培养规模范文（精选12篇）
培养规模 第1篇
1.1 细胞对基质的依赖性
根据细胞的生长特性和对基质的依赖性, 可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。
贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面, 细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子, 使细胞依附在支持物表面、才能生长和增殖, 大多数动物细胞都属于此类, 包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后, 就不再生长了, 但仍然能存活一段时间。
非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面, 可在培养液中悬浮生长, 所以也被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞 (包括杂交瘤细胞) 和某些转化细胞属于此类。有些细胞对固体支持物的依赖性不严格, 可以贴壁生长, 但在一定条件下, 也可以悬浮生长。
1.2 生长基质
贴附细胞生长需要一个支持介质, 培养器皿表面的材质不适合, 因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质, 帮助细胞的贴附和生长。把改变生长表面特性, 促进细胞贴附的物质称为生长基质。生长基质一般为胞外基质成分, 主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。
多聚赖氨酸是合成的赖氨酸多聚体, 分子量为7-30ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。纤维连接蛋白是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子, 具有维持细胞结构、促进贴附功能。
层黏蛋白为胞外基质中分子量900 ku的非胶原性糖蛋白, 影响细胞的贴附和运动, 调节细胞生长和分化。韧黏素是六聚体糖蛋白, 分子量190-230ku, 具有促进肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞贴附的功能。层黏蛋白是多聚体糖蛋白, 分子量65~75ku, 具有促进细胞、血小板的黏附、激活补体和纤溶酶原活性等功能。
2 动物细胞大规模培养方法
根据动物细胞的生长特点, 采用悬浮培养、贴壁培养、固定化培养3种主要方法进行大规模培养。
2.1 单层贴壁培养
单层贴壁培养是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上进行的单层培养方法。由于大多数动物细胞具有贴壁依赖性, 贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。接种后, 细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面, 然后进行生长、分裂繁殖, 很快进入对数期。一般数天就长满整个表面, 形成致密的单层细胞。最后, 贴壁培养的细胞会形成两种形态, 成纤维样型细胞和上皮样型细胞。
单层贴壁培养必须根据细胞数目和培养液的体积, 增加基质表面积。实验室研究培养常用多孔平板、培养瓶, 进行静止培养。动物细胞大规模培养常用容器主要有转瓶或转管、玻璃珠、微载体和中空纤维等。
细胞黏附在固体表面主要力是静电引力和范德华力, 因为动物细胞在生理状态下带负电, 贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高度表面活性。适宜的电荷密度氨黏附和贴壁的关键, 电荷密度低, 不能有效黏附, 电荷密度高则会对细胞产生毒性。
转瓶是早期培养所采用, 现在仍用于疫苗等生产。转瓶结构简单, 投资少, 经济实用, 可做成支架, 大量培养, 收获细胞或培养液方便, 重复性好, 容易放大。非贴壁细胞处于悬浮状态, 而贴壁细胞则在瓶内壁上贴附生长形成单层细胞。主要优点是比表面积增加, 处于衡态转动, 增加气体交换。但转瓶的劳动强度大, 占用空间体积大, 产量低, 不易控制和监测培养环境变化。转瓶的空间变化较大, 在500~1800cm2之间, 塑料瓶一般一次性使用, 而玻璃瓶可重复使用。有时细胞在贴壁之前会发生集聚, 可将转速进一步降低到2-5r/h。选择适宜的血清或表面包被聚赖氨酸等, 能克服集聚现象。贴壁培养的优点是容易更换培养液, 在灌注培养时, 能达到高细胞密度;有利于产物的分泌表达, 可改变培养液与细胞的比例。其缺点是操作较繁杂, 细胞生长的检测受到一定限制, 培养条件难以均一, 传质和传氧差, 放大培养是瓶颈。
2.2 悬浮培养
悬浮培养是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程, 主要对于非贴壁依赖性细胞, 如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的, 经常借鉴发酵理论和经验, 但有自身的特点, 由于动物细胞没有细胞壁, 不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切, 对环境适应性差。在培养过程中与微生物发酵培养不同, 在悬浮培养中要注意发挥动物细胞的特性。常用的反应器有通气式搅拌混合气升式生物反应器。方法的优点是:操作简单, 培养条件相对均一, 传质和传氧较好, 容易放大培养。缺点是:细胞体积小, 密度低, 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。
2.3 固定化培养
固定化培养是将动物细胞包埋在微载体内或胶囊内, 即细胞固定化后, 进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有细胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等优点, 是生产首选方法。细胞固定化是在酶固定化基础上发展起来的, 固定化的方法有多种, 对于特定情况, 必须合理选择。
吸附法是通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面的一种固定化方法, 如微载体培养和中空纤维培养等。虽然吸附法的操作过程简单, 但由于相互作用弱, 细胞容易从戴体上脱落。
包埋法是将细胞包埋在载体内部的一种固定化方法, 分为网格型和微囊型两种。网格型的载体为高分子凝胶细网格, 而微囊型的载体为高分子半透膜, 直径为几至几百微米, 比网格载体小得多。包埋细胞的高分子材料有人工合成的聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等。包埋细胞的材料可以是人工合成的高分子聚合物、多糖和蛋白质类, 最常使用的是海藻酸盐包埋非贴壁细胞和胶原包埋贴壁细胞。包埋的机理是通过物理作用而实现的, 如1%~2.5%琼脂糖在高温加热下融化, 低于37~45℃凝固, 与细胞混合, 分散在石蜡油中, 降低至10℃, 得到0.1~0.3mm微球。海藻酸钠为液体, 与细胞混合后, 滴到氯化钙溶液中, 因钙离子的介入凝固, 形成1mm微球。凝血酶的加入可使纤维蛋白对细胞进行包埋。
结束语
一项新的细胞培养技术的发展成熟需要较长的时间。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作。严格控制细胞培养的环境, 防止污染, 是进行大规模培养的前提。通过减少培养基中各种不利因素, 配置细胞生长的专一性无血清培养基, 以及选择条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器和最适合细胞生长的微载体, 可提高细胞的活性和表达水平。
参考文献
[1]李连奋.用无血清培养液生长的哺乳动物细胞产生干扰素[J].国际生物制品学杂志, 1980, 1.
培养规模 第2篇
1、水库工程。指在河道、山谷或低洼地带修建挡水坝或堤堰，形成的具有拦洪蓄水和调节水流功能的水利工程。
普查中，总库容10万m3及以上的水库工程为规模以上工程，进行重点调查；总库容10万m3以下的水库工程为规模以下工程，进行简单调查，仅查清其数量和总库容。
2、水电站工程。指为开发利用水能资源，将水能转换为电能而修建的工程建筑物和机械、电气设备以及金属结构的综合体。
普查中，装机容量500kW及以上的水电站工程为规模以上工程，进行重点调查；装机容量500kW以下的水电站工程为规模以下工程，进行简单调查，仅查清其数量和总装机容量。普查不含潮汐电站。
3、水闸工程。指建在河道、湖泊、渠道、海堤上或水库岸边，具有挡水和泄（引）水功能的调节水位、控制流量的低水头水工建筑物。
普查中，过闸流量5m3/s及以上的水闸工程为规模以上工程，进行重点调查；过闸流量5m3/s至1m3/s（含1m3/s）之间的水闸工程为规模以下工程，进行简单调查，仅查清其数量和总过闸流量；过闸流量1m3/s 以下的水闸工程不调查。橡胶坝工程归为水闸类普查，全部进行重点调查。
4、泵站工程。指由泵和其它机电设备、泵房以及进出水建筑物组成，建在河道、湖泊、渠道上或水库岸边，可以将低处的水提升到所需的高度，用于排水、灌溉、城镇生活和工业供水等的水利工程。
普查中，装机流量1m3/s及以上或装机功率50kW及以上的泵站工程为规模以上工程，进行重点调查；装机流量1m3/s且装机功率50kW以下的泵站工程为规模以下工程，进行简单调查，仅查清其数量和总规模。普查包括引泉泵站工程。
5、引调水工程。指为满足供水、灌溉、生态需水要求，兴建的跨水系、跨区域的水资源配置工程。
普查只对跨流域且跨水资源三级区的引调水工程进行重点调查，不包括应急供水和临时生态补水的引调水工程。
6、堤防工程。指沿江、河、湖、海等岸边或行洪区、分洪区、围垦区边缘修筑的挡水建筑物。
普查中，堤防级别5级及以上的堤防工程为规模以上工程，进行重点调查；5级以下的堤防工程为规模以下工程，进行简单调查，只查清其数量和总长度。普查不包括生产堤、渠堤和排涝堤。
7、农村供水工程亦称村镇供水工程。指向广大农村的镇区、村庄等居民点和分散农户供水，以满足村镇居民、企事业单位日常用水需要为主的供水工程，主要包括集中式供水工程和分散式供水工程。
集中式供水指以村镇为单位，从水源集中取水，输水、净水通过输配水管网送到用户或者集中供水点的供水系统，包括自建设施供水。农村供水工程普查定义集中式供水工程为集中供水人口在20人及以上，且有输配水管网的供水工程。集中式供水工程包括城镇管网延伸工程、联村工程和单村工程。分散式供水工程指除集中式供水工程以外的，单户或联户为单元的供水工程。分散式供水工程主要包括分散供水井、引泉供水、雨水集蓄供水工程和无设施供水。普查的范围为县城（不含县城城区）以下的乡镇、村庄、学校，以及国有农（林）场、新疆生产建设兵团团场和连队的供水工程。对于供水规模≥200 m3/d或供水人口≥2000人的集中式供水工程为规模以上农村供水工程，进行重点调查；供水规模＜200 m3/d且供水人口＜2000人的集中式供水工程和分散式供水工程为规模以下农村供水工程，以村为单位，进行简单调查。
8、塘坝工程。指在地面开挖修建或在洼地上形成的拦截和贮存当地地表径流，用于农业灌溉、农村供水的蓄水设施。
普查容积500 m3及以上的塘坝工程。不包括：①养鱼用的鱼塘；②种植莲藕的荷塘；③因水毁、淤积等原因而报废的塘坝工程。
9、窖池工程。指采取防渗措施拦蓄、收集天然来水，用于农业灌溉、农村供水的蓄水工程。一般包括水窖、水窑、水池、水柜等不同形式。
培养规模 第3篇
中等和高等职业教育办学规模在未来10年将继续扩大，2020年，在校生将分别达到2350万、1480万。要满足职业教育办学的需要，必须完善职教师资培养培训体系，全面保障职教师资队伍整体素质。
今年上半年，职教师资本科专业培养资源开发项目正式启动，中央财政支持1.5亿元，由42个职教师资培养工作基础好、具有相关学科优势的本科层次国家级职业教育师资基地牵头，组织职业院校、行业企业等方面的研究力量，开发100个职教师资本科专业培养标准、培养方案、核心课程和特色教材，旨在进一步加强职业教育师资培养体系的内涵建设。
职业院校教师素质提高计划提出，按照“完善体系、改革创新、提升质量”的总体思路，不断创新政策制度和保障机制。到2015年，完成建设300个职教师资培养培训专业点，开发100个职教师资本科专业的培养标准、培养方案和课程教材资源……一项项实在而给力的举措，为进入改革“深水区”的职教师资队伍建设工作提供了强劲驱动力。
截至目前，中央财政已累计划拨4亿元专项经费，支持国家级职业教育师资培养培训基地重点建设200个职教师资培养培训专业点，改善职教师资培养培训基地的实习实训条件。
安徽省行知学校与部队“联姻”培养军地两用人才
11月10日，安徽省行知学校与96715部队正式签订了军地合作办学协议，为战士学历升级和技能培训打通了新的“绿色通道”。根据战士需求和部队实际，首期开设汽车运用与维修、计算机网络技术、计算机维修与电子信息技术等“部队用得上、地方吃得开”的专业课程；为缓解工学矛盾，平时由学校派出优秀辅导老师，依托部队政工网开设“随营课堂”，每季由部队统一组织士兵前往学校实地开展教学；为减轻战士经济压力，培训开支由地方财政、学校和部队三方统筹解决，免除士兵一切学杂费用。
针对部分临近退伍战士关心的就业出路问题，军地双方商定：参训士兵只要在退伍前后修满学分，就可按规定获得由国家人力资源和社会保障部颁发的全国通用的《职业技能等级证书》和教育部门颁发的学历文凭证书；充分发挥学校与地方企业用工协作网络渠道优势，将考核合格的退伍士兵纳入学校应届毕业生人才库，学校保证100%推荐就业；即使当年未被成功录用，也可返校再次接受免费培训及就业推荐。一系列优惠政策彻底消除了战士们的后顾之忧。目前，已有200余名幸运儿成为首批参训学员，起航追逐成才梦。
安徽省行知学校是首批国家中等职业教育改革发展示范学校，近年成功探索“面向人人、校企育人、生利成人”中职教育行知模式，惠及企业、社区和农村。在国防教育上，学校改革创新，新生一入学即进行军训，成立护校队、国旗队，承接野营拉练，开展军民联欢，积极输送优质兵源，涌现一大批军旅成才典型。这次军地联姻办学是一次行知职教“面向人人”的新尝试。
山西省：进行职教实训基地专项检查
记者从山西省教育厅获悉，山西省对全省121所职业院校2009—2012年度中央财政和省财政支持的163个职业教育实训基地建设项目进行了专项检查。对于配套资金落实不好的市将核减项目数，对配套资金落实好的市奖励增加项目数。根据检查情况，明年有两个市50%申报指标被核减。
据了解，2009—2012年，山西省121所职业学校共立项建设163个实训基地，其中中央财政支持建设项目83个、省财政支持建设项目80个。全省实训基地项目学校共获得中央财政和省财政支持的实训基地建设专项资金31390万元，加上地方财政和学校配套资金，总建设资金超过5亿。
今后山西省将不定期对项目进展情况进行督促检查，落实各市、县财政应承担的经费责任，确保配套资金按时、足额到位，并及时、足额拨付实训基地专项，严禁挤占、挪用、滞拨项目资金；落实职业院校专业教师实践学习制度，保证专业教师每两年应有两个月时间到生产、管理、服务一线进行专业实践，不断提高自身专业素质。
郑州：18所中职学校试点学分制普高生亦可选修
郑州市中职学校学分制改革试验工作自2010年启动至今，已经取得了初步效果。到目前为止，共有18所中职学校试点学分制，试点学校以当年入学的新生为起点，须修满170个学分才能拿到毕业文凭。其间，普通高中学生也可尝试到中职学校修学分。
据郑州市科技工业学校有关负责人介绍，自2010年起，该校就开始与郑州十二中、四中、九中等学校尝试普职融合，学校为高中学生开设电子技术、服装设计课程，先由职校教师到高中讲授理论知识，然后学生来职校进行实际操作。由职校教师判定学生作品是否合格，能否修到学分。
山东：试点高等职业教育与技师教育合作培养模式
口蹄疫病毒规模化培养研究进展 第4篇
1 当前病毒培养的方式和方法
1.1 实验动物
实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具, 但是后来发现, 实验动物经常自身带有病毒, 常常混淆试验结果, 并给病毒疫苗的生产带来严惩的潜在危险, 例如被某些致瘤病毒所污染等等。进行动物实验时, 首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和品系, 以及适宜的接种途径和剂量。
1.2 鸡胚
鸡胚 (包括其他禽胚) 是正在发育中的机体, 多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代, 并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低, 又可选择不同的日龄和接种途径, 病毒易于增殖, 感染病毒的组织和液体中含有大量病毒, 容易采集和处理, 而且来源充足, 设备和操作简便易行。常用的接种方法为绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊和羊膜腔等四种。
1.2.1 绒毛尿囊膜接种
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖, 这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。
1.2.2 尿囊腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒, 例如流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖, 也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。
1.2.3 卵黄囊接种
主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏休等的分离和增殖。
1.2.4 羊膜腔接种
主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。在由病料初次分离病毒时, 羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。但此法操作技术比较困难, 鸡胚也易受伤致死。
1.3 组织培养
组织培养, 原来是指动物或植物组织小块的体外培养。这个名称现在用以泛指体外的组织、器官和细胞培养, 是分离和培养病毒以及进行病毒学实验研究的简便而有效的工具和手段。近年来, 许多新的动物病毒, 就是通过组织培养方法而被发现、生产病毒抗原以及制造病毒疫苗, 则更大量地应用组织培养。组织培养的方法有三种:
1.3.1 组织培养
这就是原来意义上的所谓组织培养。将动物组织切成小块在固定或悬浮状态下培养。组织块培养是最早的组织培养方法。
1.3.2 器官培养
取器官薄片进行培养, 使其基本保持原来的结构和功能。某些呼吸道病毒, 就是应用器官培养才分离出来的。这种培养还是研究器官生理机能以及某些病毒感染机制的良好工具。
1.3.3 细胞培养
应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液, 适当洗涤以后, 加入营养液, 通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上, 并生长增殖。这样的细胞培养物称作原代细胞。将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后再作培养, 就是继代细胞。原代细胞和继代细胞一般还保持原来细胞主要特性。经过严格检查染色体的数目和形态正常, 并且没有污染的继代细胞, 特称二倍体细胞株。
为使二倍体细胞株不致因定期传代而不断增加代数, 同时也是为了避免发生变异, 通常将其保存于-196℃的液体氮中, 以甘油或二甲基亚砜作为保存剂。这样保存的细胞株, 可以随时取用, 甚为方便。但是即使在已经鉴定并已广泛应用的细胞系中也常可能发生病毒污染。
1.4 营养液
营养液是组织培养系统中细胞赖以生长和增殖的直接环境, 因此不仅要求供给各种营养物质, 例如氨基酸、糖类、维生素和无机盐类等, 而且必须保证适宜的温度、酸碱度、渗透压和气相。目前所用的各种营养液是根据细胞的营养要求和生长特性而精密设计和配制的所谓人工综合营养液, 在培养时添加血清或某些细胞生长因子即可满足细胞的生长繁殖。有血清、血浆、组织浸出液、0.5%乳白蛋白水解物、人工综合营养液等。
2 规模化培养常用方法
2.1 贴壁培养
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养瓶壁上, 细胞一经贴壁就迅速铺展。一般数天后就铺满培养表面, 并形成致密的细胞单层。贴壁培养的优点:
(1) 容易更换培养液;细胞紧密黏附于固相表面, 可直接倾去旧培养液, 清洗后直接加入新培养液。
(2) 容易采用灌注培养, 从而达到提高细胞密度的目的;因细胞固定表面, 不需过滤系统。
(3) 当细胞贴壁于生长基质时, 很多细胞将更有效的表达一种产品。
(4) 同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
(5) 适用于所有类型细胞。
2.2 悬浮培养
细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养, 如杂交瘤细胞等;是在微生物发酵的基础上发通起来的。无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式, 它能减少后期纯化工作, 提高产品质量, 正逐渐成为动物细胞规模化培养的研究新方向。
2.3 固定化培养
将动物细胞与水不溶性载体结合起来, 再进行培养。上述两大类细胞都适用, 具有细胞生长密度高, 抗剪切力和抗污染能力强等优点, 细胞易于产物分开, 有利于产物分离纯化。制备方法很多, 包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。
3 规模化培养技术的操作方式
规模化培养可分为:分批式、流加式、半连续式、连续式、连续式和灌注式五种。
3.1 分批式培养
分批式培养是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式, 也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器, 将细胞扩大培养后, 一次性转入生物反应器内进行培养, 在培养过程中其体积不变, 不添加其它成分, 待细胞增长和产物形成积累到适当的时间, 一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
3.2 流加式培养
流加式培养是在批式培养的基础上, 采用机械搅拌式生物反应器系统, 悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞, 细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2~1/3, 在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求, 流加浓缩的营养物或培养基, 从而使细胞持续生长至较高的密度, 目标产品达到较高的水平, 整个培养过程没有流出或回收。
3.3 半连续式培养
半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统, 悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中, 每间隔一段时间, 从中取出部分培养物, 再用新的培养液补足到原有体积, 使反应器内的总体积不变。
3.4 连续式培养
连续式培养是一种常见的悬浮培养模式, 采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后, 为了防止衰退期的出现, 在细胞达最大密度之前, 以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基;同时, 含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出, 以保持培养体积的恒定。
3.5 灌流式培养
土地规模经营汇报 第5篇
2013年9月
首先，我代表 市政府热烈欢迎以 主任为组长的调研组一行的到来。下面，就调研安排向各位领导作以汇报。
年初以来，我市按照十八大和中央一号文件精神要求，紧紧抓住绥化市“以家庭承包为基础、以合作农业为载体、以规模经营为前提、以大农机大水利大科技为内容的现代化大农业建设”的全新部署，抢抓两大平原综合配套改革试验区上升为国家级战略机遇，围绕承担国家现代农业示范区改革与建设试点县任务，加速推进农业发展方式转变，加快新型农业经营体系创建，加强农业物质装备条件改善，加大社会化服务改革力度，取得了现代化大农业加速转型升级的明显成效。
一、土地流转和规模经营情况
（一）土地流转情况。我们某把土地流转作为推进规模经营的重要突破口，作为推进现代化大农业建设升级转型的有效手段，在坚持“依法、合规、尊重农民意愿”的前提下，结合农村实际，创新流转方式，今年全市共流转土地183.14万亩，占全市耕地总面积的44.7％。主要是通过五种方式推进，一是租赁，面积21.5万亩，占流转面积的11.7％，主 要租赁人是企业、外来涉农大户；二是转包，面积81.29万亩，占流转面积的44.3％，主要对象是种植大户、家庭农场、院县共建、农机合作社等；三是互换，面积2.1万亩，占流转面积1.15％，主要是农户、大户间串换，便于集中连片经营；四是入股，流转面积74.25万亩，占流转面积的40.5％，主要对象是农机合作社、农民专业合作社和部分种植大户；五是转让，流转面积2万亩，占流转面积的1.1％，主要是建设高科技园区归并土地。其它方式，如赠予，流转2万亩，占1.1％。全市土地流转的平均价格在350-410元之间，流转后的每亩收益为300-360元之间。
（二）规模经营情况。截止今年春种前，全市共组建新型经营主体7863个，规模经营总面积达到291.1万亩，占全市耕地总面积的71％。在推动土地流转、实施规模经营过程中，推动全市形成了“九种模式”，一是农机合作社经营模式。36个农机合作社流转和入社面积41万亩，占全市规模经营总量的14.1％。二是农民专业合作社经营模式。组建农民种植专业合作社286个，入社面积33.25万亩，占规模经营总量的11.4％。三是家庭农场经营模式。建设255个家庭农场，规模经营面积20.9万亩，占规模经营总量的0.72％。四是院县共建模式。与省农科院合作，在乡镇建设品种对比园区各1处，在五里明组建玉米专家大院和玉米研究所，在涝洲组建水稻研究所，面积5600亩，占规模经营总量的0.19％。五是企业带动模式。8个涉农龙头企业规模经营面 积6.5万亩，占规模经营总量的2.2％。六是农民联合体模式。组建农民联合体167个，规模经营面积42万亩，占规模经营总量的14.4％。七是种植大户经营模式。通过能人牵动，扶持发展百亩以上种粮大户7110个，规模经营面积达到146.3万亩，占规模经营总量的50.2％。其中培育200亩以上新型职业农民500名。八是村组干部带动模式。由村组干部带头组建家庭农场、联合体、专业合作社300个，规模经营面积达到15万亩，占规模经营总量的0.52％。九是全产业链经营模式。www米业流转、入社土地1.2万亩，五里明现代农业开发公司流转农户土地3万亩，福山农业种植合资公司流转土地1.5万亩，占规模经营总量的2％。规模经营地块由于增强了经营主体在生产资料采购上的市场谈判地位和话语主导权，生产成本普遍降低15％左右，特别是大垄双行种植地块，亩保苗株数增加五分之一，产量普遍增长300斤以上，所以，规模经营地块收益比农户小规模流转地块高出300元以上。
二、专业合作组织运行状况和作用发挥情况
（一）运行状况。由于我们在农民专业合作组织发展上，坚持实施“民办、民管、民受益”原则，政府主要发挥服务指导职能，使农民专业合作组织发挥出了重要的牵动和引带发展呈现出了 “五个转变”和“三个提高”。“五个转变”：一是由自由化向规范化转变。2007年，《中华人民共和国农民专业合作社法》出台后，农民组建专业合作社的热情非常高，区域内重复组建、规模小、水平低、恶意竞争、资源浪费等“杂、乱、差”现象非常突出，为此，我们加大了组建指导力度，以工商局和经管站为核心，成立了专门指导服务办公室，坚持小区域内“同类合并、以大为主”原则，由“抓数量”转向“抓质量”，使新组建的农民专业合作社水平和质量得到显著提升。二是由示范化向规模化转变。根据农业生产形势的需要，我们改变了以往成员三五人、经营收入几十万元的组建要求，坚持以村为单位，以同业为基础，实现了由“抓小”向“抓大”，由“抓点”向“抓面”的根本性转变。目前，核心入社成员平均在10户左右，带动入社成员平均在150户左右，土地规模经营面积在千亩左右，经营收入超过了百万元。三是由封闭化向开放化转变。在加大组建和发展指导力度之后，合作社发展打破了“庭院式”、“村屯式”的自我发展封闭格局，出现了跨村屯、跨乡镇的跨区域经营局面，仅近两年来，全市已有20多家合作社实现了跨区域发展，成为同业中的佼佼者。四是由家族化向企业化转变。受过去农民传统的“肥水不流外人田”、“亲戚朋友最可信”思想观念的影响，合作社内部成员多以亲友为主，规章制度不健全，经营管理不到位，合作社发展不规范。加大指导力度以后，严格按照企业化经营要求，重点在登记设立、章程制度、组织机构、财务管理、档案管理等方面进行了规范完善，将老合作社导入了规范化轨道，使新合作社起步就进入正轨。五是由园田化向基地化转变。近年来，我市依托绿色食品产业大园区，以龙头企业为牵动，坚持走“企业+ 合作社+基地+农户”模式和“1+x”模式，组织多个合作社为一个企业建设原料生产基地，推动合作社走企业化之路。我们围绕中粮集团，组建了百万亩玉米高淀粉基地，吸纳合作社160个；围绕乳业集团，组织奶牛合作社建立了3万头奶牛养殖基地；围绕 泡菜，组织蔬菜合作社建设了10万亩蔬菜基地。通过基地化建设，使全市80%的合作社摆脱了“园田式”，步入了全新发展空间，从而推动合作社经营质效发生了根本转变。“三个提高”：一是农民专业合作社收入占农村经济比重明显提高。目前，全市农民专业合作社已完全覆盖了农村经济各主导产业，2012年全市农民专业合作社实现总收入50多亿元，占农村经济总收入的70%以上，某镇5万亩规模经营玉米种植专业合作社玉米平均单产2252斤，创全国之最。二是农民专业合作社成员收入明显提高。某玉米种植专业合作社和某米业合作社通过“四统一”的生产经营模式，入社农民年纯收入达2万元以上，比未入社农民人均纯收入高出8000元以上。三是农民专业合作社组织化程度明显提高。2012年，通过合作社集中采购，组织标准化生产，统一生产、加工、销售产品等措施，降低各类生产资料采购成本3000万元以上；通过提质增效、树立品牌等手段，提高产品附加值、增加收入近亿元。向阳中宝蛋鸡养殖专业合作社通过“五统一”生产经营模式，入社农户均增收近万元，农民生产的鲜蛋、种蛋、种雏等产品远销北京、上海、广州等全国大中城市。通过近几年来的集中推进，全市农民专业合作社呈现了发展势头迅猛，规范化水平不断扩大，带动作用不断增强，亮点频现的良好局面。当然，也存在着一些实际问题，主要表现为以下几个方面。一是合作社专业指导不强。通过实地调查，除企业、部门领办的农民合作社能够获得专业指导外，其它大部分农民专业合作社得不到专业指导。二是内部运行机制不规范。虽然合作社都建立健全了各项规章制度和比较完备的监管手段，但在实际运行中，合作社理事长“一权独大”现象还存在，影响了合作社规范化发展。三是社会扶持发展力度不够。在政策上，国家政策资金和项目资金极少投入到农民专业合作社；在资金上，合作社运行资金，多以社员自筹为主，资金的缺乏限制了合作社的发展壮大。特别是缺乏抵押物，金融部门在银行放贷上还有待加强。四是社员整体素质不高。农民专业合作社大多由本村、屯产粮能人、养殖能人、富裕户等牵头，由于自身知识水平的限制和能力水平的制约，极大降低了合作社对市场运行的预见力和掌控力，阻碍了农民专业合作社的可持续健康发展。
农机合作社运行主要采取“营、托、代”三种形式，“营”就是自营土地面积平均都在1万亩以上，确保合作社有足够的运营收益保证；“托”就是托管农民土地，秋后产量按未托管农户最高测产水平核算，收取耕作费和超高收益；“代”就是代耕农民种植专业合作社、农民联合体和农户耕地，收取耕作费用。分配方式上，采取“仁发模式”，实行“带动入社、收入保底、二次分配、国投共享”的分配机制，每个入社农户比未入社农户收益平均高出300元左右。
三、整乡镇、整村推进土地规模经营的做法和问题 今年，我市实施整镇推进土地规模经营的有 五个乡镇，面积50.96万亩；实施整村推进的有 村等8个村，面积8.4万亩。主要做法是必须尊重农民意愿，把农民规模经营的积极性调动起来。随着城乡一体化进程的不断深入，农村空心化、农业兼职化、农民老龄化趋势越来越明显，尤其是近年来，随着一大批先进农业科研成果的推广和应用，农业设施装备水平得到全面提高，传统意义上的农民已不在适应新的农业发展形势，有些年青的农民向往城市生活，无奈的继承着土地的经营，农民主观上将土地流转出去意愿非常强烈，这些为实施土地规模经营创造了条件。一是要全方位宣传引导。实施土地规模经营的关键因素就是要因势利导，加大政策宣传，在保障农民耕地所有权不变的前提下，充分调动农民参与规模经营的积极性。我们利用电视媒体、乡村公开栏等多种形式，加大扶持和鼓励土地规模经营制度的宣传，加强流转前后效益对比，以农民群众喜闻乐见的形式，宣传规模经营的好处。二是要加大就业保障。发展劳务型经济、商服型经济、养殖经济等产业，把流转后的农民组织起来，让他们实现二次就业，多元化收入。三是要建立起完备的保障制度。加快实施土地确权登记和农民养老保险制度，让农民放心的将土地流转出去，尤其是要宣传好土地基本承包权利不受影响的政策措施，解除农民的后顾之忧。四是要培树典型。深入挖掘那些将土地流转出去从事二次就业的成 功典型，在全社会营造起参与土地流转的浓厚氛围，使农民群众放心的参与土地流转。五是加速提升规模经营粮食产能。我们对5个整镇推进镇、8个整村推进村的农田基础条件建设实施了重点武装，做到了“三个全覆盖”，即新型规模经营主体、农机水利设施装备、全方位技术保障全覆盖；“四个加速升级”，即实现乡镇典型示范、产业化经营、品牌培育、城镇化四个加速升级；“五个全线推进”，即生产方式、要素集成、农业形象、服务能力、体制机制五个全线推进，集中打造现代化大农业园区精品集群，整镇整村推进的乡镇、村是全市种植基础建设最完善、设施配备最完备、抗御灾害能力最强、产量水平最高的镇村，让农民看了眼亮心服，所以才愿意配合实施整镇整村推进。
四、农民专业合作组织生产建设、发展资金解决的办法和途径
为推动农民专业合作组织发展，打破发展瓶劲制约，我们创新出台了四个有效发展模式：一是技银企社模式。改革金融服务体制，大力推广某镇与商业银行、龙头企业、农业专家链接模式，商业银行为农业合作社提供贷款，合作社将粮食销售给龙头企业，企业在资金结算时将贷款本息转付给银行，商业银行又聘请农业专家对粮食生产实行全过程指导，四者之间均通过签订合同进行联结。这一模式不仅解决了资金筹措难问题，也有效破解了农业技术低、农产品销售难、农业产业链断档等瓶颈难题；二是联合会模式。我们组 织农资商会、金融、保险、农技等部门，与农民专业合作社、农机合作社等经营主体共同组建某市合作农业产业联合会，直接为规模经营主体提供农资、金融、保险和农业技术支持，形成多位一体，利益共享的全新扶持保障规模经营新机制。联合会引入某建信村镇银行，以联合会资产为抵押，贷款利息仅为7.6厘，低于其它国有商业银行标准。今年共为合作社发放贷款8000万元。三是放宽抵押物模式。通过多方协调和工作争取，市农委与信用联社共同下发了《关于放宽农业信贷资金抵押物范围的通知》，将原来仅有的五户联保和财产抵押范围扩大到土地使用权证、渔池产权证、林权证、大型农机具抵押，为新型规模经营主体申请农业信贷资金，提供担保抵押物扩大了选择余地。四是新型规模经营主体做到应保尽保。四是春款秋贷模式。针对合作社成员五联保手续办理难的问题，在每年的春节前后，抓住农民返乡过节时机，协调乡镇、信用社、农行等部门单位，组织合作社成员提前办理春耕贷款手续，确保合作社春耕生产随用随取。
五、推进土地流转和规模经营的问题和建议
随着土地规模经营的不断深入，一些深层次问题和体制机制问题也暴露出来，主要表现在以下几个方面：
一是农民缺乏社会保障。农民土地社会保障和就业功能没有从根本上改变，特别是农村社会保障机制尚未形成，大多数农民仍然把承包地看成是“活命田”和“就业保险田”，特别是支农惠农政策力度加大，加重了农民对土地的依赖程 度，土地流转步伐趋缓。二是农民缺乏政策保障。政府对土地流转双方缺少必要的扶持政策，致使流转方农民存在补偿资金、养老保障、劳动力就业等方面的后顾之忧。规模经营业主缺少开发资金、经营项目和产品销售等困难和问题。三是农民缺乏服务保障。土地流转涉及到所有权、承包权、使用权多个主体的经济利益，但从目前看，如资产评估、法律咨询、土地保险等中介机构发展滞后甚至缺失，中介服务的匮乏严重制约了土地市场的发育和土地流转的进程。四是农民缺乏权益保障。目前，土地流转基本还处于自发阶段，政府及业务主管部门对土地流转的运作程序及管理办法没有明确统一的规定，更没有相应的工作机构，加强土地流转管理和监督，农户间以及农户和业主间的土地流转程序不规范，内容不明确，权力与义务不对等，合同执行不力。五是规模经营主体缺乏保险保障。农业是自然和市场风险都很 高的产业，随着新型农业规模经营主体的不断涌现，其面临的自然和市场风险也越来越高，目前农业保险所采取的方式均为商业性保险，基本采取商业化运作模式，规模经营主体参保的积极性不高，受益不多。
为了能够科学有效的推动土地流转，促进土地规模经营，我们某市探索形成了四项保障机制，保障新型农业经营主体健康发展不断壮大。
（一）创新政策扶持体系推进土地规模经营。以农机合作社为平台，采取“四入”模式促进土地规模经营。一是入 托分流。组建土地托管中心，鼓励农民自愿将土地委托土地托管中心经营管理。二是入社分红。按照收入保底、盈利分红、权益保障、风险保障四项机制，在确定保底收入基础上，盈利按股分红，国家各类补贴归农户所有。三是入场分营。对现有大户按照家庭农场模式进行规范升级，积极鼓励农户土地向家庭农场集中，并在政策上对家庭农场实行重点扶持，全面提高家庭农场经营效益。四是入市分置。乡镇成立土地交易中心，对自愿入市参与流转的农民土地，公开竞价流转。
（二）创新产销新模式推进土地规模经营。组织产业化龙头企业，与合作社等新型经营主体签订生产订单，并通过实施订单保险、价格调控平衡机制，建立长期稳定的农产品产销衔接机制和订单履约机制。利用一定比例的产粮大县奖励资金、扶持规模经营主体，建立农产品风险平衡调控基金，当农产品市场出现较大波动，运用调控基金对合作社进行价格补贴；当市场价格大幅高于订单价格时，对收购企业进行价格补贴。同时，利用财政引导性资金，对粮食深加工企业进行重点扶持，帮助企业和合作社规避市场风险，确保提高订单履约率和到位率。
（三）创新财政支持新方式推动土地规模经营。
成立专门管理机构，对农机、水利、农业开发等国投、省投项目资金进行统筹管理，集中整合，集成使用，重点向新型经营主体倾斜。一是整合使用机制。在涉农项目资金使 用上，做到集中使用，重点投放。二是利润分配机制。建立“国投共享、整合捆绑、股份经营、二次分配”新机制，国投省投资金项目以国有股方式，注入新型经营主体，获取的红利，以以奖代投或二次分配方式，向新型经营主体成员进行再分配。三是扶持发展机制。对建设基础好、发展潜力大、经营效益高的经营主体，整合项目资金优先投放；国家、省各类补贴优先支持。
（四）创新农业投融资新机制推进土地规模经营
培养规模 第6篇
过去一年中，A股市场遭遇巨幅震荡，上证综指最高点攀至5178.19点，最低至2850.71点，全年涨幅9.41%。面对惊心动魄的“过山车”行情，中银基金旗下偏股型产品显示出较强的抗跌能力，依然表现优异。Wind数据统计，中银基金旗下成立满一年的19只权益类基金2015年全年复权净值增长率达37.24%，7只涨幅超40%，而同期上证综指和深证成指的涨幅分别为9.41%和14.98%。其中，中银新经济涨幅达99.81%，在227只同类产品中高居前5%;中银主题策略以78.21%的涨幅在446只同类产品中稳居前10%;此外，中银动态策略涨幅63.54%，中银健康生活涨幅52.68%，中银行业优选涨幅49.09%，表现十分抢眼。
2015年二季度开始，债市走出慢牛行情，中债总全价（总值）指数全年上涨4.51%，中债总净价（总值）指数上涨3.97%。股市持续波动，投资者风险偏好明显降低，固定收益类产品重拾人气。作为中银基金又一大传统强项，其固定收益类投资也表现不俗。Wind数据显示，中银基金旗下债券型及偏债型基金2015年全年平均涨幅达12.86%，根据银河数据统计，同期同类产品平均涨幅为9.94%。计入统计的19只基金中（A、B/C份额），12只涨幅超10%，4只涨幅超20%。其中，中银聚利B上涨30.29%，在280只同类产品中高居第2，中银保本、中银转债增强A和中银转债增强B涨幅分别为23.42%、21.02%和20.52%，均稳居行业前列。
在避险情绪的推动下，货币基金因其稳健的收益和良好的流动性管理能力吸引了大量资金。中银基金积极把握短融、存款市场的投资机会，精选个券，货币类产品表现出色。Wind数据统计，截至2015年12月31日，中银活期宝和中银薪钱包全年平均七日年化收益率近4%，在有统计数据的215只同类产品（A份额）中跻身前1/4。中银理财60天、30天、21天、14天和7天等短期理财债基同期平均七日年化收益率超过4%，远超2.75%的三年期定期存款利率。
试玉要烧三日满，辨材须待七年期。中银基金不仅在一年期的“短跑”中取得好成绩，更是业绩长期超越同业、不畏牛熊变换的“长跑健将”。银河数据显示，截至2015年12月31日，中银中国成立以来总回报率高达742.86%，中银持续增长达450.52%，中银收益达348.26%、中银动态策略达198.16%。以晨星五年五星评级基金中银收益为例，即使投资者在历史顶点——2007年10月16日6124点买入，经历本轮巨幅震荡，持有至2015年12月31日，也能获得85.85%的收益，而同期上证综指下跌41.31%，可谓不挑买点，只要长期持有，就能笑傲牛熊。
天相投顾数据显示，2015年前三季度，中银基金已为持有人赚取77.99亿元，在基金公司“赚钱榜”上跻身前十。权益类与固定收益类产品线收益全线飘红，短期业绩与中长期业绩均领先同业，中银基金用业绩说话，赢得了越来越多投资者的信赖托付，公募资产管理规模从2011年末的435亿元到2015年末突破2700亿元，连续四年稳居行业前十，资产管理总规模更是突破6700亿元。
中银基金卓越的投研能力与风险管理水平也获得了业内的广泛认可。在2015年的基金业三大权威评选中，中银基金连续三年包揽了全部奖项的顶级公司大奖——十大金牛基金管理公司奖、金基金·TOP公司大奖和五年持续回报明星基金公司奖，成为自2013年以来行业唯一一家连年实现“大满贯”的公司。
2016年是“十三五”规划的开局年，资本市场发展前景可期，更多投资“金矿”有待挖掘。中银基金将一如既往地秉承公司核心价值理念，继续发挥投资管理核心优势，勤勉尽责，用优异的业绩为持有人实现长期、持续的财富增值。
培养规模 第7篇
1 污染的来源
1.1 外源性污染
1.1.1 原辅材料
水是生物制品原料的主要溶剂, 一切营养物质只有溶于水才易被细胞吸收, 代谢产物也需溶于水才能排泄, 所有的生化反应必须在溶液状态下才能很好的作用。细胞培养过程中水是不可缺少的原材料, 因此也就成了细胞培养中的污染源之一。培养用水中如果含有一些杂质, 即使含量极微, 有时也会影响细胞的存活和生长, 甚至导致细胞死亡。配制培养液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水, 存放时间一般不应超过2周, 依据国家药典, 其p H范围应为5~7, 电导率<10 us/cm。
培养液是细胞赖以生存的体外环境, 也为细胞生长提供主要的营养物质。如果配制培养液的化学试剂及添加物不纯, 配液罐、阀门、管道及滤器等验证不合格或灭菌不彻底都会造成培养液的污染。
动物血清作为原辅材料是细胞培养中常用的一种重要的天然培养基, 同时存在潜在的生物及化学污染来源。由于血清都是批量生产, 各批量之间差异很大, 不同厂商的生产工艺及生产质量也各不相同, 使得血清中许多蛋白及生长因子的浓度也存在很大的差异, 取材中可能带入支原体、病毒, 对细胞产生潜在影响。因此, 不同的处理方式和工艺等都是影响血清质量的关键因素。
在大规模细胞培养的过程中所用到的培养器皿及容器多种多样, 如各种玻璃制品和不锈钢生物反应器等。培养器皿及容器在清洗过程中残留的变性剂或洗衣粉等是最常见的化学性污染来源。
1.1.2 操作环境
大规模细胞培养一般在洁净度为万级以上的洁净室或者是超净工作台内操作。生产中万级以上洁净室内部气流一般为乱流, 内含局部百级洁净度的层流罩。层流罩的气流为双向垂直流, 常规操作均在层流罩下进行。超净工作台作为级别较高的操作环境, 能较好地保持台面无菌及环境的安全性, 但其使用过久易造成尘埃堵塞, 例如过滤网罩若未定期更换或长久不更换, 污染空气易进入操作区等, 都会造成培养室内空气污染。
1.1.3 操作人员
人员是生物制品生产操作中最不确定的因素, 每天都会携带大量的灰尘, 而细菌和病毒则附着在灰尘中, 如果不按标准操作规程进行, 例如进出无菌室没有必要的灭菌措施、操作前不检查设备和环境是否达标等, 则会使无菌区域的环境平衡遭到破坏, 从而导致细胞培养过程中的污染。细胞培养过程中试验人员是否操作规范, 是否严格遵守无菌工作流程, 是细胞污染的一个主要因素。
1.2 内源性污染
内源性污染虽然不似外源性污染广泛, 但内源性污染的检测和清除更为困难。主要表现为细胞株建库时存在的潜在污染, 如制备细胞的组织或器官本身携带有病毒或支原体等。
2 污染的种类
2.1 细菌污染
细菌类的污染最为常见和广泛, 大多属于外源性的污染。一般比较容易检测和鉴定, 通常通过肉眼观察或光镜下检查就可做出初步鉴定, 最后采用细菌培养和染色等方法做出进一步鉴定。常见的细菌污染有革兰氏阴性菌 (如大肠杆菌等) 和革兰氏阳性菌 (如葡萄球菌等) [1], 细菌污染细胞后, 多数情况下细胞培养液短时间内变黄, 出现浑浊现象, p H值降低, 倒置显微镜下观察, 可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮, 有时在细胞表面及周围有大量细菌存在, 细胞停止生长并有中毒表现。
2.2 真菌污染
真菌类的污染也是常见的污染类型, 大多也属于外源性的污染, 比较容易检测和鉴定。最常见的真菌有曲霉菌, 白色念珠菌, 酵母菌, 黑霉菌, 孢子菌等。真菌污染细胞后多在培养液中形成黄色或白色漂浮物, 一般肉眼可见, 较易被发现, 短期内培养液不变浑浊, 4 d左右才可在显微镜下观察到丝状或者是链状的菌丝, 周期较长。
2.3 支原体污染
支原体是一类无细胞壁、大小介于细菌和病毒之间 (直径在0.13~0.18μm) 并独立生活的微生物, 可穿过0.22μm的孔径滤膜[2]。支原体分布广泛, 主要存在于污水、土壤、植物、动物和人体中, 以腐生、共生或寄生的方式在规模化细胞培养和生物制品生产过程中造成污染。
支原体污染多属于外源性污染, 也有内源性的, 感染力高且不易被检测, 在大规模细胞培养中极为常见。支原体污染细胞后, 生长缓慢, 早期很难发现, 显微镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡, 短期内培养液不变浑浊。支原体污染对细胞的生长繁殖、形态、细胞代谢、遗传学以及细胞对病毒的敏感性都将产生不同程度的影响, 是大规模细胞培养工作中亟待解决的重要问题之一。其种类不同, 对细胞的影响也不同, 一般支原体的污染可使细胞生长速度减慢或完全终止, 最终细胞发生病变, 但有些经支原体污染的细胞在经过多次连续传代或长期培养后, 仍然表现出基本正常的生长, 这样给检测和清除工作带来了很多困难。
2.4 病毒污染
大规模细胞培养中出现的病毒污染一般来自动物血清或者是管理不严的动物细胞库, 多为外源性污染, 也有内源性的 (如建立细胞株时产生的污染) 。外源性的污染大部分主要来源于牛腹泻病毒 (BVDV) 中的非细胞病变株, 预计有70%以上的胎牛血清中均存在这种病毒。大部分外源和内源的逆转录病毒感染细胞后, 被感染细胞不会产生形态和细胞病理现象, 可用血细胞吸附试验、免疫荧光抗体及电子显微镜等方法有效地检测上述病毒。
2.5 交叉污染
交叉污染一般来自细胞建株和细胞传代过程中两种或两种以上细胞之间的混合污染。在细胞培养的过程中, 细胞种类不同, 其理化特性、培养操作模式也不尽相同, 若在同一无菌环境区域操作, 所用试验材料极易导致不同种细胞间交叉污染, 使细胞形态和生物学活性发生改变, 从而导致细胞特性的改变。
3 污染的控制
3.1 外源性污染
3.1.1 原辅材料污染的控制
大规模细胞培养过程中要特别注意防止培养液的污染, 要做到这一点采取标准的操作步骤是前提, 配制好的培养液采用过滤除菌法进行除菌, 确保所用的滤器、储存培养液的容器以及操作过程等均严格无菌。此外, 为了避免培养液、培养附加成分或添加的各种试剂等引起的化学性污染, 培养过程中所使用的所有化学物质都应是高纯度的, 并且要经过权威机构的鉴定, 操作人员最好对上述成分做进一步的纯度鉴定。
动物血清为细胞生长提供必需的生长因子, 同时又是大规模细胞培养过程中潜在的生物及化学污染的来源[3]。培养细胞所用的血清必须储存于-20℃或者是-70℃的环境。为了保证试验及生产工艺的重复性, 最好选用同一批次的血清, 并且在添加血清之前一定要对血清进行过滤和辐照等处理, 以便除去血清自身携带的内源性微生物。因此, 研究和开发无血清培养基已成为各生物制品公司研究的趋势。
大规模细胞培养过程中会使用到各种不同类型及规模的培养器材, 其规模和构形设计会影响细胞培养中气体的交换、湿度、培养液的p H值甚至细胞生长密度[4]。培养细胞所用的器材首先需经过注射用水清洗, 再经严密的包装和灭菌, 最好采用内外两层包装, 灭菌要彻底, 一般采用干烤或蒸汽灭菌:如高温干烤灭菌时要注意温度的设定和维持的时间;高压蒸汽灭菌时应注意压力、温度和时间, 压力应保持在0.103 MPa以上, 温度121℃, 时间大于30 min, 并且已灭菌的培养器材要严格控制使用期限, 在妥善保管的条件下, 天气干燥的春秋季节可使用1周, 炎热潮湿的夏季可使用2~3 d。
培养器材的特性及灭菌过程的差异也会对培养体系产生影响, 塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂, 生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。因此, 根据生产工艺, 储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器, 因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分[5]。此外, 各生物反应器、管道连接及工艺等进入生产线前均需做无菌验证。
3.1.2 操作环境污染的控制
规模化细胞培养无菌室具有严格的要求, 才能保证操作过程的无菌:首先须有防止微生物污染和有害因素影响的措施;其次要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘, 不受日光直射, 大小适当, 高度适宜;再次要求相对封闭, 设有缓冲间, 对无菌室每天用一定比例的消毒液进行定期清扫和拖洗;最后室内不易放置太多与细胞培养无关的杂物, 要时刻保持室内干燥, 有利于降低因环境因素引起的细胞污染概率。
紫外消毒是避免细胞培养过程中因环境引起细胞污染的主要措施[6], 超净工作台应放置在无菌室内, 每次使用前先开启紫外灯灭菌30 min, 同时启动风机净化30 min后再进行细胞培养等一系列操作。操作结束后用75%酒精棉将台面擦拭干净, 再用紫外灯照射30 min杀菌。超净工作台在长期使用过程中可能会因灰尘积结过多而阻塞空气过滤器, 因此使用过程中应时刻观察台内气流, 若气流变弱, 酒精灯火焰几乎不动时, 应及时检测风速、清洗或更换滤板。
3.1.3 操作人员污染的控制
操作人员在进入无菌室前, 须用肥皂洗手, 按规定穿隔离衣, 在缓冲间换穿专用服装和拖鞋, 进出无菌间门口需用消毒剂洗手, 操作开始首先采用75%酒精棉球擦拭手双手及瓶口。操作时动作保持轻柔, 尽量不谈话, 若打喷嚏或咳嗽应转向背面。经常更换吸管, 一旦发现吸管口接触手或其他物品外壁时均应及时弃去更换一支。严禁在试验进行过程中频繁出入无菌室, 试验完毕用消毒水浸泡的纱布擦拭台面, 将试验产生的固体垃圾和废液等分类归置后及时清理出无菌室, 在进行多种细胞培养操作时, 所用器具要严格区分开。操作人员的无菌意识是生产操作中的重中之重, 一名有良好无菌意识的操作人员对大规模培养细胞的稳定性有着重要意义。
3.1.4 交叉污染的控制
细胞培养时, 在同一个无菌室或超净台里最好不要同时操作两个或两个以上细胞株。细胞间的交叉污染可使细胞形态和生物学活性发生改变, 能否控制细胞间的交叉污染对细胞产能起着决定性作用[7]。所以, 应尽可能减少无菌室或超净工作台内放置的物品, 而且培养试剂一定要分门别类, 如同一个无菌室不同操作者所使用的, 如胰酶、培养液等, 避免因为一个操作者的失误致使无菌间内所有细胞发生污染。
3.1.5 内源性污染
为了减少内源性污染对规模化细胞培养的影响, 必须建立细胞种子库。细胞种子库分为主细胞库 (Master cell bank, MC) 和工作细胞库 (Working cell bank, WC) 。细胞库保存的二倍体细胞要经过细菌、霉菌、病毒、支原体、胞核学、细胞鉴定、致瘤致癌性及病毒培养适应性等一系列的检测和鉴定, 确保细胞库的细胞的纯净性, 从而作为理想的细胞来源[8]。原代细胞可以采取次代培养的方式避免污染的发生, 例如当需要大量培养细胞时才可从主细胞库中复苏细胞来建立工作细胞库, 若试验或生产需要细胞时只要从工作细胞库复苏细胞即可, 传代次数不能超过最高限制代次。为了保证培养细胞系的完整性, 细胞冻存时必须进行其信息的登记, 如每一个冻存标本都应明确记录细胞的种类、来源、代数、倍增时间、冻存日期以及有无细胞污染, 有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。对于外来的细胞系的选择, 应保证其来源、品种明确、遗传性稳定、生产性能较佳[9]。
4 总结和展望
在规模化细胞培养中, 造成细胞污染的原因各异, 控制细胞污染举措的多样。本文较系统地阐述了规模化生产中细胞培养污染的来源、种类以及防治各种污染的举措三个方面, 列举了生产中经常遇到的情况。实践表明在生产过程中只要严格按照兽药生产质量管理规范 (GMP) 操作, 注意每一个操作环节, 加强无菌意识的防范, 就能有效地减少和控制污染、降低损失, 提高生物制品的质量, 为顺利生产及试验奠定基础。
摘要：细胞污染是动物细胞培养技术中面临的主要问题。本文从细胞培养过程中污染产生的来源、种类及控制策略等方面对规模化培养过程中常见的污染类型及防控手段进行综述, 为提高细胞培养水平、防治细胞培养过程中可能出现的污染状况及研究新的去除污染的手段提供新的思路, 为有效减少和控制污染、降低损失, 提高生物制品的质量奠定基础。
关键词：细胞培养,细胞污染,污染控制
参考文献
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[8]Degeling M H, Maguire C A, Bovenberg M S S, et al.Sensitive assay for mycoplasma detection in mammalian cell culture[J].Analytical chemistry, 2012, 84 (9) :4227-4232.
培养规模 第8篇
目前, 普遍采用的是传统的转瓶生产工艺, 但转瓶劳动强度高, 车间占地面积大, 易污染, 产量低, 且质量不易控制。生物反应器培养因其可控制细胞培养环境和营养条件, 产品质量易于控制, 易于实现工业化大规模生产, 因而成为今后疫苗生产的发展方向。采用微载体大规模培养贴壁细胞模式被应用于工业化生产[2], 虽然已成为很有效的模式[3], 但目前常用的微载体使用前后处理麻烦, 价格昂贵, 并且该培养模式对设备和微载体的要求都很高, 细胞的生长代谢常常受到微载体浓度的限制[4]。NBS吊篮生物反应器是目前另一种被广泛采用的生物反应器, 通过添加酯片载体来增加细胞吸附生长面积, 从而实现高密度培养的目的, 但是该系列反应器放大的问题难于解决, 其最大的14 L反应器 (500 g酯片载量) 大大限制了规模的进一步扩大, 而昂贵的设备及酯片价格, 极大地提高了疫苗产品的投资成本及生产成本。
本实验采用全部国产的细胞载体和一次性激流—灌注式生物反应器[5], 该反应器灌注培养系统采用外循环式细胞载体灌注培养工艺, 将载体培养袋固定于反应器外, 通过蠕动泵及重力作用实现培养液供给细胞正常生长代谢所需要的养分, 带走代谢产物, 利用激流式生物反应器在线监控溶氧[6]、pH、温度等条件, 为细胞生长创造有利环境。该培养工艺的主要优势在于:操作方便, 细胞生长快, 存活能力稳定, 一次性灌注细胞培养袋的细胞容易冲洗和胰酶消化, 解决逐级放大的接种问题, 并且重力作用的培养模式, 可实现大量细胞载体的添加, 10 L反应器含150 g细胞载体, 100 L反应器含1 500 g细胞载体, 600 L反应器含7 200 g细胞载体。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
DMEM高糖培养基, GIBCO 12800;V001无血清培养基 (葡萄糖含量2 g/L) , 本公司自制;胎牛血清, 武汉三利;胰酶, Sigma T4799。
Vero细胞, 由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。
葡萄糖测定试剂盒, 上海荣盛生物科技有限公司, CAT 261500。
20 m L、220 m L纸片载体转管 (如图1、图2) , 杭州安普生物工程有限公司, 载体量分别为0.6 g和6 g。
一次性细胞培养袋:激流细胞培养袋、灌注细胞培养袋 (如图3、图4) , 杭州安普生物工程有限公司。
培养基储液袋:10 L、50 L (如图5) , 杭州安普生物工程有限公司。
1.2 主要仪器
CO2培养箱, Forma 3110。
分光光度计, Amersham Ultrospec 2100 pro。
显微镜, Fisher Scientific
微型反应器, 杭州安普生物工程有限公司。
AP20 (10 L) 、AP200 (100 L) 激流—灌注生物反应器, 杭州安普生物工程有限公司, 细胞载体量分别为150 g和1 200 g。反应器结构 (分别为灌注系统、激流式生物反应器、控制器) 如图6所示。
1.3 方法
1.3.1 种子链扩增
Vero细胞培养, 生长液为DMEM+10%胎牛血清 (FBS) , 37℃, 5%CO2。
按一定密度接种于T75方瓶中, 当细胞长满90%以上时, 胰酶消化细胞, 用20～30 m L生长液重悬细胞 (1.0×107个) 接种至20 m L纸片载体转管。接种后每天换液, 并监测培养液中葡萄糖含量, 培养7天后日糖耗趋于平稳, 使用胰酶消化[弃去生长液, 加入20 m L PBS浸没润洗两次, 弃去, 加入胰酶15 m L, 放入微型反应器旋转, 37℃, 20 min, 取出转管震荡, 收集细胞液 (在收集瓶中预先加入生长液) , 重复2次, 离心弃去胰酶]收集细胞血球计数板计数。
将1个20 m L纸片载体转管收获细胞转接至1个220 m L纸片载体转管, 接种量约为1.0×108个细胞, 培养液体积200～300 m L, 培养方法与消化方法同20 m L纸片转管。
将1个220 m L纸片载体转管消化的细胞接种AP20生物反应器 (种子罐) 。接种量约为1.5×109个细胞, 温度37℃, 控制DO 50%～60%, pH 7.2～7.4, 初始接种体积为6～8 L, 最大工作体积10 L, 通过监测残糖量确定流加补料及换液情况, 使葡萄糖维持在2 g/L以上, 待日糖耗趋于平稳时, 胰酶消化[把所有培养液打入储液袋, 弃去, 将PBS通过蠕动泵打入灌注培养袋至2/3位置, 浸润摇晃后弃去, 重复1次, 打入2 L胰酶, 反复震荡20 min, 待胰酶混浊, 将细胞悬液打入激流反应器 (预先打入生长液) , 重复2次]取样计数。
1.3.2 AP200激流—灌注式反应器培养
将AP20与AP200的激流反应器部分用快接头相连, 通过蠕动泵将细胞打入AP200反应器。接种量约为1.5×1010个细胞, 初始接种体积为50～60 L, 最大工作体积100 L, 培养方法同AP20反应器, 细胞计数时采用灌注袋不同位置取1 g纸片, 胰酶消化, 血球计数板计数, 推算1 200 g细胞载体总细胞量。
1.3.3 连续灌注培养维持时间研究
种子链扩增至AP200反应器, 方法同上。每日检测葡萄糖消耗量, 待耗糖不再明显增加, 约12天, 生长液全部排出, PBS润洗2次, 换为V001维持液, 培养温度降至35℃, pH7.4～7.8, DO50%～60%。连续灌注培养以维持细胞生长, 反应器灌注流量根据培养液中残余葡萄糖含量进行调整, 由于细胞不断老化脱落, 代谢减缓, 逐步降低灌注速度, 待细胞大量脱落, 终止实验。
2 结果
2.1 种子链扩增
2.1.1 20 m L纸片载体转管
接种量为1×107个细胞, 每天换液并检测残糖量, 曲线如图7。生长7天后糖耗达到最大, 胰酶消化得到2.3×108个细胞, 显微镜观察, 细胞透亮, 外壁清晰, 活率在95%以上, 细胞倍增23倍, 将1.0×108个细胞转接至1个220 m L纸片载体转管。
2.1.2 220 m L纸片载体转管
接种量为1×108个细胞, 每天换液并检测残糖量, 曲线如图8。生长6天后胰酶消化, 得到1.5×109个细胞, 显微镜观察, 细胞透亮, 外壁清晰, 活率在95%以上, 细胞倍增15倍, 将细胞全部接种至AP20反应器。
2.1.3 AP20激流—灌注式反应器
接种量1.5×109 cells, 根据葡萄糖含量采用流加补料或换液处理的方式, 保持残糖量在2.0 g/L左右, 培养工艺如图9所示。反应器自动控制培养条件, 激流反应器转速55 r/min, 培养基循环速度为450～550 m L/min, 培养时间6天, 第2天全部换液, 第4天流加补料3 L, 第5天全部换液, 第6天胰酶消化灌注细胞培养袋, 最终收获16.0×109个细胞, 状态良好, 活率在90%以上, 细胞增殖10倍, 总共灌注培养液22 L。
2.2 AP200激流—灌注式反应器
接种量1.5×1010 cells, 残糖控制在2.0 g/L左右, 培养工艺如图10。反应器自动控制培养条件, 摇床转速35 r/min, 循环速度500 m L/min, 培养9天时间, 第3天换液30 L, 第5天换液30 L, 第6天换液30 L, 第7天换液60 L, 第7天补糖1.8 g/L, 总共灌注培养液150 L。
从灌注袋侧面自上至下3个位置, 每处取约1 g纸片, 中部也从上至下取3处纸片, 如图11所示, 消化纸片上细胞, 计算每克纸片细胞量, 平均值为3.73×108个/g, 推算出总细胞量44.8×1010个 (3.73×108/g×1 200 g) , 细胞增殖30倍。从细胞量看, 各点细胞分布基本均匀。
2.3 生长期向维持期的转换
根据耗糖情况, AP200在细胞密度达到约7×106cells/m L时, 将培养液换为V001维持液。早期葡萄糖消耗量基本维持平衡, 直到20天以后消耗量降低。整个过程根据耗糖情况逐渐降低灌注流量, 总共维持24天时间, 收获约10个工作体积培养液。葡萄糖含量及灌注流量曲线如图12。维持期终止后, 灌注培养袋各点取约1 g纸片, 消化计数, 细胞量约3.0×108个/g, 活率>70%。
3 分析与讨论
传统转瓶生产工艺是目前成熟的Vero及其他疫苗基质细胞培养方法, 但由于操作繁琐, 传代环节多, 易污染以及产品质量难于控制是其大规模应用的主要障碍。微载体培养贴壁细胞是迄今最常用最有效的方法, 以Cytodex系列应用最广, 但微载体使用前后均有较复杂的处理步骤, 并且细胞的增殖也受到剪切力、代谢物的积累等因素影响。激流—灌注式生物反应器采用纸片载体培养模式, 纸片载体呈三维立体结构 (如图13、图14所示) , 可增加细胞吸附生长面积。该模式易于细胞生长及营养供给, 培养过程可采用连续灌注培养, 不断加入新鲜培养液的同时排出旧液, 能有效、及时供给营养除去代谢产物, 使细胞始终处于良好的营养状态, 适用于高密度细胞培养, 同时延长细胞维持时间, 有利于病毒的持续繁殖, 提高疫苗产量。
激流—灌注式生物反应器可解决大培养贴壁培养的问题, 1个AP200纸片载体灌注系统的细胞量相当于1 200个大转瓶的生产车间, 而AP1200拥有7 200 g细胞载体量。另外该设备空间占用少、操作简便。所有耗材经过γ射线照射, 一次性使用, 极大地降低劳动强度, 缩短批间处理周期, 极大地提高工作效率, 特别适合于大规模人用、兽用疫苗生产。
摘要：反应器培养Vero细胞以微载体 (Cytodex等载体) 及NBS公司CellGen310酯片培养为主, 培养工艺对设备、技术要求高, 一次性投资大, 微载体和酯片处理繁琐, 耗材价格昂贵, 生产成本高。实验采用一次性激流-灌注式生物反应器大规模培养Vero细胞, 通过控制DO、pH等条件, 开发出便捷、稳定的大规模培养工艺, 为疫苗工业采用大规模细胞培养工艺生产疫苗奠定基础。
关键词：Vero细胞,大规模细胞培养,一次性生物反应器,激流—灌注式生物反应器
参考文献
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[5]Li Luanfeng, et al.A Single-Use, Scalable Perfus-ion Bioreactor System.BioProcess Int.2009, 6:46～54
培养规模 第9篇
一、高等教育的兴旺与大学毕业生遭遇的尴尬
中国高等教育目前在校人数超过2500万人,毛入学率达23%,普通高校毕业生的人数从2000年到2007年分别是107万、115万、145万、212万、280万、338万、413万、495万,6年间净增388万毕业生,近3年来每年更是净增77万,是不是培养的人才过剩造成了就业的巨大压力呢?
最近麦肯锡的一项研究报告中称:中国缺乏训练有素的大学毕业生,这可能阻碍中国的经济增长以及发展更先进的产业。中国正处于努力从以制造业为主导的经济,向服务和研究产业转变的过程中。中国面临人力资源困难,尽管中国目前毕业新生数量巨大。麦肯锡预测,跨国公司欲在华招聘高质量员工也将困难重重,因为目前有越来越多的外资企业在华扩张业务。
该报告基于对83位人力资源高管的访谈。这些人士认为,中国毕业生中只有不到10%拥有为外企工作的技能,而相比之下,印度的该比例则达到25%。“一方面是短缺,另一方面是丰富,这是个自相矛盾的问题。”中国每年新培养出约60万名工程师,是美国的9倍。然而,在中国160万名年轻工程师中,只有约16万名具备为跨国公司工作所需的实用技能和语言技能。
该研究报告称,10年后,中国将需要7.5万名具备某种国际经验的经理人。中国目前仅有约5000名此类人才。
二、中国的企业将面对ERP普及时代
我们现在正处于一个新的历史时期——ER P普及时代到来的时期。正像100多年前福特的“T”形汽车改变了汽车工业,改变了现代工业的方式,对现代人的生活方式产生了巨大的影响一样,ERP在中国经过20多年的实践,将进入到一个全新的时期,中国ERP普及的全新时代已经向我们走来。
回顾中国企业应用ERP历史的沿革,其发展历程分为三个阶段:1990—1997年,E R P导入时代,主要以国际厂商的产品为主导。在导入阶段ERP的推行和应用的结果并不是很理想,应用E R P失败的例子较多。第一,因为引进的系统很庞大,很复杂,不适合中国的商业环境,不适合中国企业的管理特性;第二,当时中国大量企业的管理基础还不具备实施ER P的条件;第三,社会信息化的整体水平还没有达到一定的水准。
1997—2004年,ERP成长时代,一批国产ERP产品和国内ERP厂商发展和成熟起来。在这一阶段,国产ERP产品在中国整体份额首次超过国外产品在中国的份额,成为中国E R P市场主要产品的提供者。随着国产E R P产品的不断成熟和交付能力的提高,越来越多的企业开始应用ERP,并取得了成功,产生了效益,企业对ERP的疑虑逐渐打消。同时,国内ER P厂商和中国ER P产业经过多年的发展也建立了相应的基础。在这样一个国产ERP大力发展和国产ERP成功应用的基础上,中国ERP应用开始迈上一个新的台阶。
从2004年开始,E R P普及时代。E R P普及时代对产品有特定的要求,它要求产品更加易用,也更容易实施,要求客户拥有一套ER P并实现运行的整体拥有成本不能太高。在这样一个新的阶段,可以预见国内厂商将会继续成为这个市场的主导,而且会形成一个更大的产业链来支持全国广大企业用户,支持ERP的普及发展。
在这个阶段,正如下图所示,ER P应用将从贵族式消费变成广泛企业的大众消费。
在企业内部,早期E R P应用是少数人在用,现在的ERP是一些职能部门在用,但是在普及时代,ERP不光是职能部门用,而且公司每一个人都要用。E R P的普及应用是全员应用,也不再是一把手工程,而是全员工程。
整个社会的ERP人才也从几年前只有少数的ERP精英变成现在ERP人才的社会化,越来越多的ERP人才将分布在社会各个行业和众多企业之中。本土厂商将作为ERP普及的核心企业,并以这些核心企业为先导,带动和形成整个中国ERP产业链的发展,服务于中国多数企业客户。
三、“ERP实验中心”是规模化培养ERP普及时代人才的创新模式
在ERP普及时代中,ERP一定是全员的应用,是企业管理者和决策人不可缺少的工具。为了弥补信息化人才匮乏,全国800所高校建立了“E R P实验中心”,它构建了一个校企沟通、合作的平台,是有效地规模化培养社会需要人才的必然趋势。在大众化教育时期,高等院校培养目标一定是培养复合的并能在变化的职场中找到职位的公民,因此,学校能否规模化“交付”成果,取决于以下三个问题:(1)课程设置是否符合社会真正的需求?(2)训练平台是否合适?(3)培养流程是否有效?
1.“ERP实验中心”正在搭建获取社会需求的有效桥梁
社会真正的需求来自于社会本身。当今社会经济最大的特点可用前通用电气总裁韦尔奇的话概括:变革是唯一不变的变量。社会每天都在产生着新的职业,即便是传统的职业,就其工作内容和对人员能力以及工作方式的要求也在不断地更新。信息时代企业用人的标准,用微软人力资源总监的话:“招聘人才,关键是看其与岗位的吻合程度……”那么,对岗位吻合度的把握上,传统的学院教育暴露出对社会经济环境和职场环境的变化不敏感的固有缺陷,如果没有来自企业的意见,没有来自行业的需求,学校要随时把握社会对人才的真实需求是办不到的,因此,校企结合首先要解决的就是要搭建校企有效沟通的渠道问题。
2.“ERP实验中心”可以构建一个真实的仿真企业平台
自然科学理论的验证可以营造一个按照理论的逻辑来证明理论正确的模拟实验环境进行,它是可以反复再现的,是科学的;而社会科学理论的验证,这种营造的环境往往在真实的环境下不能再现。比如,有的模拟实验软件,在填制一张单据时,将规定的填制项目作为实验点,当漏填项目时,本实验提示出错,或扣除实验得分,但在现实社会中,根本不会再现这样的平台,或者很少能获得这样的报错提示。现实社会只有根据最后的结果来判定提供信息的可用和正确性,所有提供信息的人员应该知道如何判断最终的信息是否准确与正确,如何保证信息的准确与正确,如何修订错误和误差。在真实平台上进行这样的训练,是最有效的手段之一。受训者经过训练,能够掌握真实环境的操作要点,熟悉工作环境,学习在真实环境下解决问题。
“E R P实验中心”就是坚持以真实的管理工具作为训练工具,在一个复杂、竞争的环境中,让学生们了解企业,学习如何在企业工作。“ERP实验中心”把企业搬进了课堂,将企业的工作环境、企业面临的社会环境等要素抽取微缩,用一种全新的模拟形式再现企业生存的环境,用数据、案例、模拟场景、模拟经营等多种形式进行教学。正是真实的软件平台和仿真的企业环境构建了崭新的社会实践方式,有效地解决了实践教学的死结,同时也创造了更为贴近社会现实的实训环境。
3.“ERP实验中心”可以开创更为科学的训练方式
管理学大师德鲁克说:“管理是一种实践,其本质不在于‘知’而在于‘行’;其验证不在于逻辑,而在于成果;其唯一权威就是成就。”在目前的高等教育中,认知教育的课程仍然占据主要地位。认知教育是一种报告式的传授方式,目的是让学生“知”即可,不能体现结果检验的管理精髓,也正是目前高等教育与社会脱节的根源所在。作为管理者最需要知道的是他们如何行动才能得到合适的结果,而根据结果重新确定下一步的行动,目前的教育恰恰缺乏这样的训练手段。因此,改变教学方式,按照科学的认知规律安排学程,是培养现代信息化管理人才必不可少的任务之一。以结果目标为判别标准的教学活动很难或根本不能在传统的教学组织下进行,主要有以下两点理由:
(1)很多管理过程是由产生结果的各个环节组成,不经过完整过程,是无法得到结果的。而一个完整的过程的实现均需要相当的时间段,而目前的课程是分时段进行的,很难再现过程,因此,在常规的课程时间内无法完成以最终结果为检验目标的过程训练。
(2)传统的教学只能在专业的某一点上展开,我们称之为点教育模式,专业的教师往往难以顾及课程与课程之间的联系,从而形成了知识孤岛,目前院校课程中基本没有贯通应用的实训方式和课程。
利用“ER P实验中心”,研究适合于结果检验的实训教学方式和教学管理,让更多的学子能在这样的环境中受训从而受益,是当前研究的重点。
总之,当前许多高校正在利用“E R P实验中心”,不断地创新现代信息应用人才培养的模式,整合学院教育和社会教育资源,为规模化培养信息化应用人才而努力。
参考文献
培养规模 第10篇
关键词：BHK-21,大规模细胞培养,一次性生物反应器,细胞载体,激流&,灌注式生物反应器
口蹄疫是由口蹄疫病毒 (FMDV) 引起的一种危害严重的烈性传染病之一, 主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物, 给畜牧业生产和人民生活造成极大损失, 世界各国对口蹄疫病毒的研究极为重视, 而研制口蹄疫疫苗是防治口蹄疫爆发的有效措施之一。
基质细胞是病毒增殖的唯一场所, 也是为病毒增殖提供能量和原材料的唯一载体。因此, 细胞培养技术对病毒繁殖起着十分重要的作用, 是疫苗生产的基本技术之一。BHK-21细胞可广泛应用于口蹄疫疫苗生产, 是对口蹄疫病毒较为敏感的细胞, 因此大规模培养BHK-21细胞成为口蹄疫疫苗生产的关键技术。
目前大规模培养BHK-21细胞主要采用转瓶培养系统, 悬浮培养该细胞工艺还处于实验摸索阶段。转瓶培养也有以下一些缺点: (1) 其表面积有限, 单位体积所提供的细胞生长表面积小, 细胞生长密度低; (2) 培养时监测和控制环境条件 (pH、溶氧等) 受到限制, 不能够稳定控制产品质量; (3) 转瓶培养的劳动强度大, 占用空间大, 污染率高。而悬浮培养工艺还不成熟, 技术和设备要求高, 工业化生产还不现实。
为了克服这些缺点, 本试验采用细胞载体和一次性激流&灌注式生物反应器[1,2,3], 成功地发展了大规模培养BHK-21细胞的工艺, 为工业化生产口蹄疫疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
DMEM培养基, GIBCO 12800;胎牛血清, 武汉三利;胰酶, Sigma T4799。
BHK-21细胞, 购自中科院武汉病毒所。
葡萄糖测定试剂盒, 上海荣盛生物科技有限公司, CAT 261500。
20 m L、220 m L纸片载体转管, 杭州安普生物工程有限公司, 载体量分别为0.6 g和6 g。一次性细胞培养袋:灌注细胞培养袋、激流细胞培养袋, 杭州安普生物工程有限公司。
培养基储液袋:10 L、50 L, 杭州安普生物工程有限公司。
1.2 主要仪器
CO2培养箱, Forma 3110。
分光光度计, Amersham Ultrospec 2100 pro。显微镜, Fisher Scientific。
微型反应器, 杭州安普生物工程有限公司。
AP20 (10 L) 、AP200 (100 L) 激流&灌注式生物反应器, 杭州安普生物工程有限公司, 细胞载体量分别为150 g和1 200 g。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
BHK-21细胞在含有10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养基内按常规方法培养。待T75方瓶细胞贴满80%～90%, 胰酶消化细胞至20 m L纸片载体转管 (如图1) , 接种量约1.0×107 cells, 培养体积20～30 m L, 每日检测培养液糖量, 根据耗糖情况, 从第2日开始每天换液, 待细胞生长至一定密度, 消化载体细胞, 接种220 m L纸片载体转管 (如图2) , 接种量约1.0×108 cells, 体积200～300 m L, 培养方法与20 m L转管相同。最终消化细胞接种AP 20生物反应器 (如图3) 。
1.3.2 AP20反应器培养
接种细胞量:2.0×109 cells;初始培养体积:7 L, 最大工作体积10 L。
pH:7.0～7.4;温度:37℃;溶解氧 (DO) :40%～60%;摇动速度40～50 r/min。
每天取样检测培养液残糖进行流加补料或灌注培养, 使葡萄糖含量维持在2 g/L以上。
作为种子罐, 当细胞达到一定密度时, 约8～10天时间, 胰酶消化载体细胞, 将细胞转移至AP200生物反应器 (如图4) 。
1.3.3 AP200反应器培养
接种细胞量:3.0×1010 cells;初始培养体积:50 L, 最大工作体积100 L。
pH:7.0～7.4;温度:37℃;溶解氧 (DO) :40%～60%;摇动速度30～40 r/min。
检测方式与AP20相同, 葡萄糖含量维持在2 g/L以上, 反应器自动控制进行正常细胞培养。
2 结果
2.1 转管培养
20 m L转管含有0.6 g细胞载体, 接种量约1.0×107cells, 通过耗糖曲线间接反映细胞生长情况, 耗糖曲线如图5所示, 每日耗糖量逐渐升高, 可见细胞生长良好。生长6天后, 胰酶消化得到25.0×107 cells, 细胞增殖25倍。
220 m L转管含有6 g细胞载体, 接种量约1.0×108cells, 耗糖曲线如图6所示, 培养7天后, 胰酶消化
2.2 AP20灌注式反应器培养
接种量2.0×109 cells, 初始工作体积7 L, 根据葡萄糖含量连续灌注培养, 保持残糖量在2.0 g/L左右, 培养工艺如图9所示, 反应器自动控制, 培养时间8天, 从第4天开始连续培养, 进出料控制为3.5 L/d, 第6天提升灌注量为7 L/d, 胰酶消化灌注细胞培养袋, 最终收获细胞30.0×109 cells (活性95%以上) , 细胞增殖15倍, 总共灌注培养液20 L。
2.3 AP200灌注式反应器培养
接种量3.0×1010 cells, 初始工作体积50 L, 残糖控制在1.0 g/L左右, 培养工艺如图10所示, 培养11天时间, 从第5天开始灌注浓缩液 (补4.0 g/L葡萄糖) , 灌注量逐渐增加, 总共灌注培养液120 L, 最终收获细胞53.6×1010 cells (活性90%以上) , 相当于1.07×107cells/m L, 细胞增殖18倍。
3 分析与讨论
3.1 细胞载体
转瓶培养是目前生产中采用最多的培养容器, 但是转瓶表面积有限。通过添加细胞载体的方式, 可增加细胞吸附生长面积。电镜扫描图如图11显示, 细胞载体为细胞生长提供了三维立体的空间结构, 单位体积所提供的细胞生长表面积极大, 在AP200反应器 (100 L) 中细胞载体能达到的细胞量为4.5×108cells/g, 细胞密度1.07×107 cells/m L, 基本上达到850 cm2转瓶 (3 L) 细胞量的2～3倍, 一个100 L反应器的细胞数就相当于2 400～3 600个3 L转瓶的细胞数。
采用细胞载体的培养方式, 细胞消化、传代、培养等工艺与转瓶培养相同, 与微载体培养以及其他培养模式相比, 对技术和设备要求更简单, 更易于掌握操作方法, 工艺开发更方便, 易于实现工业化生产。
3.2 反应器培养BHK-21细胞
生物反应器培养BHK-21细胞, 可监测和控制环境条件应使细胞处于稳定的培养条件, 细胞密度和细胞活性远远高于转瓶培养系统。为了提供稳定的营养条件, 国内现行反应器培养多采用流加培养液或部分换液的方法, 但高密度细胞培养时, 细胞代谢旺盛, 营养需求高, 上述方法仍不能及时补充营养成分、清除代谢产物。激流&灌注式生物反应器采用灌注培养方法, 营养物质不断补充均匀充足, 代谢产物 (乳酸和氨等有毒产物) 不断排去, 使细胞处于一种极其稳定的营养状态, 可大大提高了细胞密度, 延长维持时间 (细胞达到最大细胞密度34℃培养, 细胞可维持22天时间) , 有利于病毒的持续繁殖, 提高疫苗质量。
此外, 该反应器系统采用一次性工艺袋产品 (如图12、图13、图14) , 耗材辐照处理, 即用即取, 免除转瓶清洗、消毒处理步骤, 减少批间准备时间, 降低劳动强度, 生产疫苗所需人员和GMP生产车间面积将大大低于转瓶的疫苗生产。
与悬浮培养生物反应器相比, 设备要求低, 成本低, 从而将减低疫苗企业投资成本, 降低疫苗生产成本, 为大规模反应器生产口蹄疫疫苗奠定基础。
参考文献
[1]Hui M.AmProtein Corporation.A Method to Increase Dissolved Oxygen in a Culture Vessel.Internatio-nal Patent#WO2007/142664, 2007
[2]Jia Q, et al.A Bioreactor System Based on a Novel Oxygen Transfer Method.BioProcess Int.2008, 6 (6) :66～78
规模背后的话题 第11篇
台湾出版业自20世纪80年代突飞猛进的发展之后，1996年起至今一直处于低迷阶段。近两年随着大中华出版概念的形成，内地与港台出版界之间的合作越来越密切，而且两岸经济往来和文化交流的增加，简体字也越来越普及，简体字的阅读障碍已经缩小，因此，简体字版图书以学术水平高、定价低越来越受华文读者欢迎。这从今年的香港书展和此次海峡两岸图书交易会的图书销售情况中也可以看出。
本届交易会重点在图书交易，因此，展会期间，组委会安排参观了联经出版公司上海书店、农学物流中心、PAGE ONE等书店，以了解台湾图书销售及图书物流等情况。在考察过程中，我们认为台湾出版业有许多先进经验值得大陆同业学习借鉴，如:农学社物流中心从配新书到收退货全部是机械化流水线处理，效率非常高;物流中心与书店都有详细的专业读者资料库及跟踪服务;具有严明的制度，比较讲诚信，因此欠款坏账较少。同时，我们也看到一些存在的问题——高退货率，台湾的出版社不限制退货，所以退货率高达40%～50%，这也使成本增加。台湾的人工费用较高，有的一流出版社因为冗员、资金周转出现问题而倒闭。
此届交易会的参展图书是由厦门对外图书交流中心组织大陆出版社货源，由台湾金典书局统一包销，折扣相对优惠，不退货，书款统一由厦门外图承付。因此，不会有一般书展对卖不出去的图书如何处理的后顾之忧。
本届交易会也有一些不尽人意的地方。首先，本届交易会主要目的旨在销售图书，而非展示各出版社的实力，因此台湾方面的组委会将参加展销的图书，像在书店中销售时那样根据零售图书分类来一架一架地陈列摆放，没有按出版社来分，以致出版社标识牌下看不到本社的图书。其次，由于台湾方面没举办过这么大的图书交易会，一些准备工作不到位。第三，由于展会期间适逢台湾政局有些动荡，加上学校还未开学，展场上人气不太旺，影响了图书的销售。
与今年7月在香港举行的第十七届香港书展相比而言，其热闹场面不可同日而语。香港书展期间，香港市民具有很大的购书热情和购买力，许多读者都是拿着拉杆箱前来买书，许多展位前都是排着长队。尤其是一些中小学生，在书展开幕当天，书展还未开展，就在门外排起了长龙。因此，每天进场的人数很多，最多时可达数十万人，十天书展中约有共68万香港市民及观光客前来购书。香港书展以其展场面积大、参展图书题材丰富，吸引了许多国家和地区的出版业内人士踊跃参加，它已发展成为亚太地区最著名的书刊展览会之一，成为香港读者每年期盼的读书、购书场所。香港只有近700万人口，而台湾有2300万人口。因此，台湾应具有更高的图书购买力，但在此次交易会上未见到预料的场景，或许这与承办方的销售策略相关吧。
香港漫画低迷动漫升温
香港经济在复苏，但香港漫画出版市场却尚在严冬之中，较有市场保证的作者，如黄玉郎、马荣成等，出书已极为慎重，尽量集中所有有利元素使自己立于不败之地。
相对漫画出版的困局，香港动漫市场有所突破。借助内地扶持动漫游戏产业大好东风，香港与深圳推出了“深港双城互动计划”，争取在深圳实行港资动漫游戏企业国民待遇。据透露，港深动漫业合作将包括:吸引国际娱乐传媒集团和大型娱乐设施落户深圳，吸引香港创意企业和人才到深创业、发展，鼓励香港动漫游戏企业和经营机构将开发、制作、加工、培训及营销等业务部门进入深圳。
培养规模 第12篇
关键词：医学留学生,病历,双语教学
《全面提高高等教育质量的若干意见》 (高教三十条) 提出“全面实施留学中国计划, 扩大外国留学生规模”是对外开放、提高质量的重要途径。以江苏省为例, 计划到2020年, 来华留学生教育规模达到5万人, 其中70%为学历生, 医学留学生可以达到100%的学历生比例。因此着重发展医学留学生教育, 是加快实现“十二五”规划及中长期纲要的重要手段。提高医学留学生的培养质量, 具有重要的实际价值和社会意义。
近年来, 我国临床医学专业留学生的主要生源国有印度、尼泊尔、马来西亚、泰国等周边国家, 及少量非洲国家。根据面向相关医学院校进行的问卷调查及我校历年生源情况的统计表明, 来华医学留学生的基本情况为:基础知识薄弱, 生源质量参差不齐, 汉语程度基本为零起点[1]。
1.医学留学生培养的难点
纵观医学留学生培养的整个过程, 临床见习实习无疑是重点和难点:首先, 这一阶段是医学生由理论向实践过渡、由被动接受知识向主动运用知识转变的阶段, 对医学生角色培养起到至关重要的作用。其次, 这一阶段, 留学生从教室走向医院, 从校园走向社会, 语言障碍矛盾骤然凸显。临床带教老师反馈带教留学生语言关不过, 深入的教学很难开展。这就给医学留学生教育产业化造成了障碍[2,3,4]。
2.现状分析
国内招收全英文医学留学生的院校, 对提高留学生临床见习实习学习质量采取的措施主要有:提高留学生汉语要求水平, 如HSK级别要求;提高带教老师英语水平, 如增加教师出国进修机会等;进行以汉语教研室为主要力量的汉语、医学汉语的一系列教改措施等[5,6]。然而, 经过实践检验, 以上措施并未能起到对症下药、釜底抽薪的作用。
2.1汉语文化博大精深, 要求学生通过提高日常汉语的水平, 从而增加临床沟通的顺畅程度, 势必事倍功半, 增加学生的学习负担, 偏离汉语教学为临床教学服务的初衷[7]。
我国方言种类众多, 大体可分为八大方言语系。以江苏省为例, 江淮语系和吴语系使用各半, 与以北京话为基础的普通话相比, 其均在发音和语言习惯上有较大差别。留学生需极高的汉语熟识度才能做到与患者等自如交流, 然而事实上, 即使是日常会话汉语水平 (例如以HSK考量) 达到较高水平的留学生, 在接触临床后仍然觉得力不从心。
2.2留学生在见习实习阶段的学习渠道主要有: (1) “医-医”, 即医学生与医务工作者之间的沟通学习; (2) “医-患”, 即医学生通过临床与患者问诊等, 掌握第一手学习资料; (3) 医学书籍和文献等。
与患者沟通的困难, 使得留学生在医院的学习重心更多地由“医-患”向“医-医”倾斜, 依靠老师的讲解, 但带教老师因为临床工作压力大, 为留学生随时介绍患者病情和诊疗要点并不现实。留学生如能自行通过翻阅病历, 可在第一时间掌握带教老师对病人的诊疗。
小样本问卷调查结果:在南京医科大学国际教育学院2007级留学生中, 51名学生在华临床实习一年, 在其实习结束后, 对其进行医学汉语问卷调查, 主要结果如下:31名学生 (59.7%) 认为“与临床医生的交流, 以及病历内容的听说读写”需要加强, 19名学生 (38.8%) 认为“与患者的交流、病史采集”需要加强;1名学生 (1.5%) 认为“中文医学书籍、文献资料的学习”需要加强。如图:
2.3在“医-医”沟通过程中, 如汇报病史、病例讨论及病历书写等过程中, 出现“律平” (心律平稳) 、“音清” (肺呼吸音清晰) 、“纳差” (没胃口, 吃不下东西) 等略带文言色彩的术语, 这对于没有接受过相应专门训练的留学生来说, 理解有一定难度。全英文医学留学生往往不能主动融入各科室的临床教学和工作, 而游移于快节奏的临床教学之外, 学习主体的能动性始终得不到很好的调动[8,9]。
2.4除了“医-医”沟通教育管理者可以把握之外, 留学生要想在“医-患”渠道做到沟通顺畅, 以及在医学书籍和文献学习中掌握医学知识, 需要在课外花大量工夫。无论是攻克语言关方面, 还是专业知识识记方面, 很大程度上依靠学生的自律, 可控性较差。“医-医”途径可控性强, 因此, 将“医-医”沟通效率作为提高留学生见习实习质量的抓手, 事半功倍。
3.强化病历教学的必要性
经过长期的教学调研和摸索, 本课题认为病历使用的文字体系基本涵盖了“医-医”渠道, 即临床各项工作运用的专业词汇。因此, 注重对医学留学生的以病历听说读写为主要内容的训练, 不失为克服以上难题的合适抓手, 将大大提高全英文医学留学生汉语医学汉语教学的针对性, 以及其临床见习实习的自主性, 更好地完成临床教学任务。此外, 强化病历教学有助于全面提高医学留学生教育质量, 还具有其他重要意义:
3.1在现代医院医疗活动和管理中, 病历作为医疗活动信息的主要载体, 不仅是医疗、教学、科研的第一手资料, 而且是综合评价医院质量、技术水平、管理水平的依据[10]。
3.2病历是对患者病情的简要提炼, 完整、规范和高质量的病历是将诊断学知识灵活运用于临床各科的结晶, 可以清晰地体现临床医师将疾病的一般规律运用到判断特定个体所患疾病的思维过程及临床思维方法[11]。临床思维方法的培养是医学留学生见习实习的最终目标和最高要求。
3.3病历语言体系具有专业性和简略性, 甚至略具文言特性的特征, 与临床医生工作中查房、交班、病例讨论等科室医疗活动的专业语言系统基本一致。因此, 行之有效地加强医学留学生病历听说读写的训练, 可使学生获得自主学习的能力, 不再单一被动依赖带教老师的面对面指导, 极大地拓展学习的时间和空间。此外, 有研究表明, 能用专业汉语词汇与带教老师交流的学生, 往往会获得老师更精确和有效的帮助, 带教老师主观感受上也更愿意指导他们进行临床技能操作和直接参与病人管理[12]。
3.4病历是医疗活动的有效证明和法律文案, 对培养医学留学生的职业自我保护意识和法制观念具有重要意义[13]。
我国教育部2007年印发的关于《来华留学生医学本科教育 (英语授课) 质量控制标准暂行规定》中的第六条明确指出:“医学本科毕业生能在上级医师指导下, 从事基本医疗实践, 并通过进一步接受职业教育, 成长为独立执业者。”我国对病历书写的一般要求:及时性、准确性、规范性, 对留学生职业意识的培养具有普遍教育意义。