神经干细胞范文

神经干细胞范文（精选11篇）

神经干细胞 第1篇

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar新生鼠, 由本校动物实验中心提供。主要试剂:DMEM/F12、B27、荧光FITC标记试剂, DAB显色试剂, Brd U、NSE、nestin、GFAP一抗, SABC-FITC、SABC-CY3, EGF、b FGF、BDNF因子, 羊抗小鼠Cy3, 低熔点琼脂糖。

1.2 方法

神经干细胞的分离及培养:选用Wistar新生鼠, 取海马组织, 经D-Hanks, 液漂洗后将脑组织置入小瓶中剪碎, 加入无血清培养基吹打成单细胞悬液, 台盼兰染色计数, 于每个培养瓶中加入密度约为5×105/m L细胞悬液4m L左右。置于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养。待原代克隆形成后再次分离制作单细胞悬液, 此后每隔3d半量换液, 5~7d分离神经球进行传代[3]。

半固体培养: (1) 取盖玻片置于3.5cm培养皿底部, 基本培养液为含0.3%低熔点琼脂和2%B27的DMEM/F12 (撤走b FGF) 。在盖玻片上用5%的琼脂和神经营养因子 (neurotrophic factor, NTF) 制成NTF扩散源, 将传代三代后得神经干细胞分散放置于NTF扩散源周围的盖玻片上, 培养于基本培养液中, 观察不同因子不同浓度制成的扩散源诱导NSCs迁移情况, 并跟踪观察各组实验细胞迁移行为及形态学变化[4]。

(2) 分组:BDNF:浓度1μg/L、10μg/L、100μg/L, 共3组。NGF:浓度1μg/L、10μg/L、100μg/L, 共3组。BDNF+NGF:从上述6组中筛选出两种因子的最佳浓度组成1组。空白对照组:不加任何NTF。

免疫细胞组织化学及荧光实验:nestin标记:将传代三次后的细胞团贴壁培养48h后进行nestin免疫细胞化学鉴定。数码照相机拍照, 各组均设阴性对照, 阴性对照切片以PBS替代一抗, 其余步骤相同。

1.3 统计学方法

采用SPSS10.0软件, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组之间两两比较用方差分析, 两组之间比较用t检验, P<0.05为有统计学意义。

2 结果

神经干细胞球贴壁培养后24h, 作Nestin免疫荧光鉴定绝大部分细胞显示nestin阳性细胞团呈绿色, 迁出分化的NSCs呈阴性 (见图1) 。连续14d观察接种在培养皿上的神经干细胞, 见细胞生长状态良好, 倒置显微镜下细胞折光性强 (见图2) 。Brd U标记移植前之神经干细胞, 免疫组化见大量神经细胞呈胞核被染色而胞浆未被染色Brdu标记阳性细胞, 少部分未被标记。 (见图3) 。镜下见BDNF各组神经元样细胞多, 胞体面积大, 突起长, 14d时胞体多呈现三角行或多边形, 分支丰富。NGF各组细胞呈现类圆形或类星形, 胞体较大, 细胞伸出较多突起并逐渐延长, 突起末端分支可见膨大的生长锥。镜下观察见BDNF组及NGF组细胞迁出均有方向性趋势, 但不同浓度的因子诱导NSCs迁移现象是有差别的。高浓度组中细胞团细胞向培养皿中心即因子扩散源方向迁出趋势明显, 向这一个方向伸出的突触也较长较粗。这种效果距离因子越近就越明显, 部分干细胞球团伸出类柱状的突起, 迁向因子方向。各浓度组细胞突起均随时间推移逐渐增长, 100μg/L BDNF组诱导迁移距离最长可达1200m以上 (见图4) 。而对照组干细胞团的细胞是向四周均匀分散迁出的, 与实验组相比较迁移距离较近 (见图5) 。

每组取距离因子扩散源1.5mm内的10个干细胞球团迁移距离的平均值: (×100)

与对照组比较, *P<0.05。

组内比较: (1) 1μg/L NGF与10μg/L NGF两浓度组诱导迁移作用比较, 差异无显著性 (P>0.05) , 但二者与100μg/L NGF诱导迁移作用比较 (P<0.01) 。 (2) BDNF各浓度组差异皆有显著性 (P<0.01) , 提示BDNF对神经干细胞的诱导迁移作用具有浓度依赖性。组间比较:除1μg/L BDNF外, 其余所有实验组与对照组比较 (P<0.05) , 说明神经生长因子与脑源性神经营养因子具有诱导神经干细胞迁移的作用。100μg/L BDNF与 (100μg/L NGF+100μg/L BDNF) 两组作用皆优于100μg/L NGF (P<0.05) , 而100μg/L BDNF组与 (100μg/L NGF+100μg/L BDNF) 组合之间比较 (P<0.05) 差异无显著性。本实验未观察到两种因子在诱导神经干细胞迁移方面有协同效应。

3 讨论

神经干细胞的迁移机制非常复杂, 目前主要有放射状迁移和正切迁移两种模式[5]。NGF通过物理和化学两个方面对神经前体细胞迁移起诱导作用。 (1) 物理因素方面:即神经前体细胞沿着放射状胶质细胞的长突起方向迁移。NGF仅出现在迁移期的神经前体细胞中, 其受体erb表达于迁移期的放射状胶质细胞, 阻断受体erb后, 神经前体细胞迁移受到抑制。外源性的NGF还可稳定原来的突触接触和防止突触可塑性变化[6]。 (2) 在化学因素方面:即神经前体经细胞沿着化学趋化物的方向发生迁移。神经生长因子的弥散浓度梯度为神前体细胞的迁移提供了化学信号, 研究表明, 表达高亲和力受体Trk A的鼠脊索成神经元细胞, 在低浓度的NGF诱导下即能沿着化学梯度直接发生迁移[7]。有研究表明, BDNF能触发干细胞的趋化和运动[8]。BD-NF的主要作用位点是在中枢神经系统的突触上, 其不仅能促进突起的再生, 而且能提高神经元表面BDNF受体Trk B的表达水平, 其对突触的延伸作用强于NGF[9]。这正与本实验体外条件下100μg/L BDNF诱导神经干细胞迁移作用优于100μg/L NGF的结论相符。BDNF在神经系统可塑性及祖细胞迁移中起至关重要的作用。在神经元迁移时期, 脑皮质内存在BDNF高亲和力受体Trk B及BDNFm R-NA, 研究表明, Trk B高亲和力受体主要存在于有迁移细胞的区域, 许多Trk B阳性细胞均表现出典型迁移神经元的特性[10]。我们认为, BDNF的浓度与其受体Trk B的表达有直接的关系, 是BDNF在诱导神经干细胞迁移方面存在浓度依赖性的原因。

本实验表明神经营养因子BDNF对体外培养的神经干细胞迁移诱导作用优于NGF, 且神经干细胞迁移对其存在浓度依赖性。结论提示BDNF可在NSCs准确到达病灶部位, 修复损伤组织方面起到积极的作用, 为如何应用NSCs治疗神经系统疾病提供新的思路。

参考文献

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神经干细胞 第2篇

脐带血来源干细胞神经分化的研究进展

中枢神经系统损伤后的自身修复能力有限,因而研究者致力于寻找一种合适的细胞进行移植以代替受损的神经细胞修复神经损伤.近年来的研究表明,在特定的`诱导条件下,脐带血干细胞能够出现类似神经细胞样的形态学变化,并表达不同神经发育标志以及电生理特征;在动物体内实验中,脐带血细胞能定向迁移至受损神经组织并植活,改善神经损伤后遗症.脐带血干细胞有可能作为一种有效的细胞资源,应用于人类中枢神经系统疾病的细胞替代治疗以及神经保护与支持.就脐带血干细胞神经分化的体内外研究以及调控机制方面的进展作一综述.

作 者：李云涛 李桥川 邱录贵 LI Yun-tao LI Qiao-chuan QIU Lu-gui 作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学,血液学研究所血液病医院,天津,300020刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200626(6)分类号：Q813关键词：脐带血 神经分化 干细胞

神经干细胞与颅脑创伤的研究进展 第3篇

长期以来,人们普遍认为中枢神经系统的神经细胞的发生在出生前不久或出生后不久就停止了,成年中枢神经系统的神经细胞没有再生能力,但是近年来研究发现成年哺乳动物的中枢神经系统中存在神经干细胞(neural stem cells,NSCs),它是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞,它具有增殖和多向分化的潜能,在移植部位分裂增殖,并在局部微环境的作用下分化成相应的细胞来补充替代受损的细胞,恢复中枢神经系统的正常结构和功能。随着对神经干细胞及其相关领域广泛深入的研究,神经干细胞对中枢神经系统损伤后功能修复作用愈来愈引起人们重视,本文就此研究予以综述。

神经干细胞与颅脑创伤

20世纪90代初,研究者在成年哺乳动物的脑内分离出一种能不断分裂与增殖,并具有多向分化潜能的细胞群落,称之为神经干细胞。1992年,Reynolds[1]首次提出成年哺乳动物的脑中存在神经干细胞。1997年,Mckay[2]提出神经干细胞的定义是具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞群落。2000年,Gage[3]进一步提出神经干细胞特性为可生成神经组织或来源于神经系统,具有自我更新能力,可通过不对称细胞分裂产生新的细胞。

颅脑创伤是一种常见多发病,其机制主要如下[4]:首先是弥漫性的细胞死亡,然后是二次细胞损伤,主要是细胞的凋亡,最后是激活的星形胶质细胞形成胶质瘢痕。目前对于中枢神经系统损伤的主要治疗策略有[5]:采用神经生长因子或者抵消神经生长因子抑制剂作用的因子来促进损伤组织的再生;以含有生长因子的桥架来连接损伤区域,促进轴突的再生;修复受损的髓鞘,恢复神经冲动的传导;增强中枢神经系统的可塑性。中枢神经系统的修复策略包括损伤神经元的替代、神经纤维再生、空洞或瘢痕的桥接、轴突的修复等,但临床上治疗很难达到修复受损神经元、突触联系及恢复神经功能目的,而神经干细胞的研究则为颅脑创伤治疗提供了新的方向。Tzeng等[6]将BrdU注入脑部刺伤后的达鼠侧脑室上皮质,10分钟后在病灶区观察到小胶质和巨噬细胞浸润,并出现NFkB/P65(+)细胞激活,且注射区及对侧非注射区的脑室下区、脑室区源性神经前体细胞均出现了强BrdU标记,这一结果证实双侧大脑半球脑室下区、脑室区源性神经前体细胞在脑损伤后均会出现DNA合成,提示神经干细胞在脑损伤时参与修复活动。另外,Tada等[7]用离子辐射大鼠脑发现,在辐射180天后,室管膜下增殖形成的细胞总数及其中可增殖细胞数和未成熟的神经元数均下降,且辐射剂量越大,神经干细胞受损越多。这提示正常室管膜下的形态结构及功能有赖于神经干细胞的维持,当受到照射后神经干细胞不能再构建室管膜下,结果从反面证实神经干细胞对脑损伤修复是有益的。

内源性神经干细胞治疗研究

大量实验已证实哺乳动物中中枢神经系统的神经元再生能力有限的原因是缺乏刺激神经干细胞分化所必须的神经因子,因此人们试图通过对生长因子和细胞因子的研究已期激活内源性神经干细胞进行诱导分化,达到神经自我修复的目的。当脑组织损伤后,首先反应的是胶质细胞在各种因子的作用下快速分裂增殖,形成胶质瘢痕,其中也有神经胶质干细胞的参与,但大多数干细胞增殖后分化为胶质细胞,而不分化成神经元,这可能是缺乏细胞支架的结果。尽管目前内源性神经干细胞增殖分化的调控机制还不甚清楚,但研究证明至少神经干细胞的定向分化是可以人为控制的。

异体神经干细胞治疗研究

有关神经干细胞移植科学家进行了许多实验性研究,在体外各种有丝分裂因子的作用下,增殖后再将其植入受体的中枢神经系统,实验证明神经干细胞移植物可在宿主体内存化、迁移及分化。Riess等[8]研究表明神经干细胞移植后可以存活并能分化为神经元或胶质细胞,并且其分化趋势可能受微环境影响,移植能改善运动功能,但是对于认知功能的改善作用并不明显,其改善运动损伤可能机制为细胞替代作用以减少组织损失和胶质瘢痕形成及细胞可能存在的神经营养作用。目前研究认为改善移植细胞的局部生存环境在移植神经干细胞的存活、增殖及分化中起重要作用,可以得到所需要的特殊表型的神经元或胶质细胞,这一作用可能强于神经干细胞自身的特性。

尽管神经干细胞的研究已取得许多进步,但仍然还有许多难题,定向诱导分化是一个神经干细胞应用到临床的关键问题,目前我们很难获得来源于同一谱系、细胞无异质性、分化程度一致的神经干细胞,而且人脑是随生理病理变化而自动调节内环境的整合体,颅脑创伤病变复杂;神经干细胞与宿主的整合程度也是影响移植效果的重要因素,目前尚不能明确肯定移植到体内的神经干细胞无免疫排斥反应。我们相信,随着研究的进一步深入,神经干细胞会早日应用到临床,成为颅脑创伤治疗的一个选择。

参考文献

1 Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.Science,1992,255:1707-1710.

2 Mckay R.Stem cells in the central nervous system.Science,1997,276:66-71.

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6 Tzeng SF,Wu JP.Responses of microglia and neural progenitors to mechanical brain injury.Neuroreport,1999,10(11):2287-2292.

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神经干细胞 第4篇

1 NSCs生物学特性与来源

NSCs是具有分化成为星形胶质、神经元及少突胶质细胞能力的细胞, 它能够自我更新并能提供大量脑组织细胞[2]。NSCs移植入神经组织后可整合入神经元通路, 分化、增殖的神经元将逐渐代替有缺陷或死亡的细胞, 并能与周围的神经元建立正确的突触联系, 从而为重新恢复神经功能奠定基础。NSCs以两种状态存在:单细胞与神经球。其培养来源于胚胎、脐血和成体来源, 目前研究较多的是来自人畸胎瘤细胞系。

2 NSCs移植方式

移植干细胞的方法大致可分为:1立体定向植入;2腰椎穿刺植入;3血液循环途径植入。

2.1脑内立体定位植入是当前动物实验研究中应用最多的移植方法, 方法是经颅骨钻孔后, 应用微量注射器, 注入神经干细胞悬液至特定区域。其优点是定位准确, 适用于多种动物模型研究。但缺点是:1会对脑组织造成一定程度的机械性损伤;2定位到脑实质区, 可能会产生容积占位效应, 从而制约NSCs移植量;还可能发生局部NSCs聚集过度, 影响NSCs的分化和增殖及其治疗效果。

2.2腰椎穿刺植入该方法主要应用于脊髓损伤模型动物实验研究, 将干细胞注入到蛛网膜下腔, 干细胞经脑脊液循环流遍整个大脑和脊髓, 在蛛网膜下腔贴附、增殖和分化, 适用于病变范围广泛的神经功能疾病的治疗[3]。

2.3血液循环途径植入包括动、静脉移植, 在动物实验研究过程中, 通过静脉注射NSCs由血液循环透过血脑屏障到达脑组织后从而发挥作用。

3 NSCs移植治疗中枢神经系统疾病

3.1 NSCs移植治疗脑创伤NSCs除了具有分化、增殖、分泌营养因子等作用外, 还具有良好的组织相容性、整合性、低免疫原性等特点[4], 为治疗各种重型颅脑损伤提供了依据和研究潜质。

Matthew等[5]开创了人类诱导多能干细胞系 (hi PSCs) 来源的NSC移植先例, 为后续研究做了铺垫。Makri等[6]人研究发现应用微量注射器损害小鼠大脑皮质, 模拟机械性脑损伤后, 植入过表达的BM88/Cend1, 其是神经元特异调控因子, 能够调控神经元祖细胞分化及周期退出。结果显示, 与对照组相比, 过表达的BM88/Cend1的NSCs分化产生神经元的比例升高了2.3倍, 产生胶质细胞的比例降低了40%, 减少了胶质瘢痕形成, 对脑组织的再生起到了促进作用。

Wu等[7]将携带缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 基因的NSCs植入MCAO模型大鼠侧脑室后, 缺血大鼠神经功能缺陷均得到了显著的改善, HIF-1α-NSC还能增加缺血损伤区域Ⅷ因子阳性细胞数目。研究显示HIF-1α具有促进血管再生的作用。

Qi等[8]人建立局灶性脑缺血再灌注动物模型, 实验显示血管内皮祖细胞与神经干细胞共同移植能够提高脑缺血再灌注模型大鼠缺血半暗区的Cx43的m RNA表达, 提高缝隙连接数量, 强化移植后NSCs与微环境细胞的信息联系, 从而加快了整合和神经网络的重建。

3.2 NSCs植入治疗神经退行性疾病神经退行性病变包括帕金森病 (PD) 、阿尔兹海默病 (AD) 、亨廷顿病 (HD) 等。胶质源性神经营养因子 (GDNF) 被公认为对治疗帕金森疾病具有非常重要的意义。Pineda等人[9]在HD小鼠模型中, 研究通过植入表达GDNF和萤火虫荧光素酶基因的NSCs, 利用高级神经影像学技术, 结果显示:与对照侧相比, 损伤侧纹状体中NSCs有大量增值、分化, GDNF化的NSCs能够神促进经元再生, 改善其行为功能。

3.3 NSCs移植治疗脊髓损伤SCI多发于中、轻年, 多由外力造成, 死亡的神经元不能由自身产生神经元或邻近的神经元来代替, 因此损伤后修复能力非常有限。NSCs通过有针对性的增殖分化诱导可成为新的神经细胞, 从而代替受损的脊髓神经, 并能够与周围的神经系统建立起正确的突触联系。同时分化出的星状胶质细胞也会诱导轴突发挥较好的营养支持作用, NSCs整合入脊髓后, 可分化少突胶质细胞逐渐生成髓鞘[10], 然后包围轴突, 进而重建神经元通路。NSCs还可以大量分泌多种神经细胞的营养因子[11], 可以有效促进神经元的存活, 而移植的NSCs还有利于改善机体的内环境, 进而加速内源性干细胞的增殖和分化, 生成更多的神经元, 这也是脊髓损伤再生修复的主要机制之一[12]。

Lianjin等人[13]运用缺氧诱导因子启动子RTP801和红细胞生成素增强子-猿病毒40 (SV-40) 启动子两种表达体系, 能在低氧的环境下高表达VEGF, 其中EPO增强子SV-40系效果更显著。两种表达体系能够促使VEGF-NSC特异性地在脊髓损伤区发挥重要作用。

Chai[14]等人通过建立SCI模型, 通过检测NGF定位及定量表达以及蛋白质印迹结果, 发现NSCs移植治疗后阳性神经元明显增加, 可能是通过促进损伤处NGF阳性神经元和蛋白表达量增加, 营养神经纤维再生, 促进脊髓功能的恢复。如何有效地促进损伤脊髓的再生与修复仍是神经科学领域的一大难题。

4总结与展望

膀胱小细胞神经内分泌癌一例 第5篇

患者男性，52岁，无明显诱因出现无痛性间断肉眼血尿3个月。无尿频、尿急，排尿困难等症状。一月前出现下腹部胀痛；查体：一般情况尚可，未发现阳性体征，膀胱镜检查：膀胱右侧输尿管开口处见一3.0x2.5x2.0cm的菜花状肿物，表明充血、粗糙；周围黏膜见多处出血点。实验室检查：WBC：10.8x109/L，HB：121g/L，尿BLD（+++），临床诊断：膀胱占位性病变，行部分膀胱及肿瘤切除术。

病理检查，眼观：送检标本为部分膀胱及肿瘤组织。肿瘤3.0x3.0x2.5cm，菜花状，表明灰红色，粗糙，切面灰白，质软。镜检：瘤细胞丰富呈片状或巢状分布，间质少；细胞小，呈圆形或梭形，细胞质少，核深染，可见核分裂象，瘤细胞侵及黏膜下层，伴有坏死。免疫表型：CK、EMA、Syn均阳性，LCA阴性。

病理诊断：膀胱小细胞神经内分泌癌。

讨论 膀胱小细胞神经内分泌癌较少见，主要见于老年男性，好发年龄50岁，症状主要为无痛性血尿，少数有排尿困难，肿瘤大体可呈扁平状，息肉状，菜花狀或蕈伞状，半数左右混有其它肿瘤成分，如移行细胞癌、腺癌和恶性中胚叶肿瘤等分化好的神经内分泌癌为典型类癌，更为少见。分化差着为小细胞神经内分泌癌（即非典型类癌），形态似肺的雀表细胞癌。鉴别诊断主要与非霍奇金淋巴瘤区别，后者瘤细胞常为弥漫性分布，没有菜花状排列，LCA、CK、EMA、NSE、lgA、Syn等标记可以确诊，此外应多取材以排除其它恶性肿瘤成分，膀胱小细胞癌大多恶性度高，初诊时已属晚期，患者生存期平均10个月。

神经干细胞的研究进展 第6篇

1 神经干细胞的概念及基本生物学特征

1.1 神经干细胞的概念

神经干细胞是一种具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞, 它处于未分化状态, 可通过对称或不对称分裂方式分裂增殖, 最终分化成中枢神经系统的三种主要细胞, 即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞的特征性生物学标志物为神经上皮巢蛋白 (Nestin) , 随着神经上皮的分化成熟而逐渐消失, 其功能目前尚未完全明确。

1.2 神经干细胞的生物学特性

1.2.1 自我更新

神经干细胞具有高度增殖和自我更新能力, 在一定条件下能不断进行有丝分裂。其分裂方式主要有两种, 一种是对称分裂, 此种分裂方式产生的两个子细胞都是干细胞;另一种是不对称分裂, 分裂产生一个干细胞和一个子代分化细胞, 后者最终分化成为终末细胞。神经干细胞通过分裂进行增殖, 细胞互相聚集形成神经球, 神经球内含有神经干细胞, 神经前体细胞, 凋亡细胞和已分化的神经元和神经胶质细胞, 具体成分根据具体培养情况不同而不同。神经球经过机械分离后可继续增殖, 并形成子代神经球。传代后的神经干细胞与母代干细胞的生物特性完全相同。张晓梅等[6]报道, 神经干细胞可在体外传代达3年以上。

1.2.2 多潜能分化

神经干细胞在特定条件下可以分化形成神经元, 星形胶质细胞和少突胶质细胞等, 其分化与局部微环境密切相关, 目前可通过生长因子诱导, 基因调控及信号传导通路调节等途径诱导神经干细胞的分化, 为进一步获取治疗疾病所需要的细胞类型奠定了基础。

1.2.3 迁移功能和良好的组织融合性

在人类和哺乳动物神经系统的发育过程中, 神经干细胞沿着发育索方向迁移。移植后的神经干细胞则受病变部位神经源性信号的影响, 向病变部位迁移, 并分化成特异性神经细胞, 与宿主细胞形成初步良好结合, 参与宿主神经网络, 形成神经网络整合, 促进正常脑功能的恢复。

1.2.4 处于高度未分化状态

神经干细胞呈巢蛋白 (nestin) 阳性, 但缺乏已分化细胞的抗原标志, 无成熟细胞相应的特异性标志, 处于原始的未分化状态。

2 神经干细胞的分布

神经干细胞主要存在于胚胎鼠的纹状体、小脑半球、脑室区等。1992年, Reynolds等在成年鼠的纹状体也发现了神经干细胞。Morrison等利用细胞表面标记和流式细胞仪检测, 发现从哺乳动物胚胎神经管嵴能够分离出神经干细胞。经过人们的研究发现, 在一些过去曾认为不可能存在神经细胞再生的区域, 如脊髓、隔区也分离出了神经干细胞。1996年, Weiss等还证明了成年哺乳动物的脊髓中央管附近的室管膜细胞具有神经干细胞的特征。近年来的研究证明, 成年哺乳动物中枢神经系统中广泛存在着神经干细胞, 且在成年哺乳动物脑内有两个能终生产生神经元而且增殖活跃的两个区域, 是前脑室下带 (subventricular zone, SVZ) 和海马齿状回的亚颗粒带 (vsubgranularzone, SGZ) 。

3 神经干细胞的分离培养

神经干细胞的体外培养已经较成熟, 目前主要采取的是悬浮培养方式, 该方式下培养的神经干细胞以神经球的形式生长和增殖。多数研究认为从脑中培养神经干细胞需要bFGF和EGF的存在, 在体外培养的培养液中加入bFGF或EGF, 神经干细胞可保持非常稳定的功能和更新能力。但尽管EGF和bFGF都能够促进神经干细胞的增殖和分化, 但这两种因子不可以互换使用或只使用一种, 因为在EGF单独存在的情况下, 主要形成胶质细胞, 而多数情况下bFGF可引起最大程度的神经细胞发生。将从动物体中直接分离出的神经干细胞培养至含B27, bFGF, EGF等因子的培养基中进行培养, 可保持神经干细胞的稳定生长。 获得神经干细胞的方法不只是直接从动物体中分离, 还可通过其他方法, 例如定向诱导骨髓基质细胞 (MSCs) 向神经干细胞的转化。已有一系列的研究证实, 骨髓基质细胞移植入啮齿类动物的脑内后, 可以分化为神经元和星形胶质细胞[7,8,9,10]。对这部分的研究国内外进行的都比较多, Woodbery等首次在体外诱导骨髓基质细胞横向分化为神经元[11], 国内有张卉等报道, 解剖出Wistar大鼠股骨, 取出骨髓细胞, 用培养液 (B27培养液, DMEM/F12, 3:1, 5μg/mL胰岛素, 100μg/mL入转铁蛋白, 肝素, 100μg/mL腐胺, 30nmol/mL亚硒酸钠, 5mg/mL葡萄糖, 0.1%青霉素和链霉素, 2.5μg/mL二性霉素B, 10%胎牛血清) 调整细胞浓度至1×105个/mL, 接种至培养板中, 37℃, 5%CO2, 95%空气, 饱和湿度的培养箱中培养。培养第3天进行细胞传代, 以后每3天换液一次, 清除大部分杂质细胞。若撤去EGF、bFGF加入BDNF、胶质细胞条件培养液继续培养, 细胞可分化为神经元和星形胶质细胞[12,13]。

由于原代培养的神经干细胞在体外长期培养过程中, 很难维持稳定不变的生存或增殖状态, 因此, 为了保持神经干细胞在体外长时间生存、分裂和增殖, 目前应用基因转移技术得到了永生化的神经干细胞系, 即诱导神经干细胞的细胞周期不断循环, 达到阻止细胞分化的目的, 用于基因转移和神经再生方面的研究。最常用的方法是通过逆转录病毒载体将编码癌基因蛋白的基因转导入胚胎神经干细胞中, 使细胞停留在分化过程的某一个阶段, 不能进行终末分化, 并获得长期传代的能力[14]。Slinskey等利用large T抗原的突变等位基因, 即癌变的tsA58温度敏感性基因具有的良好性能, 即在体外培养温度 (33℃) 条件下非常稳定, 而在体内温度 (37~39℃) 条件下会降解这一特性, 应用SV40的病毒质粒载体将large T抗原导入胚鼠来源的神经干细胞中, 发现每一个表达large T抗原的细胞系, 既可以在不含EGF的培养基中进行分裂, 又能够在含10%FBS的培养基中生长增殖而不发生分化, 还可以有效地抵抗凋亡的发生, 尤其是其温度敏感性, 避免了移植入体内使机体癌变的可能, 因此可作为条件永生化神经干细胞系。神经干细胞系有以下生物学特性:①能够自我更新, 自我复制并在体外大量增殖的细胞。②移植入体内后仍具有多分化潜能。③可被转染并稳定地表达外源性基因 (报告基因和治疗基因) ④可分离出单细胞克隆[15]。因此, 其可作为脑内神经细胞移植及作为基因转移的工具。但同时细胞系的基因表型和蛋白表达与正常细胞有着显著的不同, 这应当引起研究者的注意。

4 神经干细胞的分化微环境调控

影响神经干细胞的分化的因素有很多, 主要包括内源性因素 (基因) 和外源性因素的相互作用调控。其中, 内源性因素起决定性作用, 外源性因素是必要条件, 两者关系非常复杂。

4.1 微环境的调控

4.1.1 生长因子

目前, 对神经干细胞的增殖和分化有影响作用的生长因子主要有表皮生长因子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 两种。EGF在发育脑和成年脑中均有表达, 在发育较晚期促进神经前体细胞的增殖和分化。有证据表明, EGF对胶质前体细胞有促进增殖的作用, 能够促进神经干细胞向胶质前体细胞分化, 并可促进体外培养的神经元等多种神经细胞的生存和生长。FGF主要包括FGF-1和FGF-2等, 其通过激活FGF受体而起作用, 在胚胎发育早期对维持神经前体细胞的生存和促进增殖起作用。有文章报道, 胚胎大鼠皮质神经干细胞的增殖和分化呈bFGF浓度依赖性, 低浓度时有利于向神经元方向分化, 高浓度时有利于向少突胶质细胞方向分化, 若加入其他因子如胶质细胞成熟因子和内皮素等, 则神经干细胞可分化成星形胶质细胞。FGF-2还对具有多分化潜能的神经干细胞具有促进增殖的作用。

除EGF和FGF外, 神经干细胞的分化还受其他生长因子的调控, 如胰岛素样生长因子 (IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ) [16]能调节细胞存活、生长、分化、突触功能和神经递质的释放。血小板源性生长因子 (PDGF) 可能通过提高神经元方向分化的祖细胞的生存率, 使得大鼠NSC产生更多的神经元, 但在人胚中则完全相反。

4.1.2 细胞因子

对神经干细胞的增殖和分化有影响作用的细胞因子有许多种, 主要包括睫状神经营养因子 (CNF) 和白血病抑制因子 (LIF) 等。有报道称, CNF可特异性地诱导神经干细胞分化为神经胶质细胞。也有报道显示, CNF若作用于具有多分化潜能的神经干细胞, 则促进其向胆碱能神经元分化, 若作用于少突胶质细胞2型星形祖细胞则可诱导其分化为2型星形胶质细胞。而LIF则可促进大鼠晚期的胚胎神经干细胞向星形胶质细胞分化, 且能够刺激形成干细胞群落但对人胚的神经干细胞分化起抑制作用。

4.1.3 神经营养因子

神经营养因子的主要作用时促进神经元的存活及分化, 不同的因子对神经细胞的分化有不同的调节作用。目前研究比较多的有脑源性神经营养因子 (BDNF) 、神经生长因子 (NGF) 和神经营养因子3 (NT3) 。

BDNF对各种神经元早期的发育、分化和生长再生具有维持和促进作用。有实验表明, 神经球在外源性BDNF存在的情况下, 生长情况更加好。BDNF和血清联合作用时可诱导神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞, 且分化为神经元的比例较单独用血清诱导要高。NGF广泛存在于动物体内, 主要集中于大脑皮质、海马、隔核以及Meynert核区。发育期NGF受体在神经元上有广泛的分布。经研究证实, NGF有促进胚胎发育期神经干细胞分化为具有特异功能的神经元且对神经元的特异性功能具有维持作用, 可促进发育神经元的生长。对于NT3的研究, 目前只知道其可使神经干细胞的增殖减少, 促进其分化, 但分化的方向目前未见报道。虽然神经营养因子对神经干细胞的分化有一定的影响, 但其对分化的影响似乎是通过促进已分化的神经干细胞更加成熟, 而不是促进未分化的多潜能神经干细胞定向分化。

5 神经干细胞的应用

5.1 神经干细胞原位诱导

国内外大量实验已经证实, 成年脑中存在神经干细胞, 如果在中枢神经受损伤时能够激活内源性神经干细胞, 诱导其增殖且迁移至受损部位补充损失脑细胞, 就可治疗中枢神经系统的疾病。现已有实验证实[17], 在脑室管膜下区等部位的神经干细胞在脑损伤发生后确实能够增殖并迁移到受损部位, 分化成新的神经细胞, 取代损失的脑细胞。但实际上在大多数情况下, 仅由内源性干细胞产生的神经细胞远远不能弥补损伤后脱失的神经组织, 分析原因, 可能是因为要原位诱导出功能特异的神经元需要多种刺激和特定细胞因子的作用。除了直接替代丢失的神经元外, 还可以诱导植入的神经干细胞生成髓鞘形成细胞或星形胶质细胞, 为损伤区神经元提供支持。

5.2 基因治疗

基因治疗是通过特定载体将相关外源基因导入体内, 使其得到表达, 达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。由于神经干细胞容易获取和增殖, 有迁移能力, 可整合于宿主细胞且有修复功能, 使其成为基因治疗的最佳载体。而且, 如果利用自身干细胞进行移植, 还可避免发生免疫排斥反应。神经干细胞的基因可操作性及可携带多个外源基因的特性, 使我们可以通过转基因技术, 将外源性基因片段导入神经干细胞中, 通过移植, 使外源性基因得以在体内表达, 达到治愈疾病的目的。但需要注意的是, 若用永生化神经干细胞作为载体, 移植后有致癌的危险。

5.3 神经干细胞的移植治疗

研究已经证实成年脑内存在神经干细胞, 且脑损伤后内源性神经干细胞可自行增殖并迁移至受损伤区域进行修复, 但实际上在大多数情况下, 单靠内源性干细胞的修复来治疗神经系统的损伤在现阶段还是无法达到的, 因为内源性干细胞产生的神经细胞在数目上远远少于受损伤和脱失的细胞。如果能够通过将外源性的神经干细胞移植入受损部位, 使其替代因疾病死亡的神经干细胞, 并与宿主神经系统整合, 发挥神经系统功能, 则可达到治愈疾病的目的。这引起了神经科学家的兴趣, 通过大量的实验研究证明, 神经替代和部分修复神经回路是可能的。

神经干细胞的移植治疗的效果很大程度上取决于植入神经干细胞在结构和功能上与宿主神经系统的整合程度, 神经元在未有广泛轴突连接时移植到脑内生长良好, 这与宿主脑年龄也有关系, 胚胎时期整合最好, 在出生后逐渐下降。研究表明, 神经干细胞移植后, 在局部微环境的作用下分化成相应的细胞来补充替代受损的细胞, 恢复中枢神经系统的正常结构和功能, 移植后产生的细胞也可以自主释放神经递质, 产生神经营养因子和神经保护因子, 从而控制神经变性或促进神经细胞的再生。虽然有关神经干细胞生物学的研究已经证明干细胞移植的可行性, 但移植到体内的神经干细胞更多的是分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞[18,19], 分化为神经元的很少。

5.3.1 帕金森病

帕金森氏病 (PD) 是因位于中脑部位“黑质”中的多巴胺能神经元发生病理性改变后, 多巴胺的合成减少, 抑制乙酰胆碱的功能降低, 则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了“震颤麻痹”。

目前临床治疗PD主要药物是L-DOPA, 但其只对发病初期5~10年有效, 随着病情的严重, 药量增加而导致副作用越来越重。同时, 在目前的研究状况下, 变性的多巴胺能神经元定位明确, 纹状体-黑质的解剖位置清楚, 且已有比较稳定的动物模型, 因此, 利用神经干细胞移植治疗PD是非常适合的。

在动物实验中, 向PD模型大鼠纹状体植入合适数目的神经干细胞, 发现植入细胞可长出神经纤维且不易产生免疫排斥反应, 但体内TH阳性细胞却很少, 说明移植的神经干细胞不能自动分化为多巴胺能神经元, 需要宿主信号的调节。已有研究表明, 甲状腺激素/维甲酸核受体超家族的转录因子Nurrl是中脑多巴胺能神经元的分化诱导所必需的, 同时还需要星形胶质细胞提供向多巴胺能神经元分化的信号。研究发现, 将Nurrl转染给神经干细胞系C17.2并与胎鼠 (E16) 中脑腹侧原代神经元共培养时, TH表达明显。这便为临床应用细胞移植治疗PD奠定了基础。现在, 临床已有PD患者进行了胚胎细胞移植, Preed研究显示, 把人胚多巴胺能神经元移植入PD病人脑内, 可显著改善60岁以下病人的临床症状, 但对60岁以上病人的症状未见改善, 这有待于我们进行进一步的实验研究。

5.3.2 亨廷顿病

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病, 致病基因位于4号染色体, 被成为Hunringtin基因, 该基因的表达产物直接损伤携带该基因的神经元, 并且通过长期的慢性损害过程波及其他神经元, 以皮层和新纹状体最为严重。目前, 亨廷顿病大鼠模型已经建立, 将神经干细胞移植入其脑内, 观察发现能够保护维持运动习惯的能力, 能够恢复受损的运动习性, 说明植入的神经干细胞已经在体内形成了功能性连接。而将胎儿纹状体细胞移植入喹啉酸损伤大鼠模型的纹状体内, 12周后植入块有神经纤维长出并爬伸到宿主脑灰质内。因此, 干细胞移植治疗亨廷顿病是有实验依据的, 将其应用于临床指日可待。

5.3.3 脊髓损伤

对于脊髓损伤的治疗, 人们也设想能用神经干细胞的移植来治疗。有实验表明, 将人的神经干细胞移植入脊髓严重受损的大鼠模型, 部分瘫痪的实验鼠在接受移植治疗后, 可依靠后肢爬行, 而且后肢运动比较协调。对实验鼠的解剖显示, 神经干细胞在其体内分化成了少突胶质细胞和新的神经元细胞。其中新生的神经元细胞提高了实验鼠受损的神经元之间的“通信联系”, 而少突胶质细胞分泌髓磷脂, 髓磷脂是神经纤维表面的髓鞘的组成物质, 髓鞘可以保护神经细胞, 同时还能够加速神经信号的传导。虽然干细胞移植治疗脊髓损伤的研究有了一定进展, 但需要注意的是脊髓神经元有着较长的突起, 植入的神经干细胞能够参与这样的神经回路以及参与程度都有待进一步的实验研究。

目前, 神经干细胞的移植还应用在缺血性中风, 心脏骤停或冠状动脉阻塞造成的大脑血流中断而使某些易感神经元如海马CAI椎体细胞死亡, 经实验证实, 可利用神经干细胞移植, 使其与宿主神经系统建立连接, 优先迁移到缺血区分化成机体所需要的神经细胞。同时, 神经干细胞的移植还被应用于改善动物的认知功能等其他许多方面。

6 展望

神经干细胞 第7篇

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠均购自华中科技大学附属同济医学院实验动物中心, 清洁级, 均为2月龄, 体质量平均为 (150±20) g, 雌雄不限。

1.2 实验试剂

Nyco Prep TM分离液 (Axis-shield公司) , DMEM/F12 (1∶1) 无血清培养液 (上海西唐生物科技有限公司) , Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司) 。

1.3 骨髓NTCSCs处理

1.3.1 骨髓NTCSCs分离和培养方法

无菌状态下取出大鼠股骨及胫骨组织, 采用0.1%PBS溶液连续冲洗骨髓腔, 然后使用Nyco Prep TM分离液将骨髓单核细胞分离出来, 无血清培养液制备成细胞悬液, 按5×107个·ml-1浓度将细胞接种在六孔培养皿中, 2 d后换新鲜培养液, 吸弃未发生贴壁的细胞, 将贴壁细胞接种在含多聚鸟氨酸 (L-ornithine) 和纤维粘连蛋白的10 ml培养瓶中予以悬浮方式进行培养, 经细胞免疫组化和免疫荧光方法检测Nestin、CXCR4等蛋白表达予以鉴定。

1.3.2 EGFP基因转染细胞

分别将p EGFP-C1和Lipofectamine 2000置入无血清培养液中混匀形成复合物, 将混合液加入细胞培养板中孵育, 然后在荧光显微镜下进行观察, 计算EGFP基因转染率, 加入新霉素予以G418筛选处理, 克隆EGFP基因表达阳性的骨髓NTCSCs。

1.4 模型构建

SD大鼠全身麻醉后, 解剖左侧耳后颅骨将圆窗龛完全暴露, 缓慢注射10μl 50 nmol·L-1浓度的ouabain至圆窗龛, 一直到圆窗龛完全填充满, 1 h后将圆窗龛内ouabain清洗干净, 最后彻底关闭术腔。

1.5 实验分组

将60只SD大鼠按数字随机法分为5组, 每组12只, A组为对照组, 另外4组 (B、C、D、E组) 构建感音神经性耳聋动物模型。B组大鼠断头后取出听泡组织行HE常规染色, 详细观察SGNs损伤和内耳毛细胞存活情况, 确认造模成功。在显微装置下由熟练操作者将50μl EGFP基因表达阳性的骨髓NTCSCs溶液注射至C、D、E 3组大鼠左耳耳蜗蜗轴处;SD大鼠右耳及A组作为对照, 采用同一方法注射相同体积的0.1%PBS溶液。

1.6 听觉修复作用检测

在耳蜗注射后1周 (A、C组) 、2周 (D组) 、1个月 (E组) 时, 在全身麻醉处理后于隔音电屏蔽室行电生理测试, 检测各组大鼠听性脑干反应 (auditory brainstem response, ABR) 反应阈和畸变产物耳声发射 (distotion product otoacoustic emission, DPOAE) 幅值, 比较听功能的动态变化情况。

1.6.1 ABR测试

各组大鼠全身麻醉处理后, 剃除干净头顶和鼻背等部位的毛发, 分别将电极放置于大鼠头顶两耳中点 (记录电极) 、鼻背处 (地电极) 和双耳廓 (参考电极) 。刺激声为短声, 耳机方式给声, 脉冲宽度设为0.1 ms, 叠加1 000次, 在屏蔽隔声室内进行检测, 以波Ⅲ刚消失的声刺激强度 (d B SPL) 作为该耳的不反应阈, 每次重复测试两次方可确定阈值。

1.6.2 OPOAE测试

通过耳塞将声源和接受器分别引入实验大鼠的外耳道, 两纯音信号分别为f1与f2, f2/f1固定频比为1.2;刺激声强度L1=65 d B SPL, L2=55 d B SPL;以SQRT (F1×F2) 1/20.5、0.7、1、1.4、2、3、4、6、8 k Hz共9个频率点为频率范围, 叠加200次[6,7]。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据予以统计和分析, 各组大鼠ABR反应阈和DPOAE幅值比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NTCSCs培养及鉴定

骨髓NTCSCs在培养液中可自然发生贴壁和分化等现象, 分化后的细胞呈网状表现, 继续培养4~5 d后可见悬浮桑葚状的细胞团形成。经胰酶溶液消化处理后可继续予以传代培养, 经细胞免疫组化和免疫荧光方法检测可示Nestin、CXCR4等蛋白表达阳性, 提示为具有自我更新能力的干细胞, 见图1A~E。

2.2 各组ABR阈值比较

随着骨髓NTCSCs移植时间的延长, ABR阈值得到明显改善 (P<0.05) , 见表1。

与A组比较, a P<0.05;与C组比较, b P<0.05;与D组比较, c P<0.05

2.3 各组DPOAE幅值比较

随着骨髓NTCSCs移植时间的延长, DPOAE幅值明显上升 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

感音性神经性聋临床上缺乏有效的治疗方法。随着干细胞在各种研究领域的扩展[8,9], 通过干细胞移植或可成为治疗感音性神经性聋的最佳方法。本实验研究通过向大鼠圆窗注射ouabain建立听神经损伤动物模型, 然后将骨髓NTCSCs移植到耳蜗后观察大鼠听力变化。

d B SPL

与A组比较, a P<0.05;与C组比较, b P<0.05;与D组比较, c P<0.05

ABR和DPOAE测试方法是目前临床已成熟应用于听觉生理检测的实验技术, ABR主要通过声刺激动物, 然后检测听神经脑干传导通路上诱发产生的电位反应, 是该通路对声刺激的综合性反应, 故可用于动物听能力的检测[10];而DPOAE则主要检测耳蜗外毛细胞主动发射的声能, 可在外耳道部位记录特异性的能量音, 具有异常现象检出率高、反应稳定性强和频率特异性较好等多种作用特点, 是反映耳蜗外毛细胞生理学功能状态和非线性作用机制的有效技术指标[11]。任何外来或内在因素引起的耳蜗生理学功能异常影响到外耳毛细胞, 均可由DPOAE检出;而任何阻碍耳蜗和听神经传导通路的异常现象均可由ABR检测所反映出来。因此本实验选择这两种方法检测骨髓NTCSCs移植治疗听神经损伤大鼠的听力变化情况。

本研究结果显示, 随着骨髓NTCSCs移植时间的延长, ABR阈值得到明显改善 (P<0.05) , DPOAE幅值也明显上升 (P<0.05) 。由此可知, 骨髓NTCSCs移植治疗可明显改善听神经损伤大鼠的听力。

参考文献

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鸡脑神经干细胞体外诱导分化研究 第8篇

NSCs是神经系统形成和发育的源泉[6]。NSCs不仅存在于进化的哺乳动物神经系统中, 同时也存在于包括人类在内的所有成年哺乳类动物的神经器官中, 还可以来自更为原始的胚胎干细胞。NSCs在损伤修复方面的应用潜力[7], 包括采用移植技术修复缺失的细胞, 利用这种技术来替代某些因细胞死亡或凋亡引起的疾病, 将会有更为广阔的应用前景。

1 材料

1.1 试验动物

10胚龄北京油鸡, 由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所家禽实验基地提供。

1.2 主要试剂

胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司产品;细胞培养添加剂N2和无血清细胞培养添加剂B27, 均购自Gibco公司;表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维生长因子 (b FGF) 、全反式维甲酸 (ATRA) , 均购自Sigma公司;Triton X-100、二氨基苯基吲哚 (DAPI) 、巢蛋白 (Nestin) 抗体、兔抗鸡Musashi1单克隆抗体、兔抗鸡Hes1单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体、2, 3-环核苷酸磷酸二脂酶 (CNP) 抗体和抗微管相关蛋白2 (MAP2) 抗体, 均购自Abcam公司;DMEM/F12全培养液 (DMEM/F12基础培养基+1%N2+2%B27+20 ng/m L b FGF+20 ng/m L EGF) , 自制。

2 方法

2.1 鸡脑NSCs的分离培养

选取10胚龄北京油鸡鸡胚, 于传递柜中紫外线消毒后转移至无菌台操作:将取出的鸡胚置于干净的培养皿中, 轻轻分离出双侧大脑皮质[8], 置于DMEM/F12培养液中, 用灭菌后的镊子小心剥离出脑膜及血管, 在磷酸缓冲液 (PBS) 中清洗2次。用眼科剪将脑组织剪碎成糊状, 加入少量基础培养液, 反复轻轻吹打, 经200目尼龙网滤过, 1 200 r/min低速离心10 min;收集细胞沉淀, 用DMEM/F12全培养液重悬细胞沉淀, 混匀后接种于玻璃培养瓶中, 37℃、5%CO2孵箱中恒温培养, 每天在显微镜下观察并拍照、记录;3~4 d进行一次半量补液 (离心后收集沉淀) , 5~7 d后将形成的神经球吸出, 1 200 r/min离心10 min;小心弃去上清液, 重新加入DMEM/F12全培养液于细胞沉淀中, 反复吹打混匀使神经细胞球充分分散后, 制成单细胞悬液, 分装到培养瓶中。

2.2 鸡脑NSCs的传代

离心, 收集未贴壁生长的细胞克隆[9], 1 200 r/min低速离心10 min;将细胞重悬于DMEM/F12新鲜全培养液中, 稍加吹打分散成小细胞团, 然后等比例分装到2个培养瓶, 以一传二的比例进行扩增培养, 每3 d进行半量补液, 再经7~10 d后将重新形成的悬浮神经干细胞球离心吹打再制成单细胞悬液, 继续传代。每2~3 d在倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照、记录。将从组织中分离的细胞记为原代细胞P0, 传代之后的细胞依次标记为P1、P2……Pn。

2.3 鸡脑NSCs的免疫荧光鉴定

将P3代脑NSCs克隆球接种于预先置有多聚赖氨酸包被过夜的6孔培养板中3~4 h;待神经球贴壁后, 用4%多聚甲醛固定15 min;用PBS清洗3次, 每次5 min;加0.1%Triton X-100处理15 min;用PBS清洗3次, 每次5 min;加15%山羊血清室温下封闭30 min;滴加原液按1∶200比例用1%牛血清白蛋白 (BSA) 稀释的一抗 (兔抗鸡单克隆抗体) , 室温下孵育1 h;用PBS清洗3次, 每次5 min;滴加异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的按1∶100比例用PBS稀释的二抗 (第二抗体是能和抗体结合, 即抗体的抗体) , 室温下避光孵育1 h;用PBS清洗3次, 每次5 min;滴加按1∶1 000比例用PBS稀释的DAPI, 室温下染核15 min;用PBS清洗3次, 每次5 min;于激光共聚焦显微镜下观察并拍照, 检测NSCs的表面标记物Nestin、Hes1和Musashi1的表达情况。

2.4 鸡脑NSCs的诱导分化及鉴定

2.4.1 鸡脑NSCs的诱导分化

将生长状态良好的细胞低速离心后加入新鲜诱导液重悬, 接种到六孔板中, 调整细胞密度, 分别进行神经元细胞、少突胶质细胞及星形胶质细胞的诱导分化。诱导时先将神经球吸出, 1 200 r/min低速离心10 min;弃去上清液, 再用PBS将细胞沉淀反复洗涤3次, 离心后弃去PBS, 将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清和1 mol/L ATRA的DMEM/F12新鲜诱导液中, 接种至培养板。

2.4.2 鸡脑NSCS的诱导分化后鉴定

每天在显微镜下观察加入细胞诱导液后细胞的形态学变化, 并拍照记录。当细胞诱导14天时, 对诱导后的细胞进行免疫荧光鉴定, 具体操作参见2.3。

3 结果

3.1 鸡脑NSCs的分离培养及形态学观察结果 (见233页彩图1)

从10胚龄北京油鸡鸡胚新鲜脑组织中可以分离培养得到脑NSCs, 形成悬浮状细胞球, 将这些细胞球分散成单细胞并重新以一定的克隆密度进行培养, 单个细胞又很快克隆形成新的神经球[10]。接种后的第3天悬浮细胞团的体积明显增大, 镜下可以观察到细胞团呈不规则球状, 折光性好, 部分细胞已贴壁分化死亡, 1周后神经球的体积继续膨胀变大, 细胞团无明显的突起, 立体感较强, 细胞球边界清晰, 细胞密度逐渐增大。

3.2 鸡脑NSCs的传代培养结果 (见233页彩图2)

细胞的传代采用上述机械分散培养法, 其一可以保证细胞有充足的营养物质以供其生长, 其二可以及时地去除培养瓶中的分化死亡细胞, 为悬浮神经球细胞提供良好的生长环境, 细胞在体外可大量增殖传代。待到悬浮神经球中央刚开始呈现黄褐色时即行传代, 此时神经球直径约为200μm, 传代期间反复轻柔吹打, 分散克隆球, 一般3~7 d即可传代1次。

3.3 鸡脑NSCs的免疫组织化学鉴定结果 (见233页彩图3)

试验对鸡脑神经干细胞P3代细胞进行了表面标记的免疫荧光检测, 抗体为兔抗鸡Musashi1单克隆抗体、兔抗鸡Hes1单克隆抗体、小鼠抗鸡Nestin单克隆抗体。结果表明, 分离培养的鸡脑NSCs普遍表达NSCs的表面标记物Nestin、Hes1和Musashi1。

3.4 鸡脑NSCs的诱导分化及鉴定结果

3.4.1 形态学观察结果 (见234页彩图4)

向10胚龄北京油鸡脑NSCs中添加诱导液接种4 h后, 即可见到大部分细胞球已贴壁, 24 h后可见一些细胞沿着细胞球边缘向外迁移, 伸出短而小的突起。随后细胞球面积逐渐增大, 细胞球的周边出现一些不同形态的细胞, 其中胞体较大、形态不规则、具有多个粗突起的胶质样细胞数量较多, 而胞体有很强光晕呈圆形或椭圆形、具有1~2个细长突起的神经元样细胞数量较少。接种14 d后, 细胞球的面积已不再增大。神经元细胞胞体呈较小的圆形或椭圆形, 细胞核明显, 突起少而细长, 以双突起为主。星形胶质细胞数目最多, 胞体较大, 不规则, 胞核明显, 胞体周边有许多分枝状的突起。少突胶质细胞最少, 胞体较小, 从胞体发出3~4个细长有分枝的突起, 局部呈宽叶状。

3.4.2 免疫荧光鉴定结果 (见234页彩图5)

在细胞诱导14天时, 对其进行免疫荧光鉴定, 结果表明, 神经元呈MAP2阳性, 星形胶质细胞呈GFAP阳性, 少突胶质细胞呈CNP阳性。

4 讨论

NSCs可作为研究神经发育机制的体外模型[11], NSCs的发现是神经科学领域的一项重大发现, 在神经系统损伤修复和神经退行性疾病的细胞替代治疗和基因治疗中有巨大的应用价值[12]。近年来, 中枢神经系统干细胞在临床方面的应用也成为神经系统研究的热点[13]。

采用机械分离法及无血清培养法可以成功地分离培养北京油鸡脑NSCs, 所得细胞生长状况良好, 并可在体外大量增殖[14]。脑NSCs呈悬浮态球状生长, 经过数代的传代培养, NSCs纯度逐渐增高, 细胞增殖能力也越来越好。NSCs在培养时会发生自分化现象[15], 在培养初期会有部分细胞团贴壁生长, 及时更换培养瓶可以去除贴壁细胞。细胞的传代以机械法分离为宜, 细胞在体外可大量增殖传代。随着细胞代次的增加传代时间也逐渐延长, 以3~7 d不等。本试验选择DMEM/F12为基础培养基, 采用无血清的培养方式[16]。除此之外, 培养基中还需添加b FGF、EGF、N2和B27。其中b FGF可以促进NSCs的增殖分化;EGF是NSCs的有丝分裂原, 能促进各种神经组织前体细胞的增殖和分化;B27是培养基添加剂的混合液, 是一种很强的抗氧化、无血清培养基添加成分, 它在神经元黏附于基质时能提供必要的一些血清成分。通过形态学观察和对公认的NSCs细胞表面标志物进行免疫荧光检测鉴定其为NSCs[4]。试验初期是采用无血清的培养基培养脑NSCs, 形成的不规则细胞团可以大量增殖。将悬浮细胞团移入含血清的培养基中, 并添加细胞因子ATRA, NSCs多数呈贴壁生长状态, 随着培养时间的延长, 脑NSCs逐渐自然分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[17], 这说明脑NSCs在体外具有多向分化的潜能。

5 结论

神经干细胞 第9篇

1 资料与方法

1.1 一般资料:

实验材料为0~3 d的新生3只大鼠, 数量为3只, 实验动物中心提供。主要试剂与设备:干粉培养基、B27;b FGF、EGF、PLL;小鼠抗人Nestin Ig G及NSE单克隆抗体, 兔抗GFAP多克隆抗体与Ig G-HRP羊抗兔等。同时, 还有胰蛋白酶;小鼠抗TH单克隆抗体;病理图像分析仪与气浴恒温振荡床[2]。

1.2 方法

1.2.1 取材与培养:

取新生0~3 d的3只大鼠的脑组织海马, 并将其分离放置于平衡盐溶液的培养皿中进行漂洗。在用平衡盐溶液将海马清洗3次后, 将其移进无菌小瓶中, 剪至适当尺寸的组织块, 采用吸管吹打后。在37℃下加入6.5倍量左右的2.5%胰蛋白酶, 进行消化15 min, 待组织块出现变化至疏松且颜色发白时, 可将其取出, 并用胎牛血清的DMEM/F12培养基停止消化, 并进行相关操作将其制成单细胞悬液;然后选取滤网过滤5 min (1000 r/min) , 去掉上清液后, 将20μg/L表皮生长因子的DMEM/F12培养基和含2%的B27、10μg/L碱性成纤维生长因子洗涤细胞2次, 反复离心去除上清液后, 加入适量的培养液, 将其制成细胞悬液, 活细胞在椎虫蓝染色后进行计数, 调整细胞密度, 后接种置与25 m L的培养瓶;在饱和湿度下, 体积为0.05的CO2培养箱中培养, 在初次换液时, 采用分瓶法, 往后均2.5 d左右后进行1次换液;在培养5~6 d后, 将发育长至200μm的神经干细胞分离细胞克隆球传代 (机械分离) 。

1.2.2 对胶质细胞的原代培养:

取出新生3 d的3只大鼠的大脑组织, 剪至适当尺寸的组织块在通过0.25%胰蛋白酶, 并在消化0.5 h后 (37℃下) 通过400目纱网进行过滤。然后在预先配置好的营养液中将过滤的相关组织打散成悬液状, 进而将其接种在玻璃培养皿上。最终进行胶质纤维酸性蛋白标记以及相关纯度鉴定。

1.2.3 实验组的细胞培养:

实验组是的细胞培养运用胰蛋白酶把培养基上的星形胶质细胞消化为单细胞悬液, 再以一定的细胞数量放置于12孔培养板上加进完全培养液进行培养, 其培养基上的温度、培养时间以及更换培养基内培养液的间隔时间均必须严格按照要求进行, 直到第7天时便可以对盖玻片上培养的细胞进行染色检查。

1.2.4 免疫细胞化学染色和细胞计数及统计学分析:

对培养基上载玻片上采用免疫细胞化学染色的方法进行研究星形胶质细胞对干细胞分化的影响因素, 其具体的操作必须严格按照要求进行实施, 并计算染色下细胞阳性的发生率。

1.3 统计学方法:

使用SPSS19.0统计软件对上述星形胶质细胞对神经干细胞分化的数据进行分析, 采用t检验与卡方检验进行相关指标的测试与分析。当P<0.05时, 有统计学意义。

2 结果

实验组的纯化星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记为阳性, 其细胞纯度高到96%, 而且在神经元特异性烯醇化酶阳性细胞与酪氨酸羟化酶阳性细胞均比对照组多。见表1。

3 讨论

注:*P<0.05, 可比, 具有统计学意义

作为人体神经系统中数量极多的细胞之一, 星形胶质细胞不仅具有提高人体神经系统结构及相关营养的供给, 而且具有修复神经组织、促进神经干细胞分化以及神经免疫、促进细胞再生等重要作用[3]。

研究表明, 在人体中枢神经细胞中, 星形胶质细胞的数量为神经元细胞的30倍左右, 且二者相互作用, 相互影响。由上述结果可知, 将星形胶质细胞与神经干细胞共同培养的实验组较之普通培养的对照组, 在细胞接种之后, 其细胞球不仅细胞贴壁速度快, 而且分化程度差异较大, 尤其在培养4 d后。采用光镜进行观察, 其细胞的胞体不大、边缘光滑、立体感较强的神经元样细胞, 而对照组在这类细胞的数量明显要少、细胞的状态生命力较弱;免疫细胞化学结果显示, 共培养组的神经元及多巴胺神经元明显较对照组高, 且星形胶质细胞的比例均较对照组低。综上所述, 与传统细胞培养与神经干细胞分化相比, 采用星形胶质细胞联合神经干细胞共同培养中, 星形胶质细胞不仅可以加快神经干细胞向神经元细胞的分化以及向多巴胺神经元细胞的分化, 而且可以延长神经元存活时间, 降低神经元凋亡率。值得临床神经干细胞分化培养上进一步推广应用。

参考文献

[1]罗杰峰.黎海燕.沈岳飞.星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11 (42) :8515-8519.

[2]庄朋伟.张艳军.庞坦.黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13 (1) :43-47.

神经干细胞 第10篇

摘 要：针对深度卷积神经网络能够提取图像的高层特征并对图像进行有效表达。采用基于深度卷积神经网络的改进算法，设计了ZCNN网络结构对乳腺病理细胞图像进行分类研究。首先，对病理图像进行预处理，利用ZCA白化降低数据特征间的相关性，从而降低数据间的冗余。其次，在网络卷积层采用线性校正单元（ReLUs）作为网络的激活函数，加速计算网络输出。最后，在网络精调时，利用dropout方法随机断开池化层的网络节点，可以有效抑制算法的过拟合，提高算法的泛化能力。采用本文方法对benign和actionable两类病理细胞图像的分类，精度达到94.65%。性能上超过了Softmax，PCA以及传统的卷积神经网络。

关键词：深度卷积神经网络；ZCA白化；线性校正单元；dropout方法

中图分类号： F721.1 文献标识码： A 文章编号： 1673-1069（2016）18-144-3

1 概述

2006年，加拿大科学家Hinton和他的团队在science上发表一篇关于深度信念网络（DBN）[1]的文章，便引起了学术界的广泛关注，随后更多更一般的深度神经网络方法随之兴起，例如：Denoising Autoencoder（DAE）、Sparse Autoencoder（SAE）、Convolutional Neural Network（CNN）[2]等算法。深度卷积神经网络可以灵活的调节特征提取的空间尺度大小，因此，对图像中目标区域的特征提取会更加灵活。利用深度卷积神经网络对手写字体MNIST数据集进行识别，性能已经接近人类的识别率，在交通标记识别上已经超过了人类的识别能力[3]。文献[4]采用CNN结合图像的空间信息对图像中像素点进行分类研究，结果优于已有的SVM和k-NN分类方法。文献[5]将多示例学习（Multiple Instance Learning）方法与深度卷积神经网络结合应用于高分辨率图像的分类，并且首次对神经胶质瘤（LGG）进行分类精度达到97%，效果接近病理学家的分类结果。

随着计算机辅助诊断技术（Computer-assisted diagnosis， CAD）的不断进步，未来会大大降低病理学家繁重的工作强度。

本文主要是基于深度卷积神经网络的改进算法，设计了ZCNN网络结构对乳腺病理细胞图像进行分类研究。面对复杂的图片信息（光照、染色不均等），在特征提取前，采用ZCA白化对数据进行预处理，降低数据维度间的相关性，然后，利用深度卷积神经网络，逐层提取数据的高维特征。网络构建中，利用线性修正单元（ReLUs）作为各卷积层的网络输出函数，可以加快网络的计算速度。在池化层采用dropout方法随机断开网络节点，防止算法的过拟合，文献[2]采取的方法是在网络输出前的全连接层采用dropout方法，本文是二分类问题，在网络的全连接层并没有采用dropout方法，而是在池化层上使用dropout方法，随机阻止部分网络权值的更新。在网络精调时，采用随机梯度降法逐层计算深度卷积神经网络的参数。

為了提高算法的精度，采用BP（back propagation）算法对网络参数进行优化。

2 ZCA数据预处理

自然图像中相邻像素间存在很强的相关性。在学习统计模型时，通常采用预处理算法降低数据的这种冗余性。将数据的协方差矩阵转变成单位矩阵的过程称为白化（whitening）或球化（sphering）。白化的目的就是降低输入数据的冗余，使白化后的数据更接近原始数据。在数值上，主要是使数据具有统一的协方差，且每个特征都有相同的方差。通过ZCA（Zero Components Analysis）白化使得数据从x空间映射到XZCAwhite空间，降低了数据间的相关性，特征向量各维度方差相等，数据的重要程度得到统一。

3 深度卷积神经网络（CNN）

传统的图像特征提取方法没有固定的提取原则，依赖于手工设计特征提取方法。基于深度卷积神经网络是建立在人工神经网络基础上的自动特征提取方法，通过对输入数据进行多层线性或非线性变换，将数据映射到新的空间里表达，可以稳定有效地提取图像的固有特征。在视觉领域，通过学习整张数字图像能够提取图像局部的高层特征。通常深度卷积网络的底层可以学习边缘、形状等物理特征，随着网络隐含层层数增多可以学习到更多复杂、抽象的视觉特征。但是如果采用全连接方式，隐含层节点数量就会十分庞大，严重降低了算法的计算效率。因此，在学习图像特征时，通常将网络设计成局部连接的神经网络。特征平面上的所有神经元共享一个连接权值，也就是每个特征平面上每个神经元的权重都一样。因此，网络参数大大减少，复杂度也变低。

一个深度卷积神经网络主要由三部分组成：卷积层、池化层、全连接层。卷积层是对上层输入进行卷积滤波，池化层是对上层输入进行下采样。卷积层的每个神经元连接上层输入的小片相邻区域（即感受野区域），表达图像的局部特征。池化层用来提取图像的统计特征，使得网络结构对微小的平移和形变不敏感。卷积层与池化层交替连接且都是由多个2-D的特征平面构成，每个特征平面均代表一种特征映射，全连接层是1-D向量构成的网络层，是对输入数据的特征表达。如图1是本文中设计的ZCNN网络结构，共有11个隐含层，其中卷积层与池化层交替连接共有10层，最后一个隐含层为全连接层。网络的具体参数设置如表1所示。

4 训练阶段

当训练集比较小时，深度神经网络训练时会出现过拟合问题，为了消除过拟合对网络模型的不利影响，Hitton 等人设计了dropout方法，该方法是指在模型训练时，以某一概率随机阻断某些隐含层特征检测器的共同作用，即随机让网络的某些隐含层权重不更新，因此，在样本输入时会有部分隐含层网络节点的权重不更新。在测试阶段，所有的隐含层节点都有输出值，只是输出值降低为原来输出的1/2。

训练采用dropout方法的深度卷积神经网络与传统的神经网络训练类似，利用随机梯度下降法求解网络参数。卷积网络通过前向传播计算网络的实际输出值，然后用实际输出值与理想输出值作差，构造误差损失函数：

En=（t-y） （1）

其中，M表示样本类别数，n表示样本序号，t表示第n个样本的第s维对应的目标值（分类标签），y表示第n个样本对应的第s维输出。最后利用反向传播策略，通过梯度下降法更新网络的权值。

5 实验和结果

5.1实验数据和网络结构

实验数据集由北卡罗来纳大学夏洛特分校的张少霆教授提供，共计190张乳腺病理学图像，其中有100张为benign类，90张为actionable类。分别从benign和actionable类中的每张图像上采集5张互不相交的感兴趣区域作为子图，大小均为256*256*3。随机从benign类和actionable类中分别选取360张和340张子图訓练集，将剩下的子图作为测试集。

训练集数据是3维的RGB图像，我们提取R通道的灰度强度图像，对其进行归一化操作，然后再对图像进行ZCA白化处理去除图像的相关性。将预处理后的数据送入我们设计的深度卷积神经网络中，在所有池化层中采用dropout方法计算特征平面，全连接层将最后一个池化层的24个4*4的特征平面构成一个特征向量，作为图像的特征表达，大小为384*1，用于Softmax分类模型的训练。本文设计的网络结构（ZCNN）如表1所示：

算法通过MATLAB R2013a仿真研究，实验平台是基于Windows 7操作系统的工作站（Intel（R） Xeon（R） E5-2650 v2 CPU and 32 GB 内存），为了更好的说明本算法在benign和actionable两类病理细胞图像的分类效果，我们做了多组对照实验，计算各种分类方法的评价指标Precision，Recall和Accuracy，公式分别如下：

其中，TP表示benign类被正确分为benign类的样本个数，TN表示actionable类被正确分为actionable类的样本个数，FP表示benign类被分为actionable类的样本个数，FN表示actionable类被分为benign类的样本个数。

5.2 结果分析

分别对各种算法计算10组数据求取其平均值，结果如表2所示，利用我们的算法求取的精度明显优于其他几种方法。由结果可以看出Softmax分类器是单层分类器网络，没有充分提取图像的特征信息，其准确率为79.2%。PCA主要是通过数据降维的方法将高维数据映射到低维空间，在本文中，我们保留了95%的特征信息作为分类依据，准确率达到84.00%。利用文献[2]中的CNN方法，对图像数据进行特征提取后分类的精度已经比上述4中算法有了较大的提高，这主要得益于网络特征提取网络层数的增加。然而，在分类精度和特征提取的时间上不及本文算法效果好。深度网络的特征提取所需的时间远远大于传统方法。由此可见，对benign和actionable两类图像分类时，采用卷积神经网络提取图像的高层特征可以实现更好的分类效果，归根结底在于图像特征的有效提取。

6 结论

基于深度学习的特征提取方法在目标识别、图像分类等领域都远远超过了传统的手工特征提取方法，在本文中，我们基于深度卷积神经网络结构进行了改进。首先，利用ZCA白化对数据进行预处理降低特征间的相关性，然后，在训练深度卷积神经网络时，采用ReLUs作为非线性输出函数，可以提高网络计算速度。在网络优化阶段，采用BP算法更新网络权值，利用Dropout方法随机断开网络节点，实现网络结构进行优化。将提取病理细胞图像的高层特征作为Softmax分类器的输入，可以更精确有效的实现benign和actionable病理图像的分类。实验中，采用我们设计深度卷积神经网络结构的性能超过了传统方法，并且也优于不采用预处理和Dropout方法的卷积神经网络。

参 考 文 献

[1] G.Hinton and R.Salakhutdinov，Reducing the dimensio-

nality of data with neural networks， Science，vol.313， 504（2006）.

[2] A.Krizhevsky， I. Sutskever and G. Hinton， ImageNet classification with deep convolutional neural networks， Advances in neural information processing systems， 1097（2008）.

[3] C. Dan， M. Ueli and S. Jurgen， Multi-column deep neural networks for image classification， 2012 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition（CVPR） 6， 3642（2012）.

[4] H.Nuh and B.Gokhan， Classification of histopathological images using convolutional neural network， International Conference on Image Processing Theory， Tools and Applications 4， （2014）， pp. 1-6.

神经干细胞 第11篇

据每日科学网站报道,最近,美国再生医学研究所副主任阿什克·谢蒂及其团队将提取的神经干细胞移植到海马体中,发现其帮助恢复了记忆。相关研究发表在《干细胞转化医学》杂志上。据谢蒂介绍,海马体在学习、记忆及情绪控制方面具有重要作用,但随着年龄增长体积会不断缩小,导致记忆力明显下降。大脑中老化的海马体也会出现慢性炎症等与年龄相关的退行性病变。

该团队最新研究发现,将神经干细胞移植到年轻动物的海马体和年老动物的海马体中获得了同样的效果。这些移植的神经干细胞不仅活了下来,而且还能分化、再生,这有助于治疗与年龄增长相关的神经退行性疾病。谢蒂表示,相比胎儿神经元,神经干细胞等多能干细胞能忍受移植过程中大脑微环境缺氧和创伤,从而取得比间接核分裂或相对成熟神经元更好的效果。在中风及大脑创伤条件下,神经干细胞同样可以反馈受伤信号并取代一些丢失的大脑皮质神经元。谢蒂还说:“未必一定要从大脑中取得细胞。”不久的将来,可从皮肤中获得大量同种属神经干细胞,包括皮肤细胞在内的大量体细胞能被诱导生成多能干细胞。科学家通过这些细胞可以做很多事情,包括利用提取的神经干细胞来生产更多的神经干细胞或新的神经元。