间质干细胞范文（精选9篇）
间质干细胞 第1篇
体外成功分离培养BMSCs是实验研究和临床应用的重要前提。该实验应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs, 并观察其生物学特性及成骨和成脂的分化潜能, 为BMSCs的体内外研究应用奠定基础, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
4~6周龄SPF级SD大鼠, 雌雄不限, 体重100~150 g, 购自中山大学中山医学院实验动物中心。
1.2 实验试剂
L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国GIBCO BRL公司;胎牛血清 (FCS) 、胰蛋白酶均购自Hyclone公司;Vitamin C、地塞米松、牛胰岛素均购自Sigma公司;β-甘油磷酸钠购自Calbiochem公司。兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5购自BD phamingen公司。
1.3 大鼠BMSCs的体外分离、培养与纯化
取SPF级3~4周龄SD大鼠, 断颈处死, 75%酒精浸泡5 min。无菌条件下分离大鼠双侧股骨, 并彻底清除附着其上的肌肉组织, 去除两端骨骺, 用含10%胎牛血清的L-DMEM间质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔, 收集细胞, 1 100 r/min离心5 min, 弃去上清及脂肪层。以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶中, 置于培养箱中培养。培养48 h后首次换液, 以后每3 d换液1次, 每天观察细胞的形态及生长情况。
1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记
收集第3代细胞, 调整细胞密度为1.0×106个/m L, 装入1.5 m L的EP管中, 每管1 m L, 1100 r/min离心4 min, 弃上清。每管加入100μL PBS, 混匀, 分别加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠单克隆抗体1μL (0.5~1μg/106细胞) , 混匀。37℃避光孵育20 min后, 每管加入1 m L PBS, 1100 r/min离心4 min, 弃上清, 再重复洗2遍, 以除去未结合抗体。0.5 m L PBS重悬细胞, 流式细胞仪进行检测分析。同时每管样品设立同型阴性对照。
1.5 体外诱导大鼠BMSCs成骨和成脂分化
1.5.1 成脂分化及油红O染色鉴定
取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入含1 umol/L的地塞米松, 0.5 mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤, 10 mg/L的牛胰岛素, 100 mmol/L的消炎痛 (indomethncin) , 10%FCS的H-DMEM诱导3 d, 再用含10 mg/L的牛胰岛素, 10%FCS的H-DMEM处理1 d, 镜下观察细胞形态的变化和生长情况。成脂诱导后的细胞用PBS洗涤3次, 10%多聚甲醛固定10 min, 油红O染色5~10 min, 60%异丙醇稍洗去多余染液, 蒸馏水洗, Mayer氏苏木素浅染核, 1%盐酸水稍分化, 水漂洗10 min。于倒置相差显微镜下观察。
1.5.2 成骨分化及茜素红S染色
取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入成骨细胞诱导液 (含10~7 mol/L地塞米松, 10mmol/Lβ-甘油磷酸钠, 50 g/m LVitamin C) 2 m L, 置培养箱中培养。诱导分化18 d后, 吸去成骨细胞诱导液, 用PBS洗涤3次, 然后加入适量的茜素红-S染液染10~15 min, 显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 BMSCs的形态学观察
原代培养时, 骨髓细胞接种于培养瓶后, 细胞呈圆型, 悬浮于培养液中。培养24 h后即有细胞贴壁, 换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长, 第4~5 d可形成分散的细胞集落, 细胞形态不一, 梭形细胞为主, 见图1A。第8~9 d细胞呈集落生长, 细胞间相互紧密贴附生长, 沿胞体长轴有序排列, 呈螺旋状或漩涡状, 可达80%~90%融合, 见图1B。消化传代后, 传代细胞12 h完全贴壁生长, 3~4 d可传代1次。传代至第3代的细胞形态均一, 呈梭形生长, 见图1C。
A:原代培养第5 d的细胞B:原代培养第9 d的细胞C:传代培养至第3代的细胞
2.2 BMSCs表面标记物的表达
流式细胞仪检测结果显示, 培养的第3代大鼠BMSCs CD29、CD44表达阳性, 而CD45呈阴性, 见图2。
A:CD29流式检测结果B:CD44流式检测结果C:CD45流式检测结果
2.3 BMSCs成脂成骨诱导分化及鉴定
BMSCs加入脂肪诱导液诱导2周后, 细胞中有大小不等的脂肪滴出现, 细胞逐渐由原来的梭形变为圆形或多角形, 经油红O染色, 苏木素复染核, 镜下观察可见脂滴为橙红色, 胞核为蓝色, 见图3A。BMSCs经成骨诱导液诱导2周后, 细胞转变为多角形细胞, 呈多层重叠生长, 可观察到较大的细胞结节, 有明显的钙沉积, 茜素红S染色后镜下可见散在大量橘红色的钙结节, 为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物, 见图3B。
A:成脂油红O染色 (×200) B:成骨茜素红S染色 (×100)
3 讨论
骨髓间质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞, 是骨髓造血微环境的重要组成部分。BMSCs在全骨髓中比例很低, 只占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.01%[9]。目前已经建立了多种体外分离培养BMSCs的方法, 主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法, 不同的方法具有不同的优缺点[1,10]。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs的粘附特性, 是获得这种细胞的最简单方法。本实验采用的是全骨髓贴壁培养法, 用L-DMEM+10%FBS作为基本培养基, 通过反复、多次换液去除未贴壁的造血干细胞, 获得贴壁生长的BM-SCs, 通过传代进行纯化和扩增培养。研究显示, 体外培养的BMSCs, 在形态上呈纺锤形成纤维细胞状, 能贴壁生长, 呈螺旋状或漩涡状[11]。该研究也证实了上述观察结果。
BMSCs的多向分化潜能受到多种因素的影响, 研究表明, Micro RNA-9-1可增加BMSCs向神经细胞的分化比率[12], 熟地含药血清能够促进BMSCs向神经细胞的分化[13]。王贞等[14]研究发现, 人血小板裂解液可以促进BMSCs成骨分化, 抑制其成脂分化, 朱小虎等[15]证实硝酸甘油也可促进BMSCs向成骨分化。BM-SCs的疾病治疗方面也得到广泛的研究, 并取得较好的实验结果, BMSCs经BMP-2预诱导后移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死, 对心肌梗死再灌注损伤有一定治疗作用[16]。BMSCs联合脑源性神经营养因子用于大鼠脑出血的实验研究发现[17], 移植后可促进大鼠脑出血损伤部位结构和功能的修复。
间质干细胞 第2篇
Cajal间质细胞在胃肠运动中的作用
Cajal间质细胞(ICC)是肠神经系统中的一种与肠运动神经元及平滑肌密切相关的间质细胞,基于其形态学和组织学上与平滑肌和神经元的.相互关系,ICC具有某些功能:起搏胃肠平滑肌运动并传导肌电信号,调节神经递质.ICC生物学特征是表达c-kit基因产物(编码酪氨酸激酶受体的原癌基因Kit).平滑肌、肠神经系统和ICC共同形成复杂的胃肠运动控制系统;ICC缺失可能导致某些胃肠功能丧失,与一些胃肠疾病有关.
作 者：林琳 赵志泉 作者单位：南京医科大学第一附属医院消化科,江苏,南京,210029刊 名：国外医学(内科学分册)英文刊名：FOREIGN MEDICAL SCIENCES(SECTION OF INTERNAL MEDICINE)年，卷(期)：30(8)分类号：B329.2关键词：Cajal间质细胞 胃肠运动 慢波 神经传导
间质干细胞 第3篇
【关键词】 肝细胞生长因子；IV型胶原；纤维连接蛋白；α平滑肌肌动蛋白
结缔组织生长因子（CTGF）作为TGF－β的下游效应介质，在高糖血症 — 转化生长因子β（TGF-β）— CTGF —肾间质纤维化模式中起着重要的作用。而阻断CTGF导致的肾小管间质纤维化将有效延缓糖尿病肾病的发展。
晚近的研究表明[1]，肝细胞生长因子（HGF）在糖尿病肾病发展过程中存在着潜在的治疗作用。而目前，多数研究均着重于HGF阻断TGF-β所致的肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞纤维化，但对于CTGF在阻断上述过程中的作用并不明确。本实验先前的研究表明HGF对CTGF的表达有抑制作用，如能证明其对CTGF所致肾小管上皮细胞纤维化过程亦有阻断作用将进一步为HGF治疗糖尿病肾病提供有效证据。
本试验将通过观测rhHGF对CTGF刺激下肾小管上皮间质纤维化的影响来进一步探讨HGF在此过程中的具体作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞培养试剂 HKC细胞株，重组人HGF（rhHGF，Peprotech公司，美国）和重组人CTGF（rhCTGF，Peprotech公司，美国）。
1.1.2 RT-PCR试剂 Trizol （Gibco，美国），逆转录试剂盒（Promega，美国），PCR 试剂盒（Promega，美国），聚合酶链反应引物（英骏生物技术，中国）。
1.1.3 Western印迹法试剂 分光光度仪（Pharmacia Biotech，美国），垂直电泳仪（BioLabs，美国），PVDF印迹膜（Millipore，美国），ECL发光反应系统（Cell Signaling，美国），鼠抗人α-SMA单克隆抗体（Santa Cruz，美国），鼠抗人GAPDH单克隆抗体（Santa Cruz，美国），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体（Santa Cruz，美国）。
1.2 方法
1.2.1 人肾小管上皮细胞株（HKC）培养：HKC用含10%FCS的DMEM/F12培养液传代培养，培养条件为37℃，5%CO2。 0.25%胰蛋白酶消化细胞后，以1×106/瓶的密度接种于25ml培养瓶。用10%FCS- DMEM/F12培养细胞6小时后，以无血清培养基培养12h，使细胞同步于静止期。
HKC孵育18h后，吸弃培养液，分三组：① 换以新鲜DMEM/F12营养液（葡萄糖终浓度为5.5mmol/L），继续培养78小时；② 换以含CTGF营养液，终浓度为5.0ng/ml，继续培养78小时。③ 换以含CTGF营养液，终浓度为5.0ng/ml，同时加入rhHGF终浓度浓度分别为50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml，继续培养78小时。
1.2.2 COLA41、FN、α-SMA、CTGF 及TGF－β mRNA检测RT-PCR 按Trizol说明书在培养瓶提取细胞RNA，定量后取总RNA2ug作逆转录，步骤参照试剂盒说明书。取1ul逆转录产物为模板，以50ul反应体系进行PCR扩增。取PCR产物5ul在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果并照相，用计算机图像处理系统处理，以吸光度代表表达量，计算上述产物的相对表达量（即各基因条带吸光度/β-actin基因条带吸光度）。至少重复6次独立的RT-PCR全过程。
Western印迹 ① SDS-PAGE：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%的垂直电泳。样品中加入上样缓冲液，加热变性，恒压120V，电泳7～8小时。② 转膜：采用电转移装置，将电泳后凝胶上的血清成分转移到硝酸纤维素膜上，恒流100A，8小时。③ 蛋白印迹反应：杂交反应液置4℃，反应12小时。去离子水漂洗膜后，反贴法覆于混合液滴上孵育5分钟，在暗室内胶片感光60秒，显影1.5分钟，定影2分钟，清水冲净晾干，结果用数码成像系统扫描，测定光密度值并计算α-SMA与GAPDH光密度比值。
1.2.3 统计学处理 数据用均数±标准差（χ±s）表示。组间差异采用方差分析，由SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 rhHGF对CTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表达的影响（采用半定量RT－PCR法）
如图1所示：rhHGF浓度分别为25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，与单纯CTGF组比较，FN和α-SMA表达均明显减少，且其表达量呈剂量依赖性。（P < 0.01）
表1：rhHGF对rhCTGF刺激下HKC FN和α-SMA基因表达的影响
与rhCTGF组，* < 0.01；与rhCTGF+小剂量 rhHGF组比较，**P < 0.05
2.2 rhHGF对rhCTGF刺激下HKC α-SMA 蛋白表达的影响 如图2所示：rhHGF浓度分别为25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml，与单纯CTGF组比较，α-SMA蛋白表达量明显减少，且其表达量呈剂量依赖性。
图2：rhHGF对rhCTGF刺激下α-SMA蛋白表达的影响
与对照组比较，*P < 0.01
3 讨论
CTGF属于CCN（包括Cyr61/Cef10, NOV和ELM-1）家族，富含半胱氨酸，为36－38kDa的单体分泌蛋白，其编码基因位于染色体6q23。血清生长因子、TGF-β1、骨形成蛋白、糖皮质激素、纤维蛋白酶等均可激活其表达[2]。目前，对CTGF的生理功能尚未完全清楚[3]，晚近的研究提示[4]，CTGF作为TGF－β的下游效应介质，可以介导TGF－β的负面效应，被认为糖尿病肾病发生与进展的关键因子。
本研究发现，加入rhHGF后，CTGF刺激下FN、α-SMA表达均明显下调，提示HGF可抑制CTGF所致HKC纤维化；同时，不同剂量HGF对纤维化因子表达量的影响，反映了HGF抑制HKC纤维化过程是剂量依赖性的；而rhHGF可在不影响CTGF表达的情况下，抑制后者所致纤维化，表明HGF亦可能通过阻断CTGF的致纤维化途径而发挥作用，但具体机制仍不明确；对比本实验第二部分结果，在高糖刺激下，rhHGF下调非CTGF所致的COL4A1表达，提示HGF抑制HKC纤维化可能还通过CTGF以外的其它途径。有研究表明[5]，HGF可通过激活细胞外丝裂原活化蛋白激酶（p42/44MAPK）通路，削弱TGF-β细胞内信号传导蛋白Smad2/3核转位，来阻断纤维化过程。
综上所述，本研究认为，HGF可抑制CTGF所致的肾小管间质纤维化，表明其可通过阻断CTGF的下游途径发挥其抗肾小管间质纤维化的作用，本研究先前实验提示，HGF的抗肾小管间质纤维化作用还可能通过CTGF以外的其它途径。因此，需进一步研究了解HGF阻断DN发展的具体机制，从而充分认识HGF在DN治疗中的价值。
参考文献
[1]Junwei Y, Chunsun D. Hepatocyte growth factor suppresses renal interstitial myofibroblast actovation and intercepts smad signal transduction [J]. Am J Pathol 2003; 163(2): 621-632.
[2]Inoue T, Okada H, Kobayashi T, et al. TGF-beta1 and HGF coordinately facilitate collagen turnover in subepithelial mesenchyme [J]. Biochem Biophys Res Commun 2002; 297(2): 155-160.
[3]Junwei Y, Youhua L. Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis [J]. J Am Soc Nephrol, 2002; 13: 96-107.
卵巢支持-间质细胞肿瘤的临床分析 第4篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究收集我院2002年至2012年间接收治疗的卵巢恶性肿瘤、交界性肿瘤患者970例, 其中支持-间质细胞肿瘤患者16例, 患者年龄在19～67岁之间, 平均年龄为38岁, 7例患者已经生育, 9例患者未生育, 3例患者为停经患者, 其他患者闭经或月经量减少。16例患者发病时间在5年以上的患者3例, 3年以上的患者5例, 其他患者均在3年以内。通过临床检查, 未生育的9例患者年龄多在30岁以下, 其查血睾酮值在14～44ng/L, 远高于正常指标, 2例患者体毛较多, 阴毛非常浓密, 2例患者的唇须较浓, 可视患者阴蒂增加。7例患者在临床检测期间发现盆腔肿块, 绝境后患者的阴道出血患者在治疗前没有测定血睾酮的水平。13例患者经过彩超检测, 发现患者的患侧混合性肿块, 血液流动丰富, 1例患者检测发现患侧囊性肿块。本组患者中右侧卵巢肿块患者9例, 左侧卵巢肿块7例, 患者的肿瘤在3.5cm×3.0cm×3.0cm～20cm之间, 患者的肿瘤包膜均较为完整, 均属于Ia期。
1.2 治疗方法
本组16例患者在治疗时均采用手术治疗的方法, 按照患者的生育及病症情况, 在患者自愿的情况下, 进行手术治疗, 其中5例患者行全子宫+双侧附件切除手术;9例未生育的患者均进行侧附件切除手术, 2例患者行全子宫+双侧附件+大网膜切除+盆腔淋巴结清扫术治疗, 手术操作按照临床操作标准进行[2]。按照患者的临床分化情况, 16例患者当中高度分化患者2例, 高-中度分化1例, 中度分化的患者为9例, 其中3例患者含有异源性成分, 低度分化患者3例, 中-低度分化患者1例。
2 结果
16例患者的手术均较为顺利, 完成手术治疗后, 未生育患者行患侧附件切除后患者的预警活肤正常, 术后血睾酮检测结果在正常范围之内, 手术完成后1例患者发生不孕情况, 经检查为输卵管梗阻, 手术治疗后患者恢复正常, 在术后第3年妊娠。其他患者术后情况较为稳定, 临床没有发生严重并发症情况, 患者术后存活质量较好, 均存活至今, 16例患者均得到有效回访, 患者的详细治疗及治疗结果见表1。
3 讨论
卵巢支持-间质细胞肿瘤在临床上的发病概率较低, 文献记载其发病率子啊0.2%～1.0%, 患者发生病症之后, 会出现明显的卵巢含睾丸母细胞瘤, 发生病症之后, 患者会出现闭经或是月经减少等情况, 多发生在没有停经妇女当中[3]。在本次研究中, 16例患者的平均年龄为38岁, 均较为年轻, 其中9例患者未生育。按照对该病症的分类, 包括高分化、中度分化、低分化等情况, 同时患者可能伴随有异源性的成分。
3.1 临床表现
卵巢支持-间质细胞肿瘤可能会在临床上表现出雌性激素过度的指征, 出现早熟等症状, 在绝经之后患者还会发生阴道出血情况, 中、低度患者会表现出男性化的特征, 如患者的唇须增加, 体毛较浓等, 在性成熟期之前发病的患者, 则会发生异性性早熟, 性成熟后会发生月经稀少甚至闭经等情况, 身体表现为乳房萎缩, 声音低哑, 其喉结突出、阴蒂肥大症状, 临床检测可以发现患者的体内激素、血清中的睾酮和雄烯二酮升高[4]。在本次16例患者的临床资料整理中, 同样也体现出了患者的这方面指征, 部分患者体毛较多, 大部分患者发生月经减少、闭经等症状, 术前检测患者睾酮明显升高, 通过手术切除之后之后, 患者的血、睾酮恢复症状, 患者的月经情况恢复正常。
根据文献记载, 在高中分化患者当中, 患者的肿瘤细胞不但包含有睾酮, 还存在着雌二醇, 少数患者具有雌激素分泌的表现, 如子宫异常出血等症状, 如果对患者进行检查, 可能会发现患者具有子宫内膜息肉, 患者的囊性发生增生。本组患者中绝经后阴道出血患者通过子宫内膜病例检查, 发现1例出现增生期改变, 1例具有简单型的增生过长。本组患者中5例患者没有内分泌症状 (31.25%) , 与文献记载10%～25%患者不符合。
3.2 临床治疗
在临床上, 高分化的患者多为雌性激素过剩, 这部分患者在临床可划分为良性, 中、低分化的患者为恶性, 临床多需要对患者进行手术切除治疗, 而在实际情况中, 部分患者可能存在着生育需求, 因此, 治疗期间可根据患者的实际情况, 在不影响治疗效果的前提下, 尽可能保留患者的生育功能。根据陈忠年等[5]文献研究, 认为高分化患者在临床i型那个患侧附件切除术可以有效治疗, 但为保证患者疗效, 临床已经生育的患者, 可进行全子宫切除及双附件切除治疗, 针对年轻还没有生育的患者, 需要仔细检查, 临床为I期的患者, 可以进行患侧附件切除, 但在术后需要进行定期检查, 观察肿瘤情况的复发或转移情况。如果患者发生肿瘤扩散、转移或复发, 需要进行肿瘤细胞减灭术, 并在术后进行放化疗治疗[6]。
本组患者治疗时, 高中分化患者均已经生育, 临床与患者及家属协商后, 进行了全子宫和双侧附件切除手术治疗, 9例中度分化的未生育患者, 进行患侧附件切除手术治疗, 术后进行充分的化疗治疗, 并定期进行临床检查, 3例低、中低度分化的患者, 进行全子宫+双附件+大网膜切除+盆腔淋巴清扫术治疗, 主要是由于患者的异源性成分较大, 其性质属于临床恶性肿瘤, 为了确保临床治疗的效果, 对患者进行手术范围扩大的方案, 尽可能的保证患者的预后效果[7]。
16例患者均为Ia期, 患者通过回访调查, 目前均存活, 患者存活时间在10年的具有7例, 根据本次研究, 临床支持-间质细胞肿瘤患者的复发情况没有发生, 但并不代表所有患者均在治疗完成后不出现复发或转移情况, 因此术后建议增加化疗治疗, 化疗方案可根据患者实际情况进行安排。
3.3 预后
根据文献研究, 高分化患者的预后较好, 而中低分化的患者存在肿瘤复发、转移、死亡的情况较多, 出现异源性成分肿瘤的患者预后较好, 本次研究Ia期患者病程在5年以上患者也取得了有效的疗效, 存活情况较好, 可能在患者手术完成后进行化疗在一定程度上提高了患者的临床疗效。
摘要：目的 讨论临床卵巢支持-间质细胞肿瘤的表现, 治疗及预后。方法 回顾分析我院近10年内确诊卵巢支持-间质细胞肿瘤的16例患者的临床资料, 对患者的临床表现、治疗方法、临床效果及预后进行统计分析。结果 16例患者在临床中均发生月经停止、月经量减少或是停经后阴道出血, 7例患者发现盆腔肿块。患者通过全子宫+双侧附件切除术或行全子宫+双侧附件+大网膜切除+盆腔淋巴结清扫术治疗, 16例患者治疗效果明显, 均存活至今, 临床检测没有发现患者肿瘤复发或转移情况。结论 卵巢支持-间质细胞肿瘤的治疗还是以手术治疗为主, 临床效果显著, 手术可根据患者的实际病灶情况及患者的分期、生育情况进行方案治疗, 高分化的病症后期预后效果较为理想。
关键词：卵巢支持-兼职细胞肿瘤,卵巢肿瘤,手术治疗,临床分析
参考文献
[1]曹泽毅.中华妇产科学[M].北京:人民卫生出版社, 2005:1924-19261.
[2]林崧.妇产科病理学[M].天津:天津科学技术出版社, 1986:471-4751.
[3]丰有吉, 沈铿.妇产科学[M].北京:人民卫生出版社, 2005:341-3431.
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[5]陈忠年, 杜心谷, 刘伯宁.妇产科病理学[M].上海:上海医科大学出版社, 1998:224-2261.
[6]Young RH, Scully RE.Ovarian Sertol-iLeydig cell tum ors w itharetiform pattern:a problem in histopathologic diagnosis:a reportof 25 cases[J].Am J Surg Pathol, 1983, 7 (19) :7551.
间质干细胞 第5篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
新生(7天)新西兰大白兔两只,雌雄不限。
1.1.2 实验仪器及试剂
培养皿、离心管、DMEM培养基、青-链霉素溶液、胰蛋白酶、胎牛血清、I型胶原酶、小鼠抗兔I型胶原蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、DAB显色剂、倒置显微镜、离心机、二氧化碳培养箱,10mL离心采血管等。
1.2 方法
1.2.1 兔BMSCs的分离培养
1.2.1.1 原代细胞的分离培养
将出生7天的新西兰大白兔脱颈处死,75%乙醇浸泡10min,在无菌操作下取双侧股骨和胫骨,去除肌肉,骨膜,剪去股骺,用注射器抽取完全培养基(含13%胎牛血清的DMEM)冲出骨髓,反复吹打均匀制成单细胞悬液,200目筛网过滤,分装于2个25mL的培养瓶中,置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下静置培养4d,第5天初换液,可以看到细胞贴壁生长,呈梭形,经测定为骨髓间质干细胞。
1.2.1.2 细胞的传代扩增与培养
原代细胞培养,贴壁瓶底约80%-90%,(约为细胞培养的10~14d)用0.25%胰蛋白酶含(0.01%EDTA)2-3mL消化。镜下观察,待细胞趋向收缩时,吸去胰蛋白酶,加入10%FBS的DMEM培养基终止消化,然后加入13%FBS的DMEM培养基轻轻吹打,使细胞脱壁,检测并调整细胞密度,按l:2传代培养。传代后培养瓶放回培养箱静置过夜,观察贴壁情况。以后各代细胞生长至贴壁80-90%时,以上述方法,按1:2传代培养。用倒置相差显微镜观察各代细胞形态变化和生长状况。
1.2.1.3 PRF膜的制取
取五只健康成年新西兰大白兔,抽取耳缘静脉血,分置于5个真空离心采血管中,2400转/分,低速离心10min,静止5min。即可得到PRF膜。采血容量分别为10×3、20×3、30×3、40×3、50×3(mL),根据10mL静脉血离心1mLPRF膜计算,实验用PRF膜剂量分别为1、2、3、4、5mL。
1.2.1.4 BMSCs的诱导分化
将MSCS细胞按104/孔接种于4个六孔细胞培养板中,给予13%FBS的DMEM培养液培养24h更换培养液。设无PRF组(MSCS组)、实验组(1mLPRF、2mLPRF、3mLPRF、4mLPRF、5mLPRF),阳性对照组(BMP-2终浓度为100ng)七种培养条件,每种培养条件各有三个孔。我们将此培养基称为实验用培养基。所有培养液每2天1次。在第1、3、5天共三个时间段进行观察。
1.3 检测指标
1.3.1 MTT
取第三代对数生长期PRF膜上成长的骨髓基质干细胞,消化、计数,分别调整密度为5×104/mL按照3:7的比例接种于3块96孔培养板,设置PRF的剂量为1、2、3、4、5mL的浓度组,以及单独的骨髓基质干细胞作为阴性对照组和以BMP-2(终浓度为100ng)为阳性对照组,每个浓度组及对照组分别设立3个复孔,每孔加满150uL,边缘24孔用PSB液填充。置于37℃,5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养过夜。3块96孔板分别培养1d、3d、5d 后,依次取出,于相应培养板的各小孔加人5mg/mL MTT液0.02mL,送5% CO2孵育箱内培养5h,取出培养板后吸取每孔内的培养液,仅留下极少量的残液,加人0.2mLDMSO(二甲基亚矾)振荡10min。而后用MTT测定光密度,检测波长为492nm,参考波长为620nm。
由SPSS软件进行统计处理得出结论,单独骨髓间质干细胞与BMP-2的浓度为0ng/mL的OD值,P<0.05,有统计学意义。PRF膜作用后的混合培养组,其OD值跟剂量有关,随着PRF剂量的增大,OD值增高,由此可见PRF膜与骨髓间质干细胞共同作用,成骨细胞分化过程上有协同促进作用。
1.3.2 PNPP法测定细胞内ALP活性
按上述方法培养细胞,以2.5×105接种于96孔板,37°C培养24h后取出,加入不同浓度的PRF膜,分别在第1、3、5天进行ALP活性检测。弃去上清液,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗3次,每孔加入0.1%TritonX-100,37°C作用30min,用BCA法测定蛋白浓度,加入0.2 mol/L的NaOH 50μL,振荡均匀,酶标仪405 nm波长检测吸光度值D450。
统计学分析 ALP活性数据采用undefined表示,两组之间比较采用配对设计t检验,采用SPSS16.0软件进行统计处理,以a=0.05为检验标准,P<0.05差异具有统计学意义。
1.3.3 免疫组化细胞检测实验
各组细胞爬片经多聚甲醛固定20min后,SP法行Ⅰ型胶原蛋白免疫细胞化学染色。对照组和各实验组细胞均可见棕褐色颗粒沉着,呈阳性反应。阳性颗粒出现在细胞浆、细胞膜和细胞间基质,提示细胞处于Ⅰ型胶原合成、分泌的不同时期。
2 结果
2.1 原代培养细胞培养
倒置显微镜下观察原代培养的骨髓间质干细胞,24h后出现贴壁细胞呈长梭形。
2.2 不同剂量PRF膜BMSCS的增值结果
在含有培养液的培养条件下,我们观察不同剂量的PRF膜下,乳兔BMSCS的增值情况,MTT检测表明,PRF膜的剂量越高,细胞增殖越快,反映到图上,从1mLPRF的剂量开始,到实验显示的5mLPRF,细胞增殖逐渐呈现上升趋势,到PRF剂量为4,5mL时,与BMP-2组差异不大。
2.3 不同血清浓度活性ALP结果
在含有培养液的培养条件下,我们观察不同PRF膜剂量下乳兔BMSCS的ALP结果。在不同PRF剂量的培养条件下,测定D450值,随着PRF膜剂量的增大,ALP活性逐渐增强。发现BMP-2组在第4,5天接近于PRF剂量为5mL的实验组。
2.4 Ⅰ型胶原细胞染色实验结果
对照组和各实验组细胞均可见棕褐色颗粒沉着,呈阳性反应。阳性颗粒出现在细胞浆、细胞膜和细胞间基质,提示细胞处于Ⅰ型胶原合成、分泌的不同时期。显微镜下观察,实验组细胞趋于三角形,多角形,立方形等类成骨细胞形态。
3 讨论
富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)是继富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)[1]之后的第2代血小板浓缩品,2000年由法国人CHOUK-ROUN[2]首先成功提取。因其完全取自于自体血,又没有加入任何的生物制剂,消除了PRP中牛凝血酶带来的潜在危险,2004年CHOUKROUN[3]就PRF联合异种冻干骨应用于上颌窦底提升术进行了组织学的相关研究,这是首次将PRF应用于口腔医学研究领域中,并取得了良好的预期效果,随后PRF技术成为了口腔种植研究领域的新热点之一,已逐渐应用于实验和临床研究中。PRF可被认为是一种自体移植物[4],其表现形式为血小板凝胶。天然的血凝块中的纤维蛋白结构为立体网状结构,即三分子结构,相对疏松多孔[5]。而PRF其内的纤维蛋白结构类似于天然形成的血凝块,也为三分子结构,呈立体网状,形成的凝胶较为疏松,具有较大的孔隙及良好的弹性。纤维蛋白可以与生长因子间产生化学键结合,使生长因子相对稳定的存储于PRF凝胶内,并发挥相互的协同作用[6],这也大大减少了生长因子的流失,加强其生物学功能;其网状结构能够有效地捕获与组织修复相关的干细胞,加快创伤愈合[7];纤维蛋白还易于滞纳自体血中的粘多糖,而粘多糖具有促进细胞迁移和组织愈合的功能[8];此外,纤维蛋白能形成类似于凝血块的网架结构,由于其内在的纤维蛋白网架结构更合理、有序、致密,与生长因子紧密结合,缓慢释放,使得PRF具有促进骨再生修复的能力。由于长期牙齿缺失或牙周炎,根尖周疾病的影响,常导致牙槽嵴可用骨量不足,给牙种植体带来困难,是种植手术无法进行或种植失败的主要原因。PRF在促成骨和加速骨折愈合等方面在一些文献中得到证实[9],但在分子水平探讨PRF的促成骨分化机制尚存在一些争议,实验室数据表明,骨髓间质干细胞在PRF膜上分化成骨细胞的结果比较不放置PRF膜,其效果更为显著,对细胞进行定量和定性的分析,ALP是成骨细胞分化成熟的标志性酶之一,在成骨过程中ALP可以水解磷酸酯,为羟基磷灰石的沉积提供必要的磷酸,其活性高低一定程度上可以反映出细胞的成骨分化能力[10]。在体外,由于BMSCs是一种多潜能干细胞,具有很强的增殖和自我更新能力,并具有多向分化潜能[11]。但是BMSCS具有弱自动分化潜能,其分化需要适宜的条件和诱导剂,目前确定的体外诱导剂是终浓度为100ng的BMP-2。我们在研究PRF膜对BMSCS向成骨细胞分化的作用时,发现随着PRF膜剂量的增加,BMSCS成骨细胞分化趋向显著,在PRF膜剂量4mL,5mL时,接近阳性对照BMP-2组。BMP-2是已上市的具有促成骨作用的药物,而我们的实验结果同样证实了其促分化作用,从而间接证明了实验体系的安全性和可靠性。从结果上看,这与以往OGP对体外培养细胞的促分化作用不同[10,12,13,14]。MTT测定细胞增殖的结果表明,PRF膜组的细胞增殖显著增加,Ⅰ型胶原细胞染色的结果说明,在分化的细胞中,Ⅰ型胶原表达明显,具有显著的成骨细胞特性。
综上所述,采用模拟成骨微环境来诱导MSCS的增殖和称骨分化可能是一种有效的诱导方法,本实验试图用富血小板纤维蛋白提供的成骨微环境,通过共培养方法诱导MSCS在体外形成具有成骨细胞,为进一步的研究奠定基础。
摘要：目的 研究富血小板纤维蛋白在诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞转化的作用。方法 取7天新西兰大白兔股骨,分离骨髓间质干细胞进行体外培养,在各自的培养条件下分为三组:实验组(不同剂量的PRF组)、空白对照组(MSCS组)和阳性对照组(BMP-2组)。三组细胞的比较采用MTT测定细胞增值率、PNPP法测定碱性磷酸酶的表达、免疫组化标记Ⅰ型胶原蛋白的表达、检测细胞为成骨细胞。结果 细胞形态学观察,MSCS分化后,细胞形态从长梭形变成三角形,多角形,立方形;MTT测定细胞增殖显示,随着PRF膜剂量的增加,细胞增殖数量增加,PRF剂量为4,5mL时,与BMP-2组差别不大;ALP活性结果显示,MSCS分化后,ALP活性远高于MSCS细胞。两者差异具有显著统计学意义(t=24.608,p=0.000);免疫组化标记Ⅰ型胶原结果显示,PRF组分化后的MSCSⅠ型胶原表达显著。结论 富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞,分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性,可以作为自体材料应用于口腔种植学领域里骨缺的修复。
间质干细胞 第6篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
本院2000年1月-2011年8月收治了15例巨细胞病毒感染致间质性肺炎患者, 其中男10例, 女5例, 年龄18~49岁, 平均年龄34.1岁;体征表现为呼吸急促、面色发绀、双肺中下部可闻及Velcro啰音 (连续、高调的爆裂音) , X线胸片提示有杵状指, 其中Velcro啰音最具特征性。15例患者全部接受X线胸片、动脉血气等检查。
1.2 护理措施
1.2.1 对患者采用氧疗护理
本组15例间质性肺病患者伴有低氧血症, 笔者分别给予及时吸氧护理, 并严密观察氧疗变化。其中, 采用鼻塞、面罩方式吸氧者为10例, 吸氧前严格检查鼻塞和面罩是否固定良好, 用氧管道是否畅通;利用BiPAP呼吸机配合采用氧袋用氧患者为5例。吸氧后15例患者的低氧血症得到缓解, 逐渐趋于正常。在患者吸氧过程中, 护理人员要全面观察患者面色、精神状态、呼吸状况和紫绀变化, 若发现异常情况向主治医生报告, 采取积极有效救护措施[2]。
1.2.2 指导患者有效排痰, 维护患者呼吸道畅通
间质性肺炎患者皆伴有呼吸困难, 咽喉部常滞留有黏痰, 很难排出, 加重呼吸窘迫, 不利于病情好转。因此, 护理人员要及时指导患者进行有效排痰, 护士轻拍患者的后背, 让患者缩紧嘴唇呼吸进行咳痰;对身体虚弱的患者, 采用吸痰器进行人工吸痰, 使患者的呼吸道保持畅通, 避免因呼吸道堵塞而窒息死亡。同时, 要给患者补加湿化水, 防止呼吸道变形而出现堵塞状态。必要时可以采用呼吸机进行通过气, 缓解患者的呼吸窘迫。
1.2.3 合理用药护理措施
首先, 为减少患者肺间质渗出, 使患者呼吸通气窘迫得到改善, 采用大剂量糖皮质激素进行冲击疗法, 如甲基强的松龙静脉滴注, 其用量为40~120 mg, 3~4次/d。护理人员要全天候监测患者肺间质渗出量, 查验血糖检测结果, 并对患者的呕吐物、大小便进行认真观察, 做好相关记录。其次, 在对患者采用三联抗病毒药物进行静脉滴注时, 严格控制用药量, 如国产更昔洛韦1~2次/d, 250 mg/次;采用膦甲酸钠静脉滴注时用量为2次/d, 3.0 g/次;静滴时给药要缓慢, 每次静滴时间控制在1 h以上, 并且两次静滴时间间隔要超过4 h以上, 这样能够避免药物对患者肝肾功能造成损害, 导致体内电解质不平衡, 局部组织受到刺激。
1.2.4 做好患者心理护理, 合理营养
患者对自身病情皆伴有紧张、恐惧感, 甚至出现抑郁症或死亡感, 情绪非常不稳定。护理人员给予体贴入微的关心和护理, 叮嘱患者家属隔时探望, 及时告知病情好转指标, 安慰患者坚定信心战胜疾病, 使患者的心理压力得到缓解, 可以积极配合医生治疗和接受护士的护理措施。同时, 笔者给患者配备流质的富含维生素、高蛋白、少纤维素饮食, 禁食辛辣刺激性食物, 保证患者机体营养供给, 增强抗病能力。
2 结果
9例患者肺间质性病变得到控制, 低氧血症得到纠正, 呼吸平稳, 占60%;2例患者因居住偏远地区没有接受及时有效救护, 病情恶化, 来院第2天病亡;另4例患者入院接受治疗1周内因呼吸严重衰竭救护无效而死亡, 死亡率达40%。
3 讨论
肾移植术后巨细胞病毒 (CMV) 感染非常容易导致患者发生间质性肺炎, 感染率高达60%~80%, 患者全身会出现非特异性的发热、关节疼痛、不舒服等临床症状, 所产生肺部间质性肺炎患者死亡率非常高, 达30%以上, 救护非常困难, 致使患者机体诸多器官受累, 呼吸困难, 危及生命安全[3]。因此, 一旦发病, 要及时送医院进行有效救护, 其临床意义非常重要。
本次对15例来院救治的巨细胞病毒感染致间质性肺炎患者的抢救、诊疗、护理上都采取了最有效的救护措施, 进行早期细心观察, 对患者表现的干咳、身温烧热、呼吸窘迫、胸闷气短等临床症状做详细记录;同时, 对患者24 h内血尿化验结果进行密切观测, 记录患者水、电解质及酸碱平衡状况;对患者的呕血的有无、大便色黑、腹部痛胀等临床症状要严密观察, 并及时向主治医生报告危险病情, 采取果断救护措施。2例患者因居住偏远而没有及时就医, 延误病情, 最终死亡;4例患者接受医院救护1周后, 呼吸严重衰竭死亡, 这充分证实了巨细胞病毒感染的危害性巨大, 患者病死率极高。9例患者通过有效吸氧护理、及时清痰处理、合理用药和科学配餐营养支持, 患者的低血氧症渐进恢复正常, 呼吸变得通畅平稳, 机体水、电解质和酸碱平衡得到控制, 病情逐渐好转, 给患者和家属带来希望。在临床护理过程中, 笔者认真操作, 对吸氧者严格检查鼻塞、面罩, 确保良好固定;采用药物护理时, 严格控制给药量, 静脉滴注时速度缓慢, 动作轻缓, 避免患者用药过量过速而产生副作用, 有利机体正常代谢[4], 这对保证患者有效救护提供有力帮助, 从而使大多数患者病情得到控制, 脱离生命危险。
综上所述, 对于术后患者产生的巨细胞病毒感染致间质性肺炎, 要做到早预防、早发现、及时就医诊治, 才能早日脱离生命危险, 降低死亡率。
摘要：目的:探讨巨细胞病毒感染致间质性肺炎的临床观察与护理措施。方法:2000年1月-2011年8月本院对术后巨细胞病毒感染致间质性肺炎的15例患者进行临床观察, 并根据其表现给予相关护理措施。结果:死亡6例, 另9例通过有效护理控制住病情发展。结论:对术后巨细胞病毒感染致间质性肺炎患者给予密切观察和护理, 能够降低病亡率。
关键词：间质性肺炎,护理,巨细胞病毒
参考文献
[1]曹彬, 袁远, 刘世超.巨细胞病毒感染致亚急性重型肝炎及间质性肺炎一例[J].肝脏, 2008, 8 (1) :22-22.
[2]李明, 李明霞.面罩压力支持辅助通气对COPD稳定期患者的康复治疗作用[J].四川医学, 2000, 21 (2) :1093-1094.
[3]谢万灼.骨髓移植后巨细胞病毒感染的防治研究[J].国外医学:输血与血液学分册, 2001, 24 (1) :69-71.
间质干细胞 第7篇
1 材料与方法
1.1 标本制备
标本来源于7例膀胱癌患者全膀胱切除手术取下的非癌变正常膀胱全层组织(经病理活组织检查无膀胱病变),OCT包埋,恒冷切片机制作冰冻切片(厚度10μm),粘于多聚赖氨酸处理后的载玻片上,-80℃冰箱保存备用。
1.2 主要试剂与仪器
第一种I抗(兔抗人CD117多克隆抗体)购于Abcam公司,第一种Ⅱ抗(FITC异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔抗体)购于Santa cruz公司,第二种I抗(小鼠抗人NOS-1单克隆抗体)购于Santa cruz公司,第二种Ⅱ抗(TRITC四甲基异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠抗体)购于Santa cruz公司,磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清白蛋白(BSA)均购于上海生工公司,恒冷冰冻切片机(型号Leica cm3050s)及激光共聚焦显微镜(型号LSM 510 META,ZEISS)均由石河子大学医学院地方病与高发病实验室提供。
1.3 试验方法
冰冻切片取出后风干,100%冰丙酮液室温下(25℃)固定10 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min×3次,吸水纸拭去多余液体。免疫荧光染色:组织切片首先滴加1%胎牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭30 min,弃去BSA,滴加经0.01 mol/L的PBS液稀释的两种I抗的混合液(100μL,1∶50)置入湿盒内4℃冰箱孵育过夜。次日取出湿盒(此后各步操作均需避光),组织切片用0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次,滴加经0.01 mol/L的PBS稀释的两种Ⅱ抗的混合液(100μL,1∶100),室温下湿盒内避光孵育60 min,0.01 mol/LPBS液漂洗5 min×2次,双蒸水漂洗5 min×2次,吸水纸拭去多余液体,50%缓冲丙三醇封片剂封片,激光共聚焦显微镜下观察。
1.4 统计学分析
随机取3张冰冻切片,每张切片镜下随机取5个视野观察并计数CD117阳性细胞数及NOS-1阳性细胞数(由同一技术人员计数),所有数据录入SPSS 17.0统计软件分析,检验水准α=0.05,通过Kruskal-Willis H检验,得出CD117阳性细胞数在膀胱肌层的平均秩次为210.37,黏膜下层的平均秩次为171.19,黏膜层的平均秩次为92.44,并进行两两比较,发现膀胱肌层ICCs最多,黏膜下层次之,黏膜层罕见,P<0.05,差异有统计学意义;同样方法得出NOS-1阳性细胞数在肌层的平均秩次为231.45,黏膜下层的平均秩次为18 476,黏膜层的平均秩次为57.80,并进行两两比较,发现NOS-1阳性细胞数在膀胱肌层多于黏膜下层及黏膜层,膀胱黏膜层最少,P<0.05,差异有统计学意义。
2 试验结果
2.1 ICCs在膀胱组织内的分布
经FITC染色,激光共聚焦显微镜下可观察到膀胱ICCs为双极梭形细胞,胞体呈卵圆形,两级可见2个细突起,细胞膜及突起呈绿色荧光,其形态与豚鼠膀胱内ICCs类似,大多分布于肌层及黏膜下层,平滑肌肌束外围和肌内的组织间隙,膀胱顶多于其他部位,ICCs的突起连结交织形成网络。(见附图A)
2.2 NOS-1阳性细胞在膀胱组织内的分布
经TRITC染色,激光共聚焦显微镜下可见细胞浆呈红色荧光的NOS-1阳性神经元细胞成簇密集分布于膀胱肌间神经丛和肌内,并形成神经元细胞网络,轮廓较清晰,多数为DogielⅠ型神经元,胞体多为圆形和卵圆形,部分为三角形及不规则形。(见附图B)
2.3 ICCs和NOS-1细胞免疫荧光双标记染色显示
经双重染色显示细胞浆呈红色荧光的NOS-1神经元细胞(阳性),胞膜呈绿色的ICCs同时可表达NOS-1,故被染成棕黄色(阳性),CD117免疫荧光和NOS-1免疫荧光双重染色未见两种细胞有明显共表达,但发现NOS-1阳性神经元细胞多分布在ICC s及突起的周围。(见附图C)。
A:CD117免疫荧光染色观察到胞膜呈绿色的ICCs(箭头示)在膀胱组织内的分布(×200);B:NOS-1免疫荧光染色观察到的胞浆呈红色的NOS-1阳性细胞(箭头示)(×200);C:免疫荧光双重染色观察到红色的NOS-1阳性细胞(圯箭头示)和棕黄色的ICCs(→示),且NOS-1阳性神经元细胞多在ICCs附近(×200)
3 讨论
最近研究证明,ICCs是胃肠道周期性运动的基础,它具有起搏胃肠道慢波、控制电节律传导,并拥有综控胃肠道神经信息传递的功能[9,10],除此外在胃肠道中已发现含有一氧化氮合酶神经元[11],其可分泌抑制性神经递质,对胃肠运动和分泌起辅助调控作用。研究人员在前期动物实验中也发现在豚鼠膀胱中存在形态和免疫原性与胃肠道相似的ICCs,并证明其可能就是具有类似于心脏窦房结细胞功能的膀胱运动起搏细胞,而众所周知的一氧化氮(NO)作为一种独特的递质因子调节着机体多方面的功能,尤其是对于平滑肌活动的调节,例如在阴茎勃起过程中,NO信号在维持海绵体平滑肌的舒张就发挥了重要生理作用[12,13],那么在人膀胱中的ICCs及NOS-1神经元细胞在膀胱活动过程中扮演什么角色呢?故本实验使用CD117及NOS-1抗体运用免疫荧光双标记技术在激光共聚焦显微镜下观察ICCs与NOS-1阳性神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律。
CD117是干细胞生长因子受体,也是酪氨酸激酶受体,国际通用标记ICCs的特异性抗体,NOS-1是机体内催化NO生物合成的关键限速酶,可标记一氧化氮阳性细胞,特异性远远好于NADPH-d酶组织化学间接反映NOS的方法。实验结果发现在人膀胱组织中广泛分布着CD117阳性的ICCs,尤以平滑肌肌束外围和肌束间的组织间隙为多,肌内可见ICCs之间通过突起连结形成网络化,这种分布与其肌原性的兴奋起搏作用密切相关,这与国外学者DAVIDSON RA[14]等在豚鼠膀胱中报道的分布情形类似。同时可见NOS-1阳性神经元细胞在膀胱肌间神经丛成簇大量存在,并形成神经元细胞网络,双染发现NOS-1神经元细胞多分布在ICCs的邻近周围,两者大多伴行在一起,上述结果提示NOS阳性神经元与ICCs关系密切,推测可能NOS-1神经末梢分泌出NO,向ICCs(靶细胞)发出神经信号,其可通过控制对NO的产生,进一步整合神经信号对ICCs的调控,从而起到调节膀胱活动作用。虽然未见两者细胞明显共存,双染发现ICCs同时也可表达NOS-1,被染成棕黄色,提示ICCs可能具有自分泌产生NO的功能,NO作为信使将抑制信号通过弥散作用于周围的平滑肌细胞,产生舒张作用,意味着ICCs具有将抑制性信号加强、放大作用。
尽管近年的研究普遍认定维持胃肠道电机械运动正常的生理基础是胃肠神经系统-Cajal样间质细胞-平滑肌细胞组成的基本功能单元,且有文献报道称NO可激活ICCs内可溶性鸟苷酸环化酶,引起ICCs内c GMP浓度升高,于是激活c GMP依赖性蛋白激酶,进而使ICCs内钙离子增加,并释放某种因子(可能是NO),令周围平滑肌细胞内钙离子减少,最终作用使平滑肌细胞舒张[15]。那么在人膀胱中是否也耦合了膀胱神经系统-ICCs-逼尿肌细胞三者的功能,现在还不能完全得出结论,本研究的意义在于:(1)为一步论证ICCs作为人膀胱自律活动的起搏细胞提供了形态学分布基础。(2)人膀胱组织中,一氧化氮合酶阳性神经元多分布在ICCs周围,提示ICCs可能作为NO的目标细胞,即NO对膀胱运动功能的调节可能通过ICCs来发挥效应的,为生理学及病理生理学研究正常膀胱活动及各类膀胱功能障碍性疾病提供新思路。但研究人员已知膀胱周期性的储尿、排尿功能是非常复杂的,NO作为一种特殊的生物信息分子,在中枢和外周神经系统都可以作为神经信号发挥重要的生物学作用,而且除NOS-1神经元外,膀胱中还存在其他重要神经元,如胆碱能神经元、P物质神经元、嘌呤神经元等,这些神经元释放递质作为信使对膀胱的活动也发挥着不可替代的作用。ICCs以及膀胱中的这些神经元细胞它们具体扮演的角色及分工如何,互相之间如何协调配合,有待进一步深入地研究。
摘要：目的 探讨cajal样间质细胞(ICCs)及一氧化氮合酶-1(NOS-1)神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律及意义。方法 人膀胱全层组织冰冻切片,CD117免疫荧光结合NOS-1免疫荧光双重标记染色。结果 激光共聚焦显微镜下观察CD117表达阳性的ICCs及NOS-1阳性神经元细胞广泛分布于人膀胱组织内,发现ICCs可表达NOS-1,总体上双重染色未发现两种细胞有明显的共表达,但可见NOS-1表达阳性神经元细胞的附近存在较多ICCs。结论 人膀胱中的ICCs可能是膀胱自主节律性运动的起搏细胞,NOS-1阳性神经元细胞可能以ICCs作为靶点共同参与对膀胱舒缩活动的综控。
间质干细胞 第8篇
1材料与方法
1.1材料
小鼠间质干细胞C3H10T1/2购自中国科学院上海细胞库。rh BMP-2 (R&D systems) , Array STAR mouse lnc RNA microarray (8×60 K, 上海康成生物, 芯片包含31423条蛋白编码m RNA和25376条lnc RNA, 本文仅分析编码蛋白m RNA表达变化) 。 BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒 (Sigma) 。
1.2实验方法
1.2.1碱性磷酸酶染色鉴定早期成骨定向分化C3H10T1/2接种于6孔板中, 细胞生长至约90%融合, rh BMP-2诱导组加入含200 ng/m L rh BMP-2培养基, 对照组加入不含rh BMP-2的培养基, 每2~3天更换一次培养基。当成骨诱导分化7 d后, rh BMP-2诱导组、对照组的单层细胞用PBS清洗2次, 然后用体积分数为0.7乙醇室温固定15 min, BCIP/NBT避光染色30 min, 用蒸馏水漂洗细胞3次, 倒置显微镜下观察并拍照记录。
1.2.2 C3H10T1/2早期成骨定向分化基因芯片检测及其生物信息学分析C3H10T1/2成骨定向分化1 d和4 d后, rh BMP-2诱导组、对照组采用TRIzol提取总RNA, 按照说明扩增、标记荧光、纯化、与芯片杂交、洗脱。用Agilent Scanner G2505C扫描每张芯片的的信号强度, 应用Agilent Feature Extraction软件 (version 11.0.1.1) 分析芯片图像文件, 用Gene Spring GX v11.5.1软件 (Agilent) 进行数据处理分析, 根据基因表达水平筛选出差异2倍以上的基因并采用GATHER软件[1] (http://gather.genome.duke.edu/) 进行生物信息学分析富集基因本体 (gene ontology, GO) 和生物通路。
1.2.3差异表达基因蛋白互作网络分析STRING (http://string-db.org/) 软件[2]从各种资源中整合了已知的和预测的蛋白质相互作用 (包括直接和间接作用) 来生成网络, 其数据来自于基因组、高通量实验、共表达、 已有知识4种资源。 本研究采用此数据库资源对上述差异表达基因进行蛋白互作网络构建。
2结果
2.1间质干细胞C3H10T1/2成骨分化鉴定
间质干细胞C3H10T1/2经rh BMP-2成骨诱导分化7 d后, 碱性磷酸酶染色显示:rh BMP-2诱导组呈蓝紫色 (图1) , 这表明rh BMP-2能诱导C3H10T1/2间质干细胞定向成骨分化。 此细胞模型可用于后续实验研究。
A:对照组;B:rh BMP-2诱导组
2.2 C3H10T1/2基因表达谱生物信息学分析
通过对C3H10T1/2成骨分化1 d和4 d芯片结果进行分析, 筛选出两个时间点表达均升高2倍以上的基因42个;表达均降低2倍以上的基因45个 (表1) 。 采用生物软件进行分子功能基因本体和通路分析发现, 显著性差异分子功能本体为发育、器官形成等, 并与细胞因子-细胞因子受体作用通路相关。
2.3一致性差异表达基因编码蛋白相互作用网络分析
采用STRING网络资源对差异表达基因编码蛋白进行网络分析, 构建了部分基因的基因表达调控与蛋白互作网络, 通过对网络进行分析 (图2) , 发现经rh BMP-2诱导后差异表达的Egfr、Cxcl12等信号分子处于蛋白网络重要交叉点, 可能与信号通路交谈有关, 说明在rh BMP-2诱导C3H10T1/2间质干细胞早期成骨分化过程中, Egfr、Cxcl12等信号分子参与调控BMP-2信号。
3讨论
间质干细胞成骨分化是一个多基因参与的, 多步骤的复杂的生物过程。 机体一些重要的转录因子如Runx2、Dlx2等[3,4]以及众多的信号通路在成骨分化起到非常重要调控作用[5]。 但是, 关于BMP-2诱导间质干细胞早期成骨定向分化相关调控机制以及不同信号间的交谈分子, 目前尚未完全阐明。
基因芯片技术提供了一个用于同时研究一个细胞或组织全基因组表达的较好平台。 本研究对rh BMP-2诱导C3H10T1/2成骨分化1 d和4 d后的基因表达谱进行分析, 提取了rh BMP-2诱导后差异表达的基因共87个, 其中上调基因42个, 下调基因45个。 通过文献分析发现, 多个基因已经报道与成骨分化紧密相关, 它们在成骨定向、分化、转分化过程中发挥着重要作用, 如Frizzled家族成员FZD9[6]、 同源蛋白家族基因Dlx2[7]、转录因子ID4[8]、细胞外基质相关基因Ecm1[9]等。 其他差异基因, 将成为笔者研究BMP-2成骨信号的重要切入点。 同时, 进行分子功能相关基因本体分析发现, 在早期成骨分化过程, 富集得分最高的为发育、器官形成、细胞因子-细胞因子受体作用相关信号, 这可能与BMP-2诱导成骨分化密切相关。
复杂网络理论作为一门新兴学科, 为系统水平上研究生物网络提供了新的理论依据和平台。 2000年Jeong等[10]在 《Nature》上第一次发表利用复杂网络理论研究代谢网络的拓扑特性的论文, 自此以后, 利用复杂网络理论研究各种生物网络迅速发展[11,12], 主要集中在探索活细胞中所有分子的行为和它们之间的相互作用, 以及从局部到整体, 生物体如何形成了极其复杂的动力学机制。 蛋白-蛋白互作网络和转录调控网络是生物信息调控的主要实现方式, 在整个生命过程中有着非常重要的作用, 是决定细胞命运的关键因素。通过对差异基因构建蛋白互作和转录调控网络, 本研究发现EGFR、CXCL12等信号分子在rh BMP-2诱导间质干细胞早期成骨分化网络中处于非常重要的网络节点。 研究表明, EGFR信号参与骨原始细胞群维持, 成骨分化平衡调控[13], 并与前体成骨细胞活性和增殖紧密相关[14]。 最近的研究也表明, CXCL12/ CXCR4信号参与骨形成和骨吸收的调控[15], 在BMP-9诱导的间质干细胞成骨分化的早期和中期, CXCL12/ CXCR4信号轴也发挥重要作用[16]。 本研究提示EGFR、 CXCL12信号可能与BMP-2信号 “交谈”, 参与调控BMP-2信号, 因此进一步探索这些分子在成骨分化平衡调控中的作用机制, 具有重要的意义。 同时, 趋化因子 (C-C模体) 配体成员CCL2、CCL7等在网络中也处于非常重要交叉节点, 是否参与BMP-2信号调控成骨分化, 笔者正在研究中。
综上所述, 本研究通过对C3H10T1/2成骨分化早期基因表达谱进行分析, 找到了一些受rh BMP-2调控表达的基因, 这将是BMP-2成骨信号研究的重要切入点。 同时, 通过网络生物学分析发现, EGFR、 CXCL12等可能参与BMP-2信号调控, 控制着间质干细胞骨向分化。
摘要：目的 研究间质干细胞早期定向成骨分化基因表达谱, 为研究基因对早期成骨定向分化调控机制提供实验基础。方法 分别提取重组人骨形成蛋白2 (rhBMP-2) 诱导组和对照组C3H10T1/2细胞总RNA, 进行扩增标记后, 与ArraySTAR小鼠基因芯片杂交, 应用生物信息学软件GeneSpring和GATHER对基因芯片数据进行分析。应用STRING在线软件对差异表达基因构建蛋白互作网络并进行网络分析。结果 C3H10T1/2早期成骨分化中, 主要富集发育、器官形成等分子功能本体以及细胞因子-细胞因子受体作用信号通路。成骨分化1 d和4 d均上调表达基因42个, 下调表达基因45个。网络分析研究表明:Egfr、Cxcl12等信号分子参与调控rhBMP-2诱导成骨分化。结论 筛选的差异表达基因和信号分子对早期成骨分化调控具有重要作用, 为进一步全面解析早期成骨定向分化提供实验基础。
间质干细胞 第9篇
1 材料与方法
1.1 糖尿病大鼠模型的建立
健康雄性SD大鼠24只 (200~250 g) 。随机分为正常对照组 (NC组) 8只, 糖尿病组 (DM组) 16只。糖尿病组大鼠禁食不禁水12 h后, 予一次性尾静脉注射链脲佐菌素 (STZ, Sigma公司) 50 mg/kg。48 h后尾静脉采血, 快速血糖仪测随机血糖, 1周后复测空腹血糖, 以两次随机血糖>16.7 mmol/L和空腹血糖>13.9 mmol/L为糖尿病模型建立成功, 建模成功后将糖尿病组随机分为2个亚组, 1组为缬沙坦治疗组 (DV组) , 1组为糖尿病对照组 (DC组) 。治疗组予50 mg/ (kg·d) 缬沙坦 (北京诺华公司提供, 160毫克/粒) 灌胃, 糖尿病对照组 (DC组) 和正常对照组 (NC组) 不予治疗。正常对照组予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射。在8周留取血、尿、组织标本。
1.2 组织学常规检查
肾组织石蜡切片行PAS和HE染色, 观察肾组织肾小球硬化程度和肾小管损害程度。肾小球系膜区增宽程度按0~3分的半定量计分方法评价:0级为无系膜增宽, 计0分;1级为轻度系膜增宽, 计1分;2级为中度系膜增宽, 计2分;3级为重度系膜增宽, 计3分。每个动物至少评价30个肾小球, 最终评分由所评价的动物所有肾小球计分的平均值得出, 结果表示为均数±标准误。
1.3 免疫组织化学染色和量化
肾组织石蜡切片用小鼠抗-大鼠CD68抗体 (识别大鼠巨噬细胞) (Serotec公司, UK) 行免疫组织化学染色, 最后套染无苏木素的PAS。分别计算20个连续非重叠的肾皮质区高倍镜视野下 (×400) CD+68巨噬细胞数, 除以高倍视野数, 得每皮质高倍视野下的平均细胞数。数据以均数±标准误表示。
1.4 统计学分析
均数比较采用方差分析 (ANOVA) , P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血糖、体质量及肾重/体质量变化
NC组大鼠随着时间的延长, 体质量逐渐增加。而糖尿病大鼠随着时间的延长体质量无明显增加。DC组、DV组体质量均低于NC组体质量 (P<0.01) 。DC组、DV组大鼠各时间点血糖较NC对照组明显增高 (P<0.01) 。见表1。
注:*与同时间点NC组比较P<0.01;#与同时间点DC组比较P<0.05
2.2 24 h尿蛋白排泄量
DC组随着时间的延长, 24 h尿白蛋白的排泄量逐渐升高, 各时间点统计学上有显著差异 (P<0.01) 。与NC组比较, DC组各时间24 h尿白蛋白的排泄量明显升高, 统计学上有显著差异。DV组与DC组比较, 蛋白尿有减轻趋势, 在8周时DV组较DC组尿白蛋白排泄率减少 (P<0.05) 。
2.3 光镜病理学变化
在DM组大鼠可以看到:肾小球体积增大, 肾小球囊腔缩小, 系膜区增宽, 基底膜增厚以及肾小管肥大。而NC组无以上变化, DC组上述变化较DV组严重。8周时DC组与DV组肾小球系膜增宽半定量评分分别为 (2.16±0.12) 和 (1.74±0.40) (P<0.01) 。
2.4 肾脏巨噬细胞浸润
免疫组化染色显示在NC组大鼠肾间质偶尔见到个别巨噬细胞浸润。DC组肾间质内有明显巨噬细胞浸润, 而在DV组巨噬细胞浸润情况较DC组减轻。DC组与DV组8周肾间质巨噬细胞浸润数分别为 (13.9±3.3) 个/HPF和 (8.3±2.7) 个/HPF (P<0.01) 。见图1。
3 讨论
在本研究中, 我们探讨了血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对链脲菌素诱导的糖尿病大鼠肾间质中的巨噬细胞浸润的影响, 及其在糖尿病早期肾损害中的保护作用。结果显示:在糖尿病大鼠肾脏中, 肾间质可见巨噬细胞浸润, 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可明显减轻巨噬细胞的浸润和蛋白尿水平, 伴随光镜病理学的变化。
在糖尿病肾病早期, 肾小球表达过量单核细胞趋化蛋白-1、血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1等, 导致组织局部单核/巨噬细胞浸润, 浸润的单核/巨噬细胞通过分泌细胞因子, 炎性介质及产生氧自由基等造成肾组织结构的破坏, 加速肾脏病变进程。尽管糖尿病肾病在以往被强调为肾小球疾病, 但是近年肾脏间质的病变在糖尿病肾病发展中的作用得到认可和重视[4]。控制这一间质炎症过程, 有可能延缓糖尿病的肾损害进程。
我们通过免疫组化发现, 在糖尿病成模后8周, 此时肾脏中巨噬细胞的浸润显著, 而肾小球只有个别巨噬细胞。在血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗组, 肾间质巨噬细胞的浸润明显减轻, 肾小球系膜增宽程度减轻。这些提示缬沙坦可能通过减少巨噬细胞浸润, 减轻肾脏病理改变, 减少尿蛋白排出, 从而有效防止或延缓糖尿病肾病的进展。
血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂为什么能减轻肾间质巨噬细胞的浸润?这可能与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂选择性与血管紧张素Ⅱ受体结合有关。血管紧张素Ⅱ (AgnⅡ) 无法与受体结合, 因而AgnⅡ诱导的单核细胞趋化蛋白分泌减少, 从而使单核巨噬细胞的浸润减少[5]。
综上所述, 我们证实了血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对糖尿病大鼠肾脏炎性细胞浸润的减轻作用。但是, 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂是如何参与肾脏保护尚需深度研究。对炎症浸润的拮抗有望成为延缓糖尿病肾病的新靶点之一。
摘要：目的 探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对糖尿病肾脏的保护作用。方法 STZ尾静脉注射建立大鼠糖尿病模型。用免疫组化方法检测大鼠肾脏巨噬细胞的表达。比较血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗组与非治疗组肾脏CD68+巨噬细胞的表达。结果 糖尿病成模后, 巨噬细胞在肾间质的表达明显增加。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗组较非治疗组肾间质巨噬细胞的浸润减少加 (P<0.01) , 伴随蛋白尿的减轻。结论血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可减轻糖尿病大鼠肾脏炎症浸润。
关键词：血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,巨噬细胞,糖尿病
参考文献
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