超高静水压技术,制备了PVA/DNA颗粒,用其作为基因载体,然后采用高压方法将纳米HAp包封到PVA/DNA颗粒中制备成PVA/DNA/HAp颗粒,发现该颗粒能够有效地逃避溶酶体的降解,进入细胞核以提高转染效率。另外,表面改性的首要条件是保证改性后HAp良好的生物相容性,不同的表面修饰对细胞生物相容性、粘附性及诱导细胞凋亡的影响作用也明显不同[27]。

2.2 粒径尺寸对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体颗粒尺寸与形貌等因素与其转染效率密切相关[28],纳米HAp转染肿瘤细胞时,颗粒穿膜能力与粒径密切关联。Nadra等[29]制备了粒径为1.4~14μm的HAp颗粒并用其转染巨噬细胞,研究结果发现直径为1~2μm的HAp能够使巨噬细胞分泌TNFα的能力最强,而随颗粒粒径增大,巨噬细胞分泌的TNFα减少;当粒径增加到14μm时,细胞分泌的TNFα几乎为零,这是由于颗粒粒径太大,不能转染巨噬细胞引起的。该研究证实粒径对其转染效率具有重要的影响。

当颗粒粒径减小至纳米级(<100nm),尤其小于40nm时,颗粒进入细胞不再被受体介导的胞吞作用限制,而是由细胞直接吞噬,纳米颗粒的转染效率会明显提高[30]。尽管如此,不同颗粒与细胞间的作用呈现明显区别。Lin等[31]以SiO2为研究对象,研究发现直径为15nm和45nm的SiO2均对细胞有明显毒性,且毒性差异不大。Oberdürster等[32]研究表明具有相同尺度的超细TiO2颗粒则能引起严重的肺部炎症反应。这说明当上述两种颗粒的直径减小到纳米级时,转染效率会增加,对机体也产生较大毒性。然而纳米HAp在同样的尺度下对细胞却有良好的生物相容性。Cai等[33]制备了3种不同粒径的纳米HAp(粒径分别为20nm、40nm和80nm),研究发现不同粒径的纳米HAp对骨髓干细胞(MSCs)和骨肉瘤细胞(U2OS)的增殖作用存在明显差异,HAp能促进MSCs分裂而抑制U2OS的分裂,粒径为20nm的HAp效果最显著。该研究证实了纳米HAp能够促进正常细胞的增殖,而抑制癌细胞的增殖,HAp粒径越小对正常细胞生物相容性越好。

HAp的粒径对转染效率的研究虽还没有统一定论,但转染效率除与纳米载体自身的理化性质有关外,还与所转染的细胞类型有关。正常细胞具有一定的免疫功能,进入胞内的外来载体被细胞识别为“异物”,被溶酶体分解。然而癌细胞不能正确识别“自己”和“非己”,不能通过溶酶体完全分解进入胞内的“异物”颗粒,从而可使部分携载治疗性目的基因的载体进入细胞核。

2.3 形貌对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体颗粒的形貌包括HAp的形状和表面形貌。目前已报道的纳米HAp的形状主要有球形[34]、棒状[35,36]、针状[37]和纤维状[38]。根据Gao等[30]提出的受体介导的胞吞作用理论,直径为50~60nm球形纳米颗粒的转染效率最高。Zhao等[39]采用粒径40~60nm球形纳米HAp、棒状纳米HAp分别转染成骨细胞,结果表明球形HAp的转染效率显著高于棒状HAp。Motskin等[40]研究球形和棒状HAp转染人单核巨噬细胞时发现,棒状HAp的转染效率高达30%以上,而球形HAp的转染效率仅为2.7%。这些研究结果表明纳米HAp的转染效率与其形貌密切相关,当然同一形貌的纳米颗粒在转染不同的细胞时,其转染效率也会存在差异。

2.4 钙磷比对纳米HAp转染效率的影响

HAp-DNA转染效率主要受以上3个因素影响,已有研究表明改变HAp的钙磷比也可以提高转染效率。Olton等[41]调节Ca/P比例,当Ca/P的摩尔质量比为100~300时制备出颗粒粒径在25~50nm的HAp,携载DNA能够达到90%,转染MC3T3-E1和HeLa细胞的效率在70%以上。

3 纳米HAp的靶向性

纳米HAp载体具有一定的靶向性,然而其靶向性不高,是限制其用于癌症基因治疗的重要因素之一。研究提高纳米HAp靶向性的方法对其用作基因、药物载体的研究具有重要的价值。

Zhu等[42]制备长度为40~50nm的针状HAp,携载pEGFP-N1基因,通过尾部静脉注射到小鼠体内后,发现HAp颗粒主要分布在肝、肾、脑的细胞质内,少量分布在细胞核中。Roy等将HAp颗粒经尾部静脉注射进入小鼠体内后,发现HAp具有肝靶向性[43],并可通过肝脏代谢分解掉。蒋明等[44]利用HAp负载pEGFP-NT3基因,通过耳蜗灌注法,将基因转染进豚鼠损伤的耳蜗,结果在神经节细胞内检测到NT3 蛋白的表达对受损的耳有明显修复作用。Wu等[16]利用聚乙烯亚胺(PEI)修饰HAp颗粒,HAp负载pEG-FPC2-NT3后被注射到南美栗鼠的中耳与内耳之间圆窗膜,48h后检测荧光的表达量,发现在基底膜柱细胞中有荧光表达,表明经PEI修饰的HAp具有一定的靶向性。

改善载体颗粒的靶向性有两种方法:一种是采用癌细胞表面特异识别配体(如叶酸[45]、转铁蛋白[46]及(AspSer-Ser)6[47]等)对载体表面进行修饰,实现载体的主动靶向性。转铁蛋白受体在癌细胞表面大量分布,是临床检测评价体内是否有癌症存在的一种重要参数,Davis等[46]以此为靶标(图4为靶向纳米颗粒设计示意图),采用转铁蛋白修饰环糊精颗粒,携载siRNA治疗人急性黑色素瘤,注射到人体后检测发现载体能靶向转染黑色素瘤细胞。Zhang等[47]制备出一种(AspSerSer)6-脂质体载体,它与HAp具有高度亲和力,用其携载Plekho1siRNA,进入体内能靶向成骨细胞,并发现成骨细胞中Plekho1蛋白表达量快速下降至最终消失,成功解决了骨代谢疾病治疗的靶向性问题。另一方法是实现载体的被动靶向性,可通过控制纳米颗粒的粒径或合成过程中添加磁性元素(如Fe2+/Fe[48,49])。在人体中,肿瘤组织血管壁的细胞间隙为200~300nm,而正常组织血管壁的细胞间隙为100~200nm,当纳米HAp颈静脉注射后,可使纳米HAp通过细胞间隙扩散到周围组织中,实现对肿瘤的被动靶向性[50,51]。

4 展望

纳米纤维载体与其药物缓释 第4篇

1 电纺丝纳米纤维作为药物载体

目前, 随着电纺丝技术的应用与发展, 有学者[1,2,3]采用生物可降解合成高分子材料通过电纺丝作为药物载体, 研究其对药物的控制释放性能。最早提到采用电纺纤维进行载药是出现在2001年的一项美国专利中[4], Ignatious和Baldoni两人用电纺丝纳米纤维设计出分别具有快速、即时、延时、缓慢、持续及阶段性等不同释药特性的复合药剂。在该专利中, 他们还提到药物在纳米纤维中可能存在四种模式:a.载药材料形成纳米纤维, 药物呈颗粒状附在纤维表面;b.药物和载药材料都为纳米纤维, 最终产物是两种纤维交错而成;c.药物和载药材料混合在一起结合成一种纤维, 它同时含有这两样组分;d.承载材料被电纺丝成管状, 将药物颗粒封装在里面。

在国内, 景遐斌等人先后对BCNU (1, 3-二 (2-氯乙基) -1-亚硝基脲) , 阿霉素, 以及盐酸阿霉素等几种抗癌药物进行了电纺纤维载药实验[5,6], 用到的生物可降解性高分子包括了聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯以及它们的无规和嵌段共聚物等, 这些材料在人体内能被酶降解, 不会留下残余影响。用小鼠进行实验, 发现高分子纤维本身对C6神经胶质瘤细胞并无作用, 而载药的纤维能表现出良好的抗肿瘤活性。对阿霉素及盐酸阿霉素的实验表明, 药物在纤维中的释放遵循联合扩散机制和酶降解机制, 突释效应明显降低, 从而有效减轻了药物的毒副作用。对BCNU的实验表明, 电纺纤维载药除了减轻突释效应外, 还能有效避免药物的降解, 对敏感药物在人体内的释放起了良好的保护作用。

电纺丝纳米纤维在对抗生素进行载药时主要有两方面的应用。一方面, 某些药物不溶于水或不易为人体吸收, 而用电纺丝方法制得的载药纤维毡, 能有效增大药剂的表面积, 药物便会在自身的扩散作用下随着纤维的降解而缓慢为人体所吸收, 释药时间延长, 释药浓度也变得较为平缓, 这一切都使得药物能充分地为人体所吸收, 最大限度地发挥药物的功效。抗生素也是电纺纤维载药中用得最早的一类。另一方面, 封装有药物的纳米纤维, 更广泛地应用在药物的局部释放和伤口护理中, 尤其是作为手术后的纱布以防止创面粘连和伤口感染。

利用静电纺丝制得的高分子纳米纤维, 也是一种良好的载药材料。静电纺制备再生丝素纳米纤维[7,8,9]及丝素与其他天然高聚物复合纳米纤维已有一定研究[10,11], 通过实验证明[12], 静电纺再生丝素纳米纤维作为药物载体, 对药物具有缓释作用, 当含药量相同时, 释药速度随丝素纳米纤维质量分数的增加而减小;当丝素纳米纤维质量分数相同时, 随含药量的增加, 前期释药速度增大, 后期释药速度减缓, 释药时间延长。

2 以PLGA制成纳米纤维作为药物载体

新加坡国立大学的Jingwei Xie和Chi-Hwa Wang两人以PLGA (聚乳酸/乙醇酸共聚物) 作为药物载体, 制得了载有抗癌药物紫杉醇的载药纤维, 其直径可以在几十纳米到几十微米的范围内调节, 纤维对药物的封装效果超过了90%。DSC检测表明, 药物在纤维中以固态颗粒形式存在。体外释放实验中, 紫杉醇的有效缓释期长达60天以上。

3 影响纳米纤维作为药物载体释药性能的因素

我们用纳米纤维进行载药时, 不仅希望纤维能控制释药, 而且希望药物的控制释放能达到一定的精确效果, 目前对于这方面的研究尚处于初步阶段, 不过总体看来, 影响纤维释药性能的因素主要包括以下几个方面:a.药物本身的性质, 如溶解性, 亲水性, 药物与载药分子之间的相容性等;b.载药材料的性质, 如分子量, 生物降解性/吸收性等;c.加工方式与加工参数。此外, 纤维中药物的加入也会在一定程度上影响纤维的直径和表面形貌, 从而影响其最终的释药性能。

结束语

理想的药物载体是能够携带多种化学药物, 足够的药量, 通过对药物的吸附、包裹和结合, 可实现对药物靶向传输, 降低它对机体的副作用, 降低机体对药物的敏感, 提高药物的生物利用率。纳米纤维是一种新型的较为理想的药物载体, 它可以降低对机体的副作用, 控制药物在人体的释放速度和释放周期。随着生物材料科学的迅速发展, 还会有很多具有良好生物相容性和生物降解性的高分子材料如脂质体, 树枝大分子, 聚合物的微粒通过不同的工艺技术制备成各种大小、形状、理化特性的药物载体。因此, 对药物载体的研究是一个非常值得研究的项目。

摘要：研制新的药物载体, 将纳米纤维作为新的载药体, 延长药物在机体的释放速度, 减小对机体的副作用, 提高生物利用度。

关键词：药物载体,药物缓释,纳米纤维载体

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快速确定基因的载体 第5篇

预期结果和结论:

1.1、

如果两组杂交后代的性状相同,均为绿茎或紫茎,则说明控制这对相对性状的基因位于细胞核的染色体上(同时也可得出这对基因的显隐性)。

1.2、

如果两组杂交后代的性状不同,正交后代为绿茎,反交后代为紫茎(或均和母本相同),则说明控制这对相对性状的基因位于细胞质。

2、确认核基因位于常染色体上还是性染色体上

2.1、常染色体遗传特点——正反交结果相同

真核细胞在进行有性生殖时,父方与母方常染色体上的基因都是成对存在的,减数分裂产生的配子不论精子或卵细胞中总含成对基因中的一个,即子代体细胞中的基因一个来自父方,一个来自母方,且雌雄性别的子代获得父本与母本双方常染色体基因的概率相当——位于常染色体上基因遗传时正反交结果相同。

2.2、性染色体遗传特点——正反交结果有异,往往与性别相联系

若控制某性状的基因只位于X染色体上(Y染色体上无其等位基因),则父方仅含一条X染色体,且该染色体只传向雌性子代,不传向雄性子代。同理,当控制某性状的基因只位于Y染色体上时,父方的Y染色体只传向其雄性子代,不传向雌性子代。因此,当基因位于性染色体上时,其传递往往与性别相联系,即位于性染色体上的基因所控制的性状正反交结果往往不同,而基因位于常染色体上时传递与性别无关。

可见要确认控制某性状的核基因具体位于常染色体上,还是性染色体上,常采用“正反交实验”予以确认,即

若正反交结果相同,且性状在雌雄两性中表现相当——基因位于常染色体上;

若正反交子代结果不同且性状在雌雄两性中表现不平衡,即;与性别相联系——基因位于X染色体上;

若正反交子代结果不同且性状只在雄性中表现——基因在Y染色体上。

例:实验室有三个不同的纯种果蝇突变品系a、b、c,均由某纯种野生型果蝇突变而来。现以这些未交配过的果蝇为材料,设计实验探究突变基因a、b、c位于细胞质还是位于细胞核的染色体上,请写出实验思路,并推测预期结果及相应的结论。

解析:

实验思路:分别用突变型a、b、c和野生型果蝇做一个正交、反交实验,然后观察和记录子代果蝇的性状表现。

预期结果和结论:

2.2.1、

如果正交和反交的子代性状相同,均为野生型或突变型,则说明控制这对相对性状的基因位于细胞核的常染色体上(同时也可得出这对基因的显隐性)

2.2.2、

如果正交和反交的子代性状不同,正交后代为野生型,反交后代为突变型(或均和母本相同),则说明控制这对相对性状的基因位于细胞质。

2.2.3、

如果正交和反交的子代性状不同,一个杂交组合后代雌雄个体性状表现相同,均为野生型或突变型,另一个杂交组合后代雌雄个体性状表现不同,雌性表现一个性状,雄性表现为另一个性状,则说明控制这对相对性状的基因位于细胞核的X染色体上(同时也可得出这对基因的显隐性,第一个杂交组合的子代或第二个杂交组合的雌性子代的性状即为显性性状)。

总之,要快速确认控制某性状的基因具体位于何种载体上(即位于常染色体上、性染色体上还是细胞质中),常采用“正反交实验”予以确认,即

1、若正反交结果相同,且性状在雌雄两性中表现相当——基因位于常染色体上。

2、若正反交结果不同:

(1)无论正交还是反交,均表现母本性状,则基因位于细胞质中;

(2)若正反交子代结果不同且性状在雌雄两性中表现不平衡,即,与性别相联系——基因位于X染色体上;

多壁碳纳米管载体的改性及应用 第6篇

碳纳米管分为多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotube,MWNT)和单壁碳纳米管。与单壁碳纳米管相比,多壁碳纳米管由多层石墨烯片结合而成,容易制备,成本低,主要为介孔;与活性炭相比,多壁碳纳米管具有较多介孔,非常有利于物质传递;与氧化铝和二氧化硅等氧化物载体相比,多壁碳纳米管不仅比表面积大,而且催化剂失活后可以通过完全燃烧来回收负载的贵金属。

多壁碳纳米管作为载体有诸多优势,但由于表面惰性及疏水性,影响了活性组分的分散,一定程度上限制了它的使用,因而对碳纳米管表面改性的研究显得尤为重要[1,2]。多壁碳纳米管的表面改性可通过物理与化学2种方式进行,改性方法主要有超声波改性、共价改性和非共价改性等。本文主要从催化应用的角度对多壁碳纳米管的表面改性及应用现状做一综述。

1 超声波改性法

超声波法是纯物理方法。超声波处理的碳纳米管以其平衡位置为中心作高速振动,纳米颗粒摆脱粒子间的吸附而分离,阻止溶液中纳米颗粒团聚,让碳纳米管与溶液充分接触,使金属粒子有机会附着在碳纳米管表面[3,4],同时,超声波对碳纳米管的分散作用还可应用于碳纳米管载体催化剂的制备过程中,对活性组分的沉积有很好的效果。

Tong等[5]采用超声波照射的液相还原法得到平均粒径3.4nm、分散较均匀的Pt/MWNT催化剂,其对甲醇电催化氧化具有较好的催化效果。超声波照射时间影响催化剂性能,时间过短,反应不完全,沉积的Pt粒子过少导致催化性能不好;时间过长,Pt颗粒长大且部分从载体上脱落也影响催化效果。而没有超声波照射的情况下,多壁碳纳米管载体表面基本没有Pt离子沉积,超声波照射在活性组分Pt的负载上起决定性的作用。Yang等[6]证实超声波辅助共价酸改性多壁碳纳米管制备的PtRu/MWNT催化剂在甲醇电催化氧化反应中不仅具有较高的电催化性能,还具有较好的抗中毒能力。

超声波能够使多壁碳纳米管较好地分散于溶剂中,但超声一停止,多壁碳纳米管的分散稳定性就会变差,影响催化剂性能。单独使用超声波并不能改变碳纳米管的表面结构和性质,因此不能完成对碳纳米管的改性。共价和非共价改性则可改变碳纳米管表面的惰性和疏水性,使碳纳米管能够更好地分散到溶剂中,增加与活性组分的接触,得到高负载和分散均匀的负载型催化剂。

2 共价改性法

共价改性法主要是通过共用电子对对碳纳米管进行表面改性,使多壁碳纳米管表面产生畸变,生成含氧基团,有利于活性组分的负载。其改性方法很多,作为催化剂载体使用的碳纳米管改性主要集中于酸及其后功能化改性。

2.1 酸表面氧化改性

多壁碳纳米管不易被氧化剂侵蚀,一般氧化仅仅起到纯化的作用,但在苛刻的氧化条件下,多壁碳纳米管表面可以生成极性含氧基团,亲水性大大增加,同时也可获得高分散金属粒子。常用氧化剂为浓硝酸、浓硝酸和浓硫酸的混酸、高锰酸钾和浓硫酸的混酸等。酸表面氧化改性的多壁碳纳米管负载型催化剂可用于光催化反应、燃料电池、加氢与脱氢等反应,还可用于制备碳纳米管。

经混酸处理过的多壁碳纳米管作为镍催化剂的载体用于丙烯分解制备碳纳米管的反应中发现[7],酸处理的碳纳米管在几何结构上更规整,表面具有亲水性,容易与金属前驱体结合,比表面积也更大,小颗粒金属均匀地分散在载体表面,从而提高了催化剂的活性、选择性和产品的质量。

Wang等[8]用浓酸对多壁碳纳米管进行表面处理后,采用改性的溶胶-凝胶法制备了TiO2-MWNT,并将其用于光降解苯酚中,发现可见光照射5h后,降解率即达100%;采用两者机械混合型催化剂在可见光照射8h后苯酚才全部降解,而纯二氧化钛在光照5h后只降解40.6%,反应完全需10h。TiO2-MWNT催化剂中,多壁碳纳米管阻止了二氧化钛的团聚,使复合物的比表面积大于其它二氧化钛催化材料。二氧化钛是被公认的光催化剂,多壁碳纳米管单独使用也表现出了一定的催化效果[9,10],而氧化物与碳纳米管之间的协同作用使两者之间具有较强的界面结合力,从而使该催化剂显示出了最好的催化效果。Wang等[11]对该催化剂进行吸收光谱测试发现,与市场上购买的P25相比,复合催化剂的光谱发生了红移,并且在长波处的吸收峰增强,随着多壁碳纳米管在复合物中含量的增加,吸收峰逐渐增强,表明多壁碳纳米管的加入增加了复合物中氧化物表面的电荷,从而影响光催化反应中电子/空穴对的形成,多壁碳纳米管与氧化物之间的协同效应在光催化反应中起到不可忽视的作用。

改性后的多壁碳纳米管代替活性炭作燃料电池的电极载体,负载型电极可以像金属电极一样高效,Pt、Ru及PtRu电极已在氧的还原反应及甲醇的直接氧化反应中得到了测试。采用HNO3和H2SO4-K2Cr2O7官能化制备的Pt/MWNT作为电极来催化还原氧的燃料电池时[12]发现,官能化的多壁碳纳米管表面均匀、密集地分布着贵金属Pt粒子,粒径范围在1~5nm,因此电极的催化效率高;而未经官能化的多壁碳纳米管表面稀疏地分布着Pt颗粒,活性组分明显少于前者,因此官能化作用是获得高效电极的重要因素。Rt/MWNT用于甲醇直接氧化电极[13],可获得比Rt/AC(AC,活性炭)电极高出6倍以上的电流密度,是因为多壁碳纳米管具有更好的导电性,纯度高,内部几乎不含硫,而活性炭中的有机硫易使催化剂中毒。Cui等[14]采用改性的浸渍法制备了PtRu/MWNT及PtRu/AC催化剂,用于甲醇电催化氧化,发现PtRu/MWNT参与下的峰电流密度为34mA/cm2,PtRu/AC参与下的峰电流密度为27mA/cm2;同时,PtRu/MWNT催化剂表现出了高的初始电流密度与极限电流密度,说明PtRu/MWNT催化剂具有较好的活性与稳定性。XRD结果显示,与活性炭相比,多壁碳纳米管中含有更多的石墨结构。2种载体所得的催化剂在分散程度与粒径上差别不大,但是在催化实验中表现出不同的催化效果,这与多壁碳纳米管的石墨化结构、电性能有关。

酸表面改性的多壁碳纳米管用于加氢反应也有很好的效果。Li等[15]用混酸对碳载体进行表面改性,制备了负载Pt的催化剂,用于硝基苯加氢生成苯胺的液相反应中。Pt/MWNT和Pt/AC的比表面积分别为165m2/g和380m2/g,介孔与微孔的占有体积比分别为63.38和10.76,均主要为介孔,但多壁碳纳米管介孔所占的体积远大于活性炭,介孔有利于金属Pt粒子在多壁碳纳米管表面的分散。TEM观察到,Pt/MWNT中纳米颗粒粒径在3~5nm,沉积于多壁碳纳米管上的纳米颗粒分散均一;而Pt/AC中纳米颗粒粒径为8~10nm,沉积于活性炭上的纳米颗粒发生团聚。在常温、常压下,负载量均为1%时,Pt/MWNT催化剂上产生90%的苯胺仅需240min,而Pt/AC上需600min。

Liu等[16]研究了碳纳米管酸氧化改性对Co/MWNT催化剂催化脱氢性能的影响,发现未氧化碳纳米管表面上的Co粒子团聚严重,而氧化过的碳纳米管表面上的Co粒子分布均匀,氧化过的碳纳米管阻止了金属粒子发生团聚,使金属得到很好的分散,高浓度的表面缺陷是产生这一结果的主要原因。实验证明,改性和未改性Co/MWNT对环己醇氧化成环己酮的反应表现出几乎相同的选择性,但环己醇的转化率不相同,改性Co/MWNT催化剂上原料的转化率较未改性的高出20%,说明这类催化剂的催化脱氢活性与碳纳米管载体表面的缺陷密切相关。

Zhang等[17]将酸改性前后多壁碳纳米管为载体制备的Ni/MWNT用于甲醇直接气相羰基化反应,发现未改性Ni/MWNT上甲醇转化率较低,且只有甲醚生成,未检测到目标产物乙酸;用硝酸处理后制备的催化剂上甲醇的转化率、乙酸的选择性和收率大大增加。镍颗粒负载在未经酸改性的多壁碳纳米管上时数量少且团聚;镍负载于酸改性后的多壁碳纳米管,镍颗粒数量明显增多,同时颗粒呈均匀分布状态。

2.2 表面后功能化改性

表面后功能化改性是在碳纳米管的端口、缺陷以及侧壁进行化学修饰,通过对酸处理产生的含氧基团进行酰胺化、酰氯化等反应接上功能基团。与只进行表面氧化相比,该法可以在碳纳米管表面引入其它的官能团,有利于活性组分的负载。改性后的多壁碳纳米管载体可用于电催化氧化甲醇反应与加氢反应。

2.2.1 酰胺化反应

通过碳纳米管表面羧基与氨基的反应可以得到酰胺化的多壁碳纳米管载体。以ZnO/MWNT光催化剂的制备为例[18],经浓硝酸处理的多壁碳纳米管加入到氯化锌和氨水的混合溶液中(已形成Zn(NH3)42+),金属前驱体通过C-N键连接到多壁碳纳米管表面,即氨基化合物与羧基反应后形成CONH-Zn(NH3)32+,经水洗、干燥、煅烧使氧化锌纳米颗粒沉积在多壁碳纳米管表面。Chen等[19]采用溶胶-凝胶法制备了单晶氧化锌修饰的多壁碳纳米管催化剂,多壁碳纳米管经酸化、酰胺化后,与柠檬酸反应,得到柠檬酸改性的多壁碳纳米管。柠檬酸作为一种阴离子表面活性剂,增强了多壁碳纳米管的亲水性能,同时锌的前驱体与其配位而锚定于多壁碳纳米管上。拉曼光谱显示,与纯ZnO相比,ZnO/MWNT发生了轻微的红移。

多壁碳纳米管表面的羧酸官能团可与四氨苯磺酸在异戊基亚硝酸盐溶液中发生聚合反应,得到苯磺酸改性的多壁碳纳米管。将此碳纳米管与金属盐溶液混合,在还原剂的存在下得到Pd/MWNT催化剂[20],其在电催化氧化甲醇的反应中表现出了高的电催化活性、抗中毒能力和稳定性。可能的原因是:(1)Pd粒子与多壁碳纳米管表面的磺酸官能团直接连接,从而获得了粒径均一、高分散的Pd/MWNT催化剂;(2)即使Pd颗粒直接沉积于多壁碳纳米管表面,苯磺酸官能团的存在也能阻止Pd颗粒之间的团聚;(3)Pd-亲水磺酸官能团-MWNT的特殊结构和性质,易于使电解液离子在催化剂表面传递,有利于催化反应的进行。

2.2.2 酰氯化反应

Lu等[21]用亚硫酰氯处理经酸化的MWNT,使其表面变为酰氯官能团,再将其与G4-PAMAM在二甲基酰胺(DMF)水溶液中反应,得到共价改性的多壁碳纳米管,最后将改性的多壁碳纳米管分别浸入硅酸四乙酯(TEOS)和四异丙基钛(TTIP),通过自身的水解分别形成SiO2/MWNT和TiO2/MWNT。G4-PAMAM能起到形成、锚定和抑制氧化物颗粒生长的作用,未加入G4-PAMAM时,多壁碳纳米管负载的氧化物活性组分量很少,颗粒较大。

2.2.3 静电吸附反应

根据活性组分选取不同的聚合物/簇合物[22,23],通过酸处理的多壁碳纳米管表面所含羧酸官能团的静电吸引作用,与之结合可得到新改性的载体,再通过一系列的过程来制备负载型催化剂。

采用聚二丙烯基二甲基氯化铵(PDADMAC)制备的Au/MWNT催化剂[24],利用静电力通过阳离子聚合物加强Au纳米粒子在MWNT表面的吸附,获得高度分散、形态均一的Au/MWNT。用无机金属簇合物H3PMo12O40(简写为PMo12)可制备高分散的Pt-PMo12-MWNT型催化剂[25]。无机金属簇合物的加入使Pt粒径的分布范围变窄,粒度更均一:Pt-PMo12-MWNT中Pt的粒径为2.6~4.7nm,平均粒径为(3.0±0.2)nm;而未经PMo12改性的Pt/MWNT中Pt的粒径为2.6~8.5nm,平均粒径为(4.1±0.5)nm。因无机金属簇合物包覆在Pt表面,聚合物表面带有大量的负电荷,在颗粒相互接触碰撞中,同种电荷之间的排斥作用使颗粒不易团聚;同时PMo12的加入还改善了多壁碳纳米管的分散性。SEM显示,Pt/MWNT中多壁碳纳米管之间发生了缠绕,而Pt-PMo12-MWNT中几乎没有发现此现象。甲醇电催化氧化活性测试结果显示,无机金属簇合物的加入提高了催化剂的活性、抗中毒能力和稳定性。循环伏安曲线峰电流越大说明催化剂的催化效果越好,加入无机金属簇合物的催化剂的峰电流大于未加入聚合物的催化剂的峰电流;循环伏安曲线中氧化还原峰的电流比值(If/Ib)越大说明催化剂的抗中毒能力越强,Pt-PMo12-MWNT为催化剂时,If/Ib为0.86,Pt/MWNT为催化剂时,If/Ib为0.78;对催化剂进行了多次循环伏安测试,Pt-PMo12-MWNT的循环伏安曲线显出较好的重复性,循环伏安曲线连续扫描125次,曲线的重复性几乎不变[26],说明该催化剂的稳定性很好。

2.2.4 有机物嫁接改性

多壁碳纳米管表面的含氧官能团变成含氧盐后,再与有机金属盐进行化学反应,可使金属前驱体接枝到碳纳米管表面,经还原即得到均匀分散负载金属的碳纳米管催化剂。

Giordano等[27]用有机金属嫁接法把Rh负载到MWNT上,先把经HNO3处理的MWNT与碳酸钠溶液反应,使MWNT表面含有-COONa基团,再让其与[RhCl(PPh3)3]反应,脱去NaCl,最后在H2气氛下还原即可把Rh均匀地负载到MWNT上。将1%Rh/MWNT-COONa(比表面积180m2/g)催化剂用于肉桂醛液相加氢制备氢化肉桂醛反应,转化率比1%Rh/AC-COONa(比表面积700m2/g)高出3倍多,对氢化肉桂醛的选择性达100%。仅经硝酸处理过的多壁碳纳米管负载的催化剂粒子,其粒径为2.5~5nm,含有-COONa官能团的多壁碳纳米管负载的催化剂粒子,其粒径为1.5~2.5nm。碳纳米管表面的-COONa与金属盐易发生化学反应,使金属离子高度分散在碳纳米管上。

共价改性法是经酸处理后在表面引入-OH、-COOH、-C=O等官能团,增加碳纳米管表面的亲水性,使活性组分的前驱体溶液更易接近其表面,从而使活性组分在其表面得到较好分散。但共价改性法破坏了碳纳米管的结构和完整性,在一定程度上破坏了碳纳米管导电等特性,对某些反应不利,因而使碳纳米管在催化领域中的应用受到限制。

3 非共价改性法

非共价改性是用表面活性剂/水溶性聚合物等[28,29]通过非共价相互作用对碳纳米管侧壁进行包裹,将MWNT从成簇的管束中分离出来得到单根可溶的MWNT,实现碳纳米管在溶液中的分散。与共价改性不同,非共价改性是通过碳纳米管表面高度离域化的π电子与含有π电子的其它化合物通过π-π非共价健作用结合的,能在保持碳纳米管结构完整的前提下得到亲水性的多壁碳纳米管。非共价改性包括表面活性剂(烷基类和水溶性聚合物类)改性和有机分子改性。改性后的多壁碳纳米管较多用于光催化反应,也用于加氢反应和电催化反应。

3.1 表面活性剂改性

表面活性剂改性是在多壁碳纳米管表面包覆一层表面活性剂,通过静电引力负载活性组分前驱体,再经一系列处理得到所需催化剂。表面活性剂可以提高碳纳米管的亲水性,使碳纳米管不易团聚,同时为活性组分的负载提供了锚定点[30]。

3.1.1 烷基类表面活性剂改性

烷基类表面活性剂主要为阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDS)和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等。

Jiang等[31]将通过SDS改性合成的氧化锌包覆多壁碳纳米管型光催化剂ZnO/MWNT用于光催化降解亚甲基蓝(MB)。与纯氧化锌纳米颗粒、多壁碳纳米管及两者的机械混合物进行比较,ZnO/MWNT表现出最好的催化效果。SDS的加入有助于多壁碳纳米管在溶剂中的分散,使多壁碳纳米管表面引入大量负电荷,在溶液中通过静电吸引作用与锌相连,增强负载组分ZnO与载体MWNT之间的结合。在紫外光的照射下,多壁碳纳米管是较好的电子接收体,而纳米氧化锌则是公认的电子给予体,多壁碳纳米管与氧化锌之间的相互作用促进了多壁碳纳米管与纳米氧化锌界面之间的电子传递过程。通过SDS改性制备的光电催化剂TiO2/MWNT[32],其碳纳米管表面氧化物可有效地分散与沉积。由于多壁碳纳米管是电子的良导体,可以有序地导出电子,降低了MWNT-TiO2中的电子积累和电子与空穴的复合几率,在光照强度相同、电极电位于0.6~0.8V时,降解亚甲基蓝的速率高于纯TiO2。

SDS改性多壁碳纳米管对负载无机源活性组分尤其有利。以Al(OH)3/MWNT制备为例[33],将经过SDS改性的MWNT分别浸渍在AlCl3和AIIP(异丙醇铝)的2-丙醇中,然后于250℃热分解。结果表明,对于有机金属铝源AIIP,SDS对Al(OH)3覆盖于碳纳米管表面有阻碍作用,但对于无机铝源AlCl3,预先吸附一定量的SDS能促进MWNT与AlCl3相互作用,使AlCl3在MWNT表面均匀分布,有利于热分解所形成的Al(OH)3在MWNT表面均匀包覆。

Andrei等[34]以钛酸四丁酯为钛源,加入CTAB制备了TiO2/MWNT,发现没有CTAB参与时,沉积于多壁碳纳米管表面的锐钛矿二氧化钛粒径为3~5nm,加入CTAB后纳米二氧化钛的成核速率减慢,粒径为2~5nm,二氧化钛以膜的形式覆盖于碳纳米管表面。

3.1.2 水溶性聚合物类表面活性剂改性

水溶性聚合物类表面活性剂主要有阳离子分散剂聚乙烯亚胺(PEI)和阴离子分散剂聚丙烯酸(PAA)等。

用PEI水溶液修饰MWNT,其表面呈电正性;用NaOH溶液修饰TiO2,其表面呈电负性,混合上述溶液,超声分散作用下电负性TiO2颗粒很容易沉积到电正性MWNT表面制得TiO2/MWNT催化剂。用该催化剂进行光降解苯酚的反应[35],紫外线光照150min,降解率即达100%。

Guo等[36]用PAA修饰多壁碳纳米管表面,用金属沉积法使Pt沉积,以乙二醇为还原剂,合成的Pt-PAA-MWNT催化剂上Pt的粒径为2~3nm,为面心立方结构。用于柠檬醛加氢反应时,柠檬醛的总转化率达87.2%,而以Pt/MW-NT、Pt/AC为催化剂,柠檬醛的总转化率分别为54.5%、29.9%。以活性炭为载体时,Pt颗粒部分填入载体内部,而吸附在外表面的颗粒还会发生团聚,大大影响了催化活性。PAA修饰的载体表面含有丰富的羧基,可以使小颗粒纳米金属离子高度分散在载体表面,削弱了C=O的吸附作用,从而加强了C=C的加氢作用,有助于催化反应的进行。

3.2 有机分子改性

Mu等[37]采用有机分子三苯基膦修饰多壁碳纳米管,获得在己二醇和水的混合溶液中分散良好的碳纳米管溶液,通过超声辅助的办法加入已经制备好的Pt纳米粒子,充分搅拌,静置5天,TEM表明在碳纳米管上均匀地沉积了一层Pt,其中大部分的粒子粒径为1.7nm,将所得催化剂制成电极用于电催化氧化,比市场上购买的E-TEK Pt/AC催化剂具有更高的电催化性能和更好的抗毒性能。三苯基膦起到分散碳纳米管、捕获铂和抑制铂粒子增大的作用。

4 结语

负载型催化剂的催化效果与其负载的活性组分的负载量和分散程度有关,而多壁碳纳米管的表面性质极大地影响着活性组分的负载情况。未改性多壁碳纳米管的表面是疏水性的,活性组分前驱体溶液不易接近其表面,影响了活性组分在其表面的负载与分散,因而多壁碳纳米管表面的改性对于碳纳米管在催化领域中的应用至关重要。

超声波物理改性法操作简单易行,但不能从根本上改变多壁碳纳米管的疏水性,需与其它改性法结合使用才有效。共价改性法是在经酸处理后的多壁碳纳米管表面引入大量缺陷,增加多壁碳纳米管的亲水性,使更多的活性组分沉积于载体表面,以提高反应物的转化率。改性过的多壁碳纳米管可用于燃料电池、加氢与脱氢等反应。共价改性都需经酸处理,部分破坏了碳纳米管原有的结构与完整性,减弱了多壁碳纳米管的导电性能。非共价改性是近年发展起来的新兴碳纳米管改性方法,可以得到结构较完整的改性碳纳米管,使其电性能不受影响。目前,对非共价改性后的多壁碳纳米管为载体的催化剂的研究主要集中于对多壁碳纳米管电性能要求比较高的光催化反应与一些酸性对反应活性影响较大的加氢反应等。

共价法改性多壁碳纳米管,活性组分主要以颗粒的形式均匀分散沉积,负载贵金属多采用共价改性后的多壁碳纳米管作为载体。先通过酸对多壁碳纳米管表面进行处理,使其表面含有大量的官能团以有利于金属活性组分在多壁碳纳米管表面的沉积,或再通过各类化学反应在碳纳米管表面沉积。用于光催化领域负载的TiO2/MWNT和ZnO/MWNT等对载体的电性能要求较高,主要采用非共价改性。活性组分是以膜的形式均匀覆盖于碳纳米管表面,且不会破坏碳纳米管的结构,保持了碳纳米管的电性能。应用于催化反应的多壁碳纳米管不论采用共价改性还是非共价改性,均以超声波辅助改性效果更好。

碳纳米管作为催化剂载体的应用探究 第7篇

1.1 碳纳米管具有自由移动的电子

碳纳米管与石墨结构类似, 具有大量自由电子可沿着管壁移动, 这就是碳纳米管既有金属导电性, 又具有非金属的半导体性质的原因。当碳纳米管具有某些特殊的缺陷时, 可同时具有金属的性质和半导体的性质, 而碳纳米管的缺陷可以通过科学的手段引入甚至对缺陷进行位置调整, 这就为改变和调节碳纳米管的电性能提供了可能。

1.2 碳纳米管比表面积大

碳纳米管的比表面积大, 硬度高, 且具有高的热稳定性。碳纳米管是石墨碳原子层曲卷形成的无缝、中空的管体, 因此具有极大的比表面积, 这也是碳纳米管成为科研工作者研究热点的重要原因之一。

碳纳米管的内部结构决定了其具有良好的硬度、优异的机械性能、独特的光电性, 这就使得它在复合材料、纳米半导体材料、催化剂载体等领域具有重要的研究价值及应用价值。

2 碳纳米管作为催化剂载体的应用

2.1 碳纳米管电学性能的应用

碳纳米管具有大量能自由移动的未成对电子, 这就使得碳纳米管兼具金属的导电性和半导体性能。相对于石墨中的自由电子, 碳纳米管管壁内自由移动的电子具有更低的结合能, 这就证明碳纳米管内的电子具有更强的流动性和逃逸能力, 这一点通过XPS试验分析, 已经得到证实。碳纳米管的这种独特结构更能促使其对负载的活性成分发生相互作用, 从而促进催化反应。我国科学家陈鸿博研究组对以碳纳米管作为载体的钾促进钌基催化合成氨进行了探究, 实验表明, 碳纳米管相对去石墨等其他催化剂载体而言, 具有更高的活性。碳纳米管作为催化剂载体, 能提高催化性能的主要原因是电子效应。通过对碳纳米管缺陷的引入及位置的调控, 可改变碳纳米管的电学性能, 从而产生有益于催化反应的电子效应, 提高催化性能。

2.2 碳纳米管内腔结构的应用

碳纳米管的空腔可作为催化位置, 通过控制碳纳米管的空腔的大小, 选择和区别不同尺寸、不同形状的物质。碳纳米管的内腔可以容纳1.8nm的具有催化活性的物种, 并未其提供分子扩散和反应的空间, 从而保障反应物的反应活性在较高的维持范围内;管内的空间限制对反应物和中间态的的空间取向具有良好的导向作用, 从而对产物具有优良的选择性。张宇等关于碳纳米管作为催化剂载体对于反应的转化率及选择性做了较为系统的研究。该组以碳纳米管为载体的铑膦络合物催化剂催化丙烯氢甲酰的反应为例, 对反应的催化性能进行了探究。实验结果表明碳纳米管内腔为载体的催化剂具有更好的催化性能, 丙烯氢甲酰的转化率可达到32%, 且产物具有良好的选择性;而内腔未被利用的, 同类催化剂的催化性能相对较低, 丙烯氢甲酰的转化率仅为17.2%, 反应产物的选择性也较差。综合结果表明, 碳纳米管的内腔对提高该反应催化剂的催化性能及产物的选择性具有积极意义。

2.3 碳纳米管的储氢性能的探究

碳纳米管的比表面积大, 因此具有良好的储氢性能。在不改变温度等外界条件下, 嵌入钾或者锂后, 可提高14%-20%的储氢量。以碳纳米管为载体, 嵌入过渡金属氧化物制成的催化剂, 用于催化加氢合成甲醇时, 过渡金属的氧化物异裂氢分子, 产生的氢正离子和氢负离子转移到碳纳米管上, 以CHx的形式储存, CO在过渡金属Rh上活化后, 储存的CHx释放氢正离子和氢负离子, 并加到CO上, 从而完成一氧化碳 (CO) 加氢合成甲醇 (CH3OH) 的过程。通过测试发现, 碳纳米管为载体制成的催化剂性能明显优于以氧化铝 (Al2O3) 为载体的铜催化的催化性能, 且选择性方面更具优越性, 可使产物产率高达98%。另外, Rodkigues研究组将铁-铜催化剂 (Fe-Cu) 分别负载到氧化铝 (Al2O3) 、活性炭和碳纳米管上, 研究三种不同载体的同种催化剂对催化乙烯加氢反应的影响。实验结果显示, 以氧化铝 (Al2O3) 为载体的催化活性最差, 其次为活性炭为载体的催化剂, 催化活性最好的是以碳纳米管为载体的催化剂。这一组对比实验表明载体能改善催化剂的活性主要是由于金属晶粒与载体之间能发生相互作用, 碳纳米管的储氢性能就是其中的一个作用。在未来的应用研究工作中, 应重点研究碳纳米管与活性组分间的相互作用情况、催化活性位的确定、催化剂在碳纳米管内的分散情况、负载物种在催化反应过程中的作用等问题, 这是碳纳米管做为催化剂载体得以广泛应用需要解决的关键问题。

3 碳纳米管应用前景展望

碳纳米管做为纳米材料的一种, 在微观结构及性能方面具有独特的优越性, 这是其具有良好发展前景的基础。随着研究的不断深入, 人们对碳纳米管的性能将更加了解, 从而利用其独特性能设计更多的应用产品, 由此可以预见, 碳纳米管未来在化学催化领域必将得到广泛应用。

参考文献

[1]覃喆华.碳纳米笼的制备及其作为催化剂载体的应用研究[D].华东理工大学, 2014.

[2]朱继.碳纳米管的制备和作为环境催化剂载体的可能应用[D].浙江大学, 2012.

纳米基因载体 第8篇

A1型短指(趾)症(Brachydactyly Type A1, BDA1)是第一例符合孟德尔遗传规律的常染色体显性遗传病,该疾病的主要特征为患者的中间指(趾)节显著缩短,甚至与远端指节相融合[1,2,3,4,5]。本世纪初,研究人员发现编码IHH(Indian hedgehog)蛋白的基因上几个点突变(E95K, D100E和E131K)导致了A1型短指/趾症的发生[6]。近年来,IHH基因的第95位谷氨酸是一个研究热点,它在不同家系中存在三种突变方式:E95K、E95G和△E95,而且,这三种突变的导致的患者表型存在明显的差异。研究结果已经揭示了E95K导致A1型短指(趾)症的详细分子机制[7,8,9]。不过遗憾的是,E95G的表型至今还没有相关详细的描述。

为了探究E95G和△E95影响Hedgehog信号通路的方式以及导致短指(趾)症的分子机理,本研究构建了携带IHH WT和E95K、△E95、E95G、D100E突变体的RCAS病毒载体,并验证其能够在鸡胚细胞表达。在这个过程中,优化了RCAS(Avian Replication-Competent Retroviruses)病毒收集方法,使最终滴度达到108 IU/ml,并通过体内实验证明该滴度能感染鸡胚[10],该研究为在鸡胚肢芽中过表达不同IHH突变体蛋白打好了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

鸡蛋(SPF级),pGEM-T(Promaga), 细胞培养板、细胞培养瓶(corning),细胞刮(costar)等。

1.1.2 试剂

FBS、CS、Penicillin/Strephtomycin(Gibco);Multisite Gateway Pro Kit (Promega);DIG-Labeling-kit(Roche);Trizol试剂(Invitrogen);SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System(Invitrogen);FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche)。

1.1.3 仪器

PCR仪(Applied Biosystems);孵化机(无锡万利畜牧机械有限公司9WF-320型);超声波破碎仪(南京新辰生物科技有限公司);激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP5);冷冻切片机(LEICA CM3050S); 体视镜(LEICA S8APO);体视镜(LEICA S8APO);显微镜(LEICA DM2500)。

1.1.4 培养基

DMEM(High Glucose)(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 原位杂交

探针用地高辛标记(DIG-Labeling-kit(Roche)),浓度1～2μg/ml。用到的引物序列:RCAS-IHH probe primer:F:5’-CGCCTGAACTCGCTGGCTATCT-3’,R:5’-CCTGAGTCTCGATGACC TGGAAGG-3’,每个样品2次重复。

1.2.2 反转录实验

抽提总RNA参照Trizol试剂(Invitrogen)。RT-PCR 参照SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)。

1.2.3 滴度测试

病毒载体构建:IHH gateway primer:F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGCCTATGTCTCCCGCCC GGCTC-3’,R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGCTCCCTGCCCCGGA-3’。PCR得到两端含有attB的IHH基因,病毒载体构建过程参照Multisite Gateway Pro Kit(Promega)。

病毒收集:分离CEF(Chicken embryonic fibroblast)细胞(HH stage36[10]),转染(FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche))RCAS-GFP,传代扩增。上清浓缩法:待长满后更换至低血清培养基(DMEM基本培养液+1%FBS+0.2%CS+1% Pen/Strep),继续培养24h, 刮下细胞,冰上超声破碎1min,液氮冷冻,-80℃保存。细胞裂解法:收集细胞裂解液,4 000r/min离心10min,取上清于冰上超声破碎30s,过滤(0.45μm),35 000r/min离心1.5h。弃上清,冰上摇2h,-80℃保存。

滴度测试:细胞密度达到70%左右,DMEM梯度稀释RCAS-GFP病毒浓缩液至10-3 、10-5、10-6、10-7,每孔加入100μl上述稀释液,低血清培养基培养48h,激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.4 鸡胚注射和冰冻切片

鸡胚注射:鸡蛋(HH Stage17-18[10])时,注射RCAS-GFP病毒(病毒浓缩液4～6μl+ 0.5μl甲苯胺蓝工作液),继续孵化至HH Stage34-35[10],取肢芽,荧光显微镜观察,并冰冻切片。

冰冻切片:固定(4%PFA,4℃, 12h),平衡(30%蔗糖,4℃, 12h), 平衡(30%蔗糖:OCT= 1:1 ,4℃, 12h),包埋(100%OCT,-70℃,12h),切片(10μm),荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 原位杂交

我们参照IHH蛋白三个点突变(图1-A),构建了携带IHH基因突变体(E95K、△E95、E95G、D100E)的RCAS-IHH病毒载体,并通过细胞原位杂交实验来检测上述病毒载体能否在CEF细胞中过表达IHH mRNA(RCAS-IHH-△E95还在实验中,数据未显示)。

从携带有人IHH基因的pGEM-T载体中分别用不同酶切位点单酶切,及相对应的T7,SP6 RNA聚合酶体外转录得到500bp左右的正反义链RNA探针(图1-B)。正义链探针的杂交结果显示,携带IHH WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒和RCAS-GFP病毒感染的CEF细胞孔内均无明显的信号(数据未显示),说明阴性对照成立。从图1-C的结果来看,携带WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒感染的CEF细胞孔较阴性对照(RCAS-GFP)显示更多的信号(褐色)。从这个结果我们可以知道,携带WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒可以在细胞内过表达相应的IHH mRNA。

A 在IHH基因上的点突变(IHH基因有三个外显子,E95位于第一个外显子区域);B 体外转录人IHH基因RNA探针;C IHH特异性RNA探针杂交不同RCAS-IHH病毒载体感染的CEF细胞(LEICA S8APO,8×)。

A.Mutations in Human Indian Hedgehog gene(E95 is located in the first one of the three exons in IHH); B Transcription of Human IHH-specific-RNA probe in vitro;C IHH specific RNA probes CEF infected by different RCAS-IHH vectors(LEICA S8APO,8×).

2.2 反转录实验

为了从另一个角度验证原位杂交实验的结果,我们采用半定量PCR的方法来验证携带IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E突变的RCAS病毒载体能过表达相应的IHH mRNA。分别携带有IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E的RCAS-IHH病毒感染CEF细胞后,用IHH特异性引物扩增总RNA反转录产物。结果(图2)显示,与GFP相比,IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E均有明显的目的条带出现。说明携带有IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E突变的RCAS病毒载体能过表达上述IHH突变体的mRNA(E95K目的条带较暗,可能是过表达能力较弱,WT目的条带明显,故其对应的GAPDH条带较暗并不影响实验结果的判断),这与上面的细胞原位杂交实验结果一致。

2.3 滴度测试

分别用细胞裂解法和上清浓缩法收集病毒,进行滴度测试。结果(图3)显示,10-3倍稀释测试孔内,细胞裂解法(图3-A)和上清浓缩法(图3-E)得到的病毒均有较多细胞发出绿色荧光;10-5倍稀释测试孔内,上清浓缩法(图3-F)得到的病毒仅有一个视野里有一个细胞克隆发出绿色荧光,在更高的稀释倍数测试孔中,没有发现到绿色荧光(数据没有显示出来),说明上清浓缩法得到的病毒滴度仅能达到106IU/ml数量级。而细胞裂解法浓缩得到的病毒在10-7倍稀释(图3-D)孔内有一个视野里有一个细胞克隆发出绿色荧光,虽然未对细胞裂解法浓缩得到的病毒进行更高的滴度的测试,但可以肯定细胞裂解法浓缩的病毒滴度至少能达到108IU/ml数量级,这个滴度足以感染鸡胚(这在我们后面的试验中得到验证)。因此,细胞裂解方法将是一个很好的病毒浓缩方法。

2.4 鸡胚注射和冰冻切片

虽然体外实验已经证明了细胞裂解法收集RCAS病毒的可行性,但是这个滴度能否感染鸡胚仍需进一步证明。我们采用微注射的方法,将RCAS-GFP病毒注入Stage 17-18时期鸡胚肢芽,通过冰冻切片观察的方法来了解鸡胚感染情况。

A、B、C、D图分别为细胞裂解法得到的病毒浓缩液稀释至10-3、10-5、10-6、10-7;E和F图为上清浓缩法得到的病毒浓缩液稀释至10-3、10-5。取100μl稀释液加入24孔板内,48h后激光共聚焦显微镜观察。(C:细胞裂解法;S:上清浓缩法LEICA TCS SP5,1:250)。

RCAS-GFP concentrated from cell lysate(A,B,C,D)and supernatant(E,F)was diluted to 10-3,10-5,10-6and 10-7with DMEM.100μl diluted RCAS-GFP was added into 24-well plates.The titer was analyzed by Confocal Microscopy after 48 h(LEICA TCS SP5,1:250).

A.RCAS-GFP病毒注射鸡胚肢芽(HH stage17-18), HH stage 34-35时期在肢芽远端处拍摄(10×),绿色指示区域为GFP表达区域。 B.A图肢芽在近端处拍摄(10×)。 C.上述肢芽冰冻切片图(暗场拍摄40×);D. C图区域明暗场叠加结果(40×)。(LEICA DM2500)。

A.Distal chick embryo limb bud of HH stage34-35 with RCAS-GFP injection in the HH stage 17-18(10×);B.The green area indicated cells infected by RCAS-GFP;B.The proximalof the same limb bud in Figure A (10×);C.Frozenslices of the limb bud above (dark field 40×).D.Superposition of light and dark-field(10×).(LEICA DM2500).

从图4-B可知,在微注射区域,即靠近体节处有较多的细胞被RCAS病毒感染,而随着肢芽发育过程的进行,远端肢芽(图4-A)只有较少的细胞被感染,且从近端到远端呈现直线型感染,这符合RCAS病毒感染的模式,同时,从图4-D可以看出,在肢芽内细胞感染情况也并非是均匀的,这与其他研究人员的发现[11]一致。另外,在Stage 10时期尽管不容易引起大血管破裂,使鸡胚存活率上升,但由于鸡胚体节上没有肢芽突起,很难准确判断肢芽位置,因此操作难度大,感染效率低。在本研究中,我们采用Stage 17-18多点注射,取得了更好的效果。

3 讨论

A1 型短指(趾)症是 1903 年由美国哈佛大学博士生William Curtis Farabee发现的第一例符合孟德尔遗传规律的人类常染色体显性遗传病[4]。我们实验室首次在国际上对该疾病的致病基因进行了定位并发现IHH基因上的三个点突变(E95K, D100E, E131K)是导致疾病的原因,由此揭开了 A1 型短指(趾)症的致病之谜[5,6]。随后,国内外又有多个研究小组对他们采集的 A1 型短指(趾)症家系进行了研究,同样发现是 IHH 基因上的点突变导致了短指(趾)症的发生,不过他们发现的是不同位置的点突变或者是同一位置不同的点突变[12,13,14,15,16]。尤其让人感兴趣的是,IHH 基因的第 95 位谷氨酸在不同家系中存在三种突变方式:E95K、E95G和 △E95,这说明第 95 位谷氨酸是一个突变热点。而且这三个突变导致的患者表型存在明显的差异,其中 E95K 突变导致严重的中间指节缩短甚至与远端指节相融合,而 △E95 突变却只是导致轻微的中间指节缩短现象,说明该位置的氨基酸的完全缺失导致的临床表型反而没有氨基酸置换所导致的表型严重,这是一个非常有意思的现象,不过遗憾的是,E95G突变所导致的患者表型没有相关详细的描述。

本研究成功构建了携带有IHH WT 和E95K、E95G、D100E突变体的RCAS病毒载体,并且在鸡胚细胞中成功表达。在此过程中,我们优化了RCAS病毒收集方法,使滴度达到108IU/ml,并通过鸡胚体内实验证明该病毒具有非常好的感染效果,为在鸡胚肢芽中过表达不同IHH突变体蛋白打好了基础,也为我们继续研究这些点突变的生理功能提供了工具。