沙门氏菌的检测方法

沙门氏菌的检测方法（精选9篇）

沙门氏菌的检测方法 第1篇

1 常规方法

从病料中分离培养为基础的常规方法。对这种方法的相关研究较多[6]。虽然该方法是迄今为止最确实的方法, 但由于沙门氏菌常在肠系膜和膜淋巴结中而不在肠腔中出现等原因, 故排泄到粪中去的细菌可以是间歇的和低密度的, 所以有时必须重复分离并采取大量样品在增菌肉汤中培养。此外这种常规方法为确诊而进行的细菌学鉴定需要几天才能报告结果, 因此该方法不够简便、准确和快速。

传统的沙门氏菌检测方法的改进内容主要集中在选择性培养基的择取上。如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸, 使中性红指示剂变红的生化特征, 在分离培养从中加入丙烯乙二醇、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D呋喃半乳糖, 可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行, 使沙门氏菌检测所需时间从常规方法的4~6d缩短至2d;采用Salmosyst培养基进行增菌后, 在Rambach培养基上进行分离培养, 可实现对沙门氏菌的快速检测, 大大减少了检测中所需培养基种类, 同时培养过程全部在37℃下进行, 操作简便。

2 应用免疫酶标技术

目前已有应用ELISA对猪沙门氏菌抗体进行检测的报道[7]。

张艳红通过试验确定了快速检测肠炎沙门氏菌的竞争ELISA方法 (C-ELISA) 。目前正在研制肠炎沙门氏菌特异性单克隆抗体Hgm, 两株单抗联合使用将会更准确地检测肠炎沙门氏菌[8]。杨爱萍的试验结果表明, 单抗直接ELISA法灵敏度高, 特异性强, 可避免人为因素造成的假阴性, 且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品。检测时间比传统方法大为缩短, 为加快产品流通提供了方便与可能[9]。黄玲, 孟冬丽等所作的自动酶标免疫测试仪 (miniVIDAS) , 检测的特点是只要沙门氏菌存在于增菌培养基, 不需纯培养, 即可检出, 具有省时、方便、灵敏、假阳性较少等特点。殷月兰, 潘志明等建立了利用竞争ELISA检测猪霍乱沙门氏菌抗体的方法, 其具有单克隆抗体的高度特异性和ELISA试验的高度敏感性。此外, 单抗竞争ELISA结果稳定性好, 可以标准化和自动化, 且可用肉眼判断。因此, 单抗竞争ELISA在实际检疫中具有推广应用的价值[11]。

目前建立和使用的多是间接ELISA, 该方法只能在检测某一血清型沙门氏菌抗体时较为有效, 在同时检测多种血清型沙门氏菌感染的抗体时则无能为力。

3 PCR技术

采用PCR技术, 国外有关这方而的报道也比较多[1214]。该方法比较灵敏和特异。但高费用的PCR试验以及较高要求的试验技术限制了该方法在实际中的应用。

PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性, 可先将靶DNA序列扩增, 增加DNA数量, 使其达到足够的检测量, 若反应以动力学为基础, 则能定量分析。1983年Millus和Cetus发明了最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法一聚合酶链反应即PCR法。在PCR反应中引入Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。

近年来, PCR及其相关技术得到了较大的发展, 产生了多种新的PCR方法[15]。如反相PCR (Inverse PCR) 、反转录 (RT-PCR) 、长距离PCR (long PCR) 、随机扩增多态性DNA技术 (RAPD) 等。另外将PCR技术与微孔板检测技术、ELISA技术、探针杂交技术等有机结合起来, 国内外都有不少报道。马立人等[16]将PCR与核酸探针技术相结合, 已制成生物芯片用以检测沙门氏菌。

PCR敏感性试验显示, 该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA;当沙门氏菌和大肠杆菌按不同比例混合后, 直接ELISA方法和PCR方法的检测比较试验结果显示, 在沙门氏菌比大肠杆菌为1:100时, 用ELISA法和PCR法均能检测出阳性样品, 在沙门氏菌比大肠杆菌为1:1000时, 用ELISA法检测为阴性, 而用PCR法则能检测出。

可见, PCR法较ELISA法的敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单, 对检样品要求不高, 检测时间更短, 只需3~4h。但费用高、操作复杂。操作中的残留污染易导致假阴性和假阳性, 而且需要专用仪器设备, 对基层检验人员来说可操作性较差。

4 核酸探针的应用

4.1 核酸探针

将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记, 加入已变性的被检DNA样品中, 在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链, 从而达到鉴定样品中DNA的目的, 这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子称为核酸探针或基因探针。

4.2 核酸探针的类型

根据核酸探针中核苷酸成分的不同, 可将其分成DNA探针或RNA探针, 一般大多选用DNA探针。根据选用基因的不同分成两种, 一种探针能同微生物全部DNA分子中的一部分发生反应, 它对某些菌属、菌种、菌株有特异性;另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应, 如编码致病性的基因组, 它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。

4.3 探针检测技术中存在的问题

检测一种菌就需要制备一种探针, 目前尚未建立所有致病菌的探针, 尽管检测速度快, 但要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养, 任何一种方法不可能有100%的特异性和敏感性, 所以必须考虑假阳性和假阴性的问题。

沙门氏菌污染量小, 常受应激损伤, 不易恢复, 现用检测方法得到阴性报告最少需4 d, 阳性报告还要延迟2~3d。研究检测沙门氏菌的探针难度大, 因为它拥有2 000多个血清型, Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针, 能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有1个细菌/25 g样品, 所以需要增菌培养。

5 沙门氏菌的其它检测方法

ISO-GRID检测系统是一种基于疏水性网膜 (HGMF) 的过滤系统。该系统通过使用这种含有1 600个小方格的滤膜, 来对微生物进行检测或计数。

首先, 稀释的样品通过5 um的不锈钢预过滤器过滤, 过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。

然后, 样品通过疏水的滤膜过滤。再将滤膜放在特异性的琼脂培养板上培养, 以检测目标微生物。培养完成后, 在膜上检测目标微生物, 并记录阳性区域的数量。

滤膜不会染上琼脂培养基的颜色, 从而很容易地区别微生物, 并进行鉴别和记数。此方法快速简便, 重复性好, 而且, 除沙门氏菌外, 还适用于大肠杆菌O157:H7、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。

沙门氏菌的检测方法 第2篇

文章编号：1003-1383(2011)03-0337-02 中图分类号：R 759.204.46 文献标识码：B

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2011.03.042

当前性传播疾病在我国日趋流行，其中尤以淋病的发病率较高［1］，已成为威胁公众健康的重要疾病。目前，临床上检测淋球菌的方法有很多且各有利弊，其中主要采用的是聚合酶链反应（简称PCR）和细菌培养法两种。本文对我院于2008年6月至2010年12月采用PCR和细菌培养方法检测淋病奈瑟氏菌的结果进行比较，现报告如下。

资料与方法

1.标本来源 2007年6月至2010年12月在我院妇科门诊和男性科门诊诊断为淋病患者188例。按所选择的检测方法分为PCR组和细菌培养组各94例。PCR组中男35例，女59例，年龄最小19岁，最大66岁，平均年龄39.8岁；细菌培养组中男34例，女60例，年龄最小18岁，最大69岁，平均年龄38.6岁；两组患者性别、年龄、治疗前病程比较差异均无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。

2.检测方法 荧光定量PCR试剂由深圳达安公司生产；细菌培养基及生化试剂由湖南长沙天地仁有限公司提供。两组患者由临床医生采集生殖道分泌物(女性:阴道分泌物或宫颈黏液；男性取尿道分泌物、前列腺液)。置于无菌试管送检验科分别进行PCR检测和细菌培养。检测方法严格按操作说明书进行。

3.统计学处理 两组阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

PCR组检出淋病奈瑟氏菌阳性84例，阳性率为89.4%；细菌培养组检出淋病奈瑟氏菌阳性46例，阳性率为48.9%。两组阳性率比较差异有统计学意义（χ2=36.004，P＜0.01）。

讨论

目前性传播疾病呈高发趋势，以淋病居多，位于非淋球菌尿道炎之后，居于第二位［2］。淋病是由淋病奈瑟氏菌感染引起，感染后引起泌尿生殖系统化脓性炎症。但因有60%为无症状的隐性带菌者（隐性淋病），不易觉察，危害性更大［3］。故对该病的准确诊断是指导用药并防止该病传播的关键。临床上检测淋病奈瑟氏菌的方法有多种，但最常用的是细菌培养法和PCR法。虽然细菌培养法是目前世界卫生组织推荐诊断淋球菌的“金标准”［4］，也是筛查和诊断淋球患者的主要实验室方法。但由于淋球菌对外界抵抗力低，生长条件苛刻，其检测敏感性受许多条件制约，且操作繁琐，等待报告的时间较长，尤其是不少患者在检测前已接受过非正规抗生素治疗，易产生假阴性结果，从而在一定程度上影响了培养法的检出率。

荧光定量PCR法检测属一种基因诊断技术，它是借助于一种DNA扩增技术，该法的敏感性和特异性高，对标本采集的要求不像细菌培养那么严格，同时它不管细菌是否存活都可以检测出来，即使患者用过抗生素后仍能准确检测其结果。本组资料显示，采用荧光定量PCR法检出的阳性率为89.4%，而细菌培养法的阳性率仅为48.9%，2种检测方法阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.01)。尽管采用荧光定量PCR方法成本较细菌培养方法要高，且操作过程复杂，但笔者认为，PCR方法应是目前临床上检测淋病奈瑟氏菌的最佳方法之一。

参考文献

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［2］秦倩倩，朱 昊，张丽芳，等.2003年全国性病流行病学分析［J］.疾病监测，2004，19(10):381-383.

［3］陈永锋，张木有.性病诊断治疗［M］.广州：广东科学技术出版社，1997：58-383.

［4］张卓然.临床微生物学和微生物检验［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2004:476-477.

(收稿日期：2011-03-16 修回日期：2011-04-29)

鸡沙门氏菌病的检测方法 第3篇

据统计, 目前世界上85%的食物中毒是由沙门氏菌引起的。而从家禽和禽产品中分离出沙门氏菌的报道, 比从其它动物中分离出沙门氏菌的报道要多。造成这个结果的部分原因, 是由于家禽中沙门氏菌感染的广泛流行。现代养鸡业日益国际化给沙门氏菌的传播创造了新的更为复杂的机会, 中国的情况比较复杂, 家鸡养殖规模大小差别较大、水平参差不齐, 沙门氏菌感染的控制方法有限。随着生活水平的提高, 人们对食品安全越来越重视, 对人类食品安全构成潜在威胁的鸡沙门氏菌感染的控制。在未来一段时间内, 鸡沙门氏菌病将被认为是主要危害养殖业的几种疾病之一。随着养鸡业的日益发展, 沙门氏菌的诊断和防治工作就显得尤为重要了。现在对沙门氏菌的检测比较先进的技术包括以下几种:

1 快速酶触反应及代谢产物的检测

快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶, 按酶的特性, 选用相应的底物和指示剂, 将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化, 确定待分离的可疑菌株, 反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。

2 免疫学方法检测沙门氏菌抗原或抗体的技术

2.1 抗血清凝集技术

随着抗体制备技术的进一步完善, 尤其是单克隆抗体的制备, 明显提高了细菌凝集实验的特异性, 可用于沙门氏菌的分型和鉴定, 如以沙门氏菌属特异单抗HRP标记抗体为核心试剂直接ELISA试验, 为沙门氏菌检验和诊断提供了新技术。

2.2 乳胶凝集技术

将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上, 通过抗体与相应的细菌抗原结合, 产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培育物, 再将培养物与致敏乳胶反应。

2.3 酶联免疫测试技术

酶联免疫技术的应用, 大大提高了检测的敏感性和特异性, 现已广泛地应用在沙门氏菌的检验。

2.4 荧光抗体检测技术

沙门氏菌的检测方法 第4篇

【关键词】 宋内氏志贺氏菌；食物中毒；检测

文章编号：1004-7484（2013）-12-7054-01

2012年9月16日，在建湖县某镇私立幼儿园，发生一起107名儿童食物中毒事件。中毒经过：9月14日中餐红烧鸡腿和瓜汤，9月15日中餐是炖蛋和瓜汤，9月16日是肉皮烧蛋糕和瓜汤。三天的腰餐都是饼干和白开水。全园276名儿童均在园内吃腰餐，107名患儿有47名在园内吃中餐，占43.93%，12名在园内订奶，占11.21%。9月15日晚9点30分，首发病例以突然发烧39℃以上，伴呕吐、腹泻就医，脓血便，镜检：脓细胞>15、吞噬细胞十，建湖县人民医院诊断为菌痢。以后同样发病患儿相继就医，于16日达高峰，经统计共发病107例（男59例，女48例），中毒率为38.8%，经补充电解质及抗生素治疗，病程4、7天全部治愈。9月16日，60名病儿及老师及食堂工人肛拭子进行细菌学检查，分离出6例均为宋内氏志贺氏菌。患儿年龄3-7岁。主要症状为腹泻、腹痛、发热、排稀水样便或粘液样便症状，呕吐1-4次，少数头晕，外周血中白细胞总数明显增高，在（10.5-25.0）×109/L之间，中性粒细胞74-86%，其他分类无特殊改变。经流行病学调查、现场卫生学调查及实验室检测，证实这起食物中毒事件由宋内氏志贺氏菌引起。检查结果如下。

1 材料与方法

1.1 樣品来源 食堂的刀面、砧板、餐、饮具、玩具表面采样10份，均保存于营养肉汤中送检；园内自来水、浅井水样、食用油、腰餐饼干、剩余食物共7份；病人肛拭子60份样品。

1.2 试剂 SC增菌液、GN增菌液、碱性蛋白胨水培养基、SS、WS、4号琼脂、TCBS、EMB、营养琼脂、血平板、高盐三糖铁及肠道杆菌生化管由杭州天和微生物有限公司提供，API20E生化板条为法国梅里埃公司生产，宋内氏志贺氏菌诊断血清购自兰州生物所，以上均在有效期内使用。

1.3 分离方法 1份粪便标本，59份肛拭子标本。将10份标本（每份标本两根棉签）其中一根直接划线接种SS平皿为A1组，再将另一根分别接种SC及GN增菌液中培养为A2组。另一组50份肛拭标本直接接种SC、GN增菌液中增菌为B组。将17份物表及可疑食物标本接种SC、GN增菌液中培养为C组。以上各标本培养物均按肠道致病菌检验步骤进行分离鉴定^[1]。

2 结 果

2.1 检验结果 饼干、1份玩具、砧板及小碗、汤匙、小茶杯表面菌落总数超标，浅井水大肠菌群超标，物表及剩余食物均未分离出致病菌。60例病儿及老师腹泻物、肛拭子标本细菌学检查，分离出6例均为宋内氏志贺氏菌（5例幼儿和一名老师），所有样品均未检出沙门菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌。

2.2 细菌鉴定

2.2.1 培养特点 在液体培养基中，呈均匀浑浊生长，没有菌膜，无沉淀。在SS平板上可见较大、扁平、较不透明菌落。挑取可疑菌落接种于3%氯化钠三糖铁斜面，结果为：斜面不变，底层变黄不产气，不产硫化氢。

2.2.2 革兰染色 镜检为革兰阴性无芽胞小杆菌。

2.2.3 噬菌体试验 噬菌体裂解模式：Sh裂解、E裂解。

2.2.4 生化鉴定 生化反应结果：动力、硫化氢、产气、枸橼酸、尿素、苯丙、靛基质、赖氨酸、VP、乳糖、木糖均阴性，鸟氨酸、甘露醇、棉子糖、MR、ONPG阳性。2API 20E生化板条鉴定结果：6份肛拭子标本检出的细菌其生化谱完全一致，均为0104102（id=99.9%，T=0.86）。

2.2.5 血清分型 按卫生防疫细菌检验^[2]，将上述分离菌株接种于3%氯化钠营养琼脂斜面培养24h，用志贺氏菌4种多价血清做玻片凝集试验，凝集良好++++，再用单价血清做玻片凝集，宋内氏血清凝集良好。

3 讨 论

由于本起食物中毒患者年龄小，易感性强，发病急聚，许多患儿采样前已用药，6例阳性病例均为用药前标本，用药前标本检出率高，宋内氏志贺氏菌直接划皿检出率高于增菌检出率。这可能在患者急性期的肠道内病原菌大量繁殖而正常菌群受到影响，直接划皿病原菌呈优势生长，挑选病原菌菌落并不难。试验证明GN增菌液对肠道内多数杆菌无明显抑制作用，通过GN增菌肠道内的非致病菌大量繁殖，这些非病原菌运动活泼，争氧性强，而宋内氏菌无动力，所以在增菌液的表面，非病原菌占优势，而在我们划皿时往往挑取增菌液表面生长物接种平板。故非病原菌在平板上呈优势菌落；②直接划皿比通过增菌后划皿的检出结果快近1d。取直接划皿的典型菌落做血清学凝集试验，在6份标本培养后的菌落做血清凝集试验，其凝集出现的时间，颗粒性状等完全一致，说明菌体抗原特征相同。

幼儿园食物中毒屡见不鲜，这次事件中，饼干、玩具、砧板及餐饮具表面菌落总数超标，浅井水大肠菌群超标，其中一名教师检出宋内氏志贺氏菌。建议大力加强卫生知识宣传，重视食品污染和危害，重视教师和炊事人员的培训，炊管人员的自身健康必须达到标准要求，禁止带菌者上岗。制定严格的食品管理制度，严格规范操作。幼儿园室内要通风，地面、桌面、门把手、玩具等物表做好日常消毒^[3]。杜绝此类食物中毒事件的发生。

参考文献

[1] 中华人民共和国国际标准.食品卫生检验方法微生物部分[S].北京：中国标准出版社，1994.

[2] 何晓青.卫生防疫细菌检验[M].北京：新华出版社，1989：479-503.

沙门氏菌的检测方法 第5篇

1 材料与方法

1.1 菌株

甲型副伤寒沙门氏菌 (CMCC50093) 、乙型副伤寒沙门氏菌 (CMCC50094) 、鼠伤寒沙门氏菌 (CMCC50115) 和猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种 (ATCC13312) 标准菌株均购自广东微生物研究所微生物菌种保藏中心;大肠杆菌 (CVCC1490) 和金黄色葡萄球菌 (CVCC1884) 购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂Premix Taq混合液、琼脂糖凝胶回收试剂盒。

1.3 引物设计

根椐已发表的沙门氏菌inv A基因核苷酸序列, 设计了一对特异性引物:F:5'-TCG CAC CGT CAA AGG AAC CGT AAA GC-3', R:5'-GCA TTA TCG ATC AGT ACC AGC CGT CT-3'。

1.4 菌株的PCR扩增

将上述非沙门氏菌标准菌株、沙门氏菌标准菌株分别接种营养肉汤, 37℃培养18~20 h。取1 ml肉汤于1.5 ml EP管中, 隔水煮沸10 min[4], 7 000 r/min, 离心10 min。取上清为模板进行PCR扩增, 反应程序为:94℃预变性3 min, 94℃变性1 min, 58.4℃退火40 s, 72℃延伸30 s, 进行30个循环, 72℃终延伸7 min。取5μl PCR产物进行电泳。

1.5 饲料中沙门氏菌的PCR检测

准备空白饲料16批, 其中全价料、浓缩料、预混料及原料各4批。分别取25 g饲料于225 ml的缓冲蛋白胨水中, 同时用标准菌株接种, 37℃培养7 h。取菌液制备模板, 按上述程序进行PCR, 并进行电泳。同时, 用国标方法进行检测。

1.6 自然感染饲料中沙门氏菌的PCR检测

取3批自然感染的饲料各25 g分别于225 ml的缓冲蛋白胨水中, 37℃培养18~24 h。取10 ml培养液入100 ml的亚硒酸盐胱氨酸 (SC) 选择性增菌液中培养24 h, 取培养液制备模板, 进行PCR扩增。同时, 用国标方法进行检测。

1.7 测序分析利用凝胶回收试剂盒将电泳产物进行回收, 将回收产物送大连宝生物进行测序。

1.8 PCR检测的敏感性试验

将甲型副伤寒沙门氏菌的液体培养物用灭菌的去离子水10倍倍比稀释, 每个稀释度分别制做模板进行PCR扩增。取能检出的最低稀释度进行倾注培养, 进行菌落计数, 以此来判断PCR检测方法的敏感性。

1.9 单菌落添加试验

取空白饲料样品25 g, 加入到225 ml的缓冲蛋白胨水中, 再添加1 cfu的沙门氏菌, 37℃培养24 h, 取10 ml的培养液至100 ml亚硒酸盐胱氨酸培养基 (SC) 中, 37℃培养36 h, 分别在24 h和36 h时取SC培养液制备模板, 进行PCR检测。

2 结果

2.1 沙门氏菌标准菌株的扩增

沙门氏菌的4种标准菌株均成功扩增出一条331 bp的特异条带, 与预期结果一致。非沙门氏菌的标准菌株进行扩增, 结果无特异条带。

2.2 阳性添加样品的PCR检测

对16批阳性添加饲料样品进行PCR扩增, 结果15批扩增出特异条带。国标方法同样只检出15批阳性。

2.3 自然感染饲料中沙门氏菌的PCR检测

经前增菌和选择性增菌的样品扩增出了特异性条带, 前增菌液不能扩增出特异条带。国标方法也检出阳性菌株。

2.4 PCR产物的测序结果

PCR的扩增产物经大连宝生物公司测序后, 用DNAman软件进行分析, 表明扩增产物与公开发表的inv A基因序列同源性达98%以上, 证明扩增产物即为沙门氏菌的inv A基因序列。

2.5 敏感性试验

将1株沙门氏菌的液体培养物进行10倍倍比稀释后, 进行PCR扩增, 结果显示, 本方法对沙门氏菌的最低检出限为5.2×104cfu/ml。

2.6 单菌落添加试验24 h和36 h的SC培养液

同时进行PCR扩增反应, 结果全部为阳性, 说明用此方法能够检出含1个拷贝的样品。

3 讨论

沙门氏菌的基因序列分析表明, 该菌属的不同沙门氏菌株的inv A基因核苷酸序列存在较高的同源性, 经BLAST检索未发现与其他生物有同源关系[5]。inv A基因是与沙门氏菌毒力及其侵袭作用相关的高度保守的一段序列[6,7], 可作为基因检测和鉴定的依据, 因此在本研究中选用该基因做为模板。

本研究应用PCR方法对饲料中的沙门氏菌进行检测。从结果来看, 该方法具有敏感性, 特异性和经济性[8], 可对样品的沙门氏菌进行有效的检测, 且具有省时省力等特点, 具有可操作性。对于阳性添加而未检出的样品, 分析有可能是一些饲料添加药物或酸化剂抑制了细菌的生长繁殖。同时, 从以上检测过程可以看出, 自然感染的样品需延长检验预增菌和选择性增菌的培养时间, 以很好地恢复其复制能力。在对样品的检测中, 如果感染量低, 在增菌培养后可对其菌液进行浓缩, 以使检测浓度达到104 cuf/ml数量级, 以便于能够用PCR检测。由于我国饲料标准规定沙门氏菌为不得检出, 本方法能够检测出单个拷贝的样品具有很重要的实际意义。

摘要：研究应用PCR技术建立饲料中沙门氏菌的快速检测方法, 根椐沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计1对特异性引物, 分别对4种沙门氏菌的标准菌株及2种非沙门氏菌株进行PCR扩增。结果:4种沙门氏菌均扩增出331bp的特异条带, 非沙门氏菌皆无特异条带, 特异性达100%, 敏感性达104cfu/ml。DNA序列分析证实, 所扩增片段为沙门氏菌的invA基因的特异性片断。本研究建立的沙门氏菌检验方法具有较高的特异性和灵敏性, invA基因的序列分析表明, 其基因序列较保守, 可以做为PCR检验的目的模板。

关键词：饲料,沙门氏菌,invA基因,PCR检测

参考文献

[1]Tirado C, and Schmidt K.WHO surveillance pro-gramme for control of foodborne infections and intoxica-tions:preliminary results and trends across greater Europe[J].World Health Organization, 2001, 43:80-84.

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[7]刘艳环, 苗利光, 刘晓颖, 等.沙门氏菌入侵因子基因保守序列的克隆和分析[J].特产研究, 2005, 4:1-3.

沙门氏菌检测方法研究进展 第6篇

沙门氏菌菌型繁多, 已确认的沙门氏菌有2 500个以上的血清型。繁杂的各类生化反应型, 使常规检验程序复杂繁琐、耗时费力, 不仅给检验部门带来沉重的负担, 而且还使生产部门产品运转和仓贮的时间延长, 费用增加。因此, 多年来, 建立快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。目前, 主要采用传统标准检测方法、分子生物学方法、免疫学方法等其它方法。

1 传统标准检测方法

用于检测沙门氏菌的传统方法是将食物样品分步增菌, 以增加病原菌的检出率。这种培养方法总体可分为三个不同阶段, 预增菌、选择性增菌及分离步骤。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7d, 才能得出明确的诊断结果。GB4789.4-94是目前我国规定的对畜产品中沙门氏菌的标准检测方法, 主要是根据沙门氏菌的生化特性, 进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤。在检测畜产品过程中, 应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。

2 分子生物学方法

2.1 核酸探针

目前, 检测沙门氏菌的属特异性沙门氏菌探针已从鼠伤寒沙门氏菌E23566菌株染色体DNA克隆成功, 并用于检测食品中沙门氏菌的存在。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入DNA-RNA杂交技术, 此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片断, 其敏感性高, 经大约48h增菌步骤后, 检测极限可达每毫升108个细菌, 但由于要使用放射性同位素, 只能在专门的实验室中进行, 因此阻碍了该方法的推广应用。为此, 以核酸杂交为基础的比色计技术目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖RNA (rRNA) 及核糖体发育过程中储存的核酸成分进行检测。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得无辐射检测成为可能, 同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。

2.2 扩增片段长度多态性技术

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, 简称AFLP) 技术方便快速, 实验结果既稳定又可靠。因此, 在微生物研究领域有着极为广泛的应用, 但以沙门氏菌为研究对象的报道还很有限。Aarts等人在对62个血清型的78株Salmonella菌株进行AFLP指纹分析时, 发现所有的血清型都具有独特AFLP指纹图, 并且AFLP指纹具有较高的分辨率, 可以区分其他方法无法区分的不同菌株。

2.3 PCR技术

Rahn等首先设计出一对引物, 用PCR检测沙门氏菌, 检出率为97%, 但许多肠道杆菌能同时扩增出来, 特异性较差。此后, 国内外许多学者进行了利用PCR技术检测沙门氏菌的研究。Nguyen等根据肠炎沙门氏菌C7克隆株具有的属特异性序列设计出一对引物, 能快速地检出肉食品标本中的沙门氏菌, 检测的敏感性和特异性均为100%, 保证了检测的准确性。此外, 我国卢强等将自己建立的PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌的方法用于食品样品中沙门氏菌的检测, 并结合辣根过氧化物酶直接标记基因探针技术和增强化学发光反应 (ECL) 技术对扩增产物进行Slot-blot杂交, 新建立了PCR-ECL沙门氏菌检测方法, 检测限可达10cfu/g, 是一种有前途的快速检测食品中沙门氏菌的方法。章新生等根据寡核苷酸序列合成一对引物用于沙门氏菌诊断, 并对其特异性和扩增产物进行了验证。黄金林等根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物序列, 成功扩增出495bp沙门氏菌特异条带, 而阴性对照则无此条带, 从而建立了应用PCR进行沙门氏菌快速检测的方法。汪琦等利用PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌。以全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉为实验对象, 人为添加沙门氏菌, 检测结果与传统培养方法系统检测结果一致。检出限为100cfu/25g, 准确性达100%。

2.4 基因芯片技术

Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙门氏菌抗原和毒力因子与其致病性的关系, 发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测。靳连群等利用基因芯片技术检测肠道中沙门氏菌等致病菌。结果显示制备的基因芯片能够检测出致病菌, 对于未知菌落利用基因芯片能够在3h完成对未知菌属的鉴定。

3 免疫学检测方法

3.1 酶联免疫吸附

1977年, Kryinski与Heimsch首次将酶联免疫吸附测定法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, 简称ELISA) 用于食品沙门氏菌的检测。相继许多学者都利用ELISA进行食品沙门氏菌的检测, 但他们使用的多价抗血清不同程度地存在交叉反应, 使ELISA产生假阳性, 在实践中有一定困难。上世纪80年代, 单克隆抗体技术问世并日趋成熟, 建立了抗沙门氏菌各种O抗原、H抗原单抗, 取代常规因子血清进行血清学鉴定、伤寒诊断、鸡白痢检疫, 并显示出单抗卓越的性能。我国焦新安等应用淋巴细胞杂交瘤技术获得了4株具有沙门氏菌广谱结合特性的单克隆抗体, 其中两株的反应互补, 对已检菌株覆盖率达99%, 而对其它受试肠杆菌均无交叉反应。文其乙等在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和de7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法, 并形成了快速检测试剂盒, 此外, 还应用直接ELISA方法对500份蛋品检测, 结果表明该方法可靠, 且阳性率比国标方法高。黎兆滚等使用ELISA技术, 对94份鱼粉样品增菌培养液检测沙门氏菌, 结果表明阳性符合率为92%, 阴性符合率为100%, 总符合率98%以上。

3.2 斑点酶联免疫吸附

斑点酶联免疫吸附 (Dot-ELISA) 试验是一项免疫学检测技术, 具有简单、快速、敏感、特异性强等特点, 并具有较高的可重复性。目前, 应用该法检测食品中沙门氏菌的报道很多。张红见等应用Dot-ELISA法对85份猪胴体进行了沙门氏菌的检测。结果表明, 在85份肉样中, Dot-ELISA检出沙门氏菌阳性65份, 阳性率为76.47%, 检测结果与常规方法一致。雷风应用Dot-ELISA法检测鱼粉85份, 对沙门氏菌最低检出量为每毫升400个, 沙门氏菌阳性检出率75.29%, 常规分离培养法阳性检出率为62.35%, 两者差异不显著。康明等应用Dot-ELISA检测鱼粉85份, 结果表明, 64份为阳性, 常规分离培养法53份为阳性, 两种方法差异不显著。由此可见, 该方法简便、特异、快速、结果直观, 便于在基层推广使用。

3.3 免疫磁性分离技术

由于食品检样常为固液多相混合体, 采用常规方法难以将少量致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术, 可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物, 节省时间。目前, 应用该法分离检验食品中致病菌也有一些相关报道。Skjerve等报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌, 其检测限为每克100个细菌。Mansfield等比较免疫磁性分离技术和常规方法从食品中分离沙门氏菌。他们用120种食物样品, 其中一半样品中加入低浓度的沙门氏菌。结果证实, 就选择性而言, 抗沙门氏菌磁珠和增菌方法中最有效的亚硒酸盐选择性培养基一样有效。值得强调的是, 免疫磁性分离技术能捕获受损伤的靶细菌, 而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。

3.4 免疫荧光标记

Munron应用自动荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌, 每小时能检测到120个玻片样品, 与常规试验比较, 准确率达96%。Kyrinr和Heimarch用荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌, 该系统可同时检测14个样品, 并且结果可靠, 操作简单。Cloak等利用表面吸附将检测样品吸附于载于玻璃表面的一种薄膜上, 然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。该方法检测限为每毫升103-5个沙门氏菌, 且不呈现假阴性与假阳性反应。

3.5 自动酶标免疫检测仪

全自动荧光酶标免疫分析仪方法对沙门氏菌的检测鉴定结果比较成熟, 并已先后被美国FDA、AOAC、USDA等部门认可, 我国学者也有相关研究报道。寇运同等利用自动荧光酶标分析系统快速检测出口动物性食品中沙门氏菌, 结果表明, 其灵敏度高, 操作简便, 大大缩短检验周期, 可用于检验出口动物性食品中沙门氏菌。陶军等利用法国生物—梅里埃公司提供的“自动酶标免疫检测仪”与常规培养法对冻肉中沙门氏菌进行检测, 指出该仪器最大特点是对被检细菌不需要纯培养, 只需在增菌培养基中即可检出。黄玲等利用自动酶标免疫测试仪和国标方法检测食品中沙门氏菌, 结果表明, 该法具有灵敏度高、无传染危险、检测速度快等特点。陈炜等运用自动荧光酶标分析仪和国家标准方法分别对同一种脱水蔬菜样品中沙门氏菌进行检测, 并对检测结果进行对比, 运用自动荧光酶标分析仪检测脱水蔬菜中的沙门氏菌灵敏度高、速度快, 完全满足检验检疫系统快速检测需要。

4 其它检测方法

4.1 噬菌体裂解试验

噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。Thal-Kalings对1181株沙门氏菌和323株其它菌株进行沙门氏菌噬菌体O-I裂解试验, 结果表明沙门氏菌裂解率为99.5%, 而非沙门氏菌裂解率为0.3%。截至到1973年, Keils及Seeliger等人通过大量观察证实, 沙门氏菌属内裂解率在95.0%～99.6%之间, 属外误差为0%～2.33%之间。何晓青等发现一种肠杆菌科分属诊断噬菌体, 其鉴定沙门氏菌只要6分钟, 加上培养菌落时间只需2天。张碧波等应用噬菌体快速检测沙门氏菌, 对100个肠杆菌菌株进行噬菌体O-I裂解试验, 30株沙门氏菌全部为阳性, 而其余非沙门氏菌株全部为阴性, 与前人研究结果一致。由此可见, 应用沙门氏菌噬菌体O-I对沙门氏菌进行检测方便可靠。

4.2 葡萄球菌A蛋白协凝试验法

Staphylococcal Protein A简称SPA即葡萄球菌A蛋白。目前, 国外已将SPA用于沙门氏菌的快速检验, 所用的葡萄球菌菌株多为CowanⅠ株。国内应用该法检验食品中沙门氏菌报道很少, 曹同雪等采用SPA协凝试验法检测100个肉样中的沙门氏菌, 结果表明该法快速、准确、灵敏度高、检出率高、并且节省费用。

4.3 沙门氏菌污染肉的快速检验

本法是根据沙门氏菌等肠科杆菌具有产生内毒素的特点, 采用氧化呈色反应进行的快速检验。在被检肉浸液中, 若含内毒素, 加入的硝酸银使毒素氧化成氧化型毒素, 氧化型毒素和加入肉浸液中的美蓝牢固结合, 当再向肉浸液中加入高锰酸钾时, 美蓝不与高锰酸钾作用, 使肉浸液呈蓝绿色。

4.4 4-甲基伞形酮辛酯 (MUCAP) 试剂检测方法

该方法 (中华人民共和国进出口商品检验行业标准 (SN0332-94) 是利用其沙门氏菌具有其它各属细菌都不具备的产生辛酯酶的特性, 选用相应的底物和指示剂, 将其配制在相关的培养基中, 根据沙门氏菌反应后出现的明显颜色变化, 而确定待检可疑菌株。

4.5 电阻抗法

电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术, 已经开始应用于食品微生物检验。电阻抗法对食品中沙门氏菌检测已经通过AOAC认可, 相关报道很多。Donaghy和Madden应用阻抗法对动物蛋白制品及原料肉中沙门氏菌检测, 检出率等同甚至高于传统方法。Pless等分别用阻抗法和传统检测方法进行对照试验, 对250种食品样品进行检测。结果表明, 122种沙门氏菌阳性样品中, 用阻抗法检出119种, 传统培养法检出106种。Quinn等分别用传统培养技术与3种快速检测方法即阻抗法、基因探针法和沙门氏菌示踪法, 对禽类饲料及环境样品中沙门氏菌进行检测, 其中39.2%样品呈阳性, 实验结果为阻抗法检出38.4%, 传统培养法检出25.5%, 基因探针法检出28.9%, 沙门氏菌示踪法检出28.5%。阻抗法是几种方法中最少受到主观因素干扰的方法。我国陈广全等用电阻抗法检测食品中沙门氏菌。经与常规培养法进行比较, 对加入食品中的21种已知沙门氏菌属检测, 电阻抗法19个为阳性, 检出率在90%以上, 检测结果与常规培养法一致, 对于阴性结果能在48h内得出。实验结果表明电阻抗法能够快速、可靠地检测食品中沙门氏菌。

参考文献

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[7]章新生, 臧富妍.应用PCR技术检测沙门氏菌[J].中国兽医学报, 1999, 19 (2) :147～151.

布鲁氏菌PCR快速检测方法的建立 第7篇

本研究通过设计引物, 优化条件, 建立了可以快速准确地检测布氏菌属的PCR方法。

1 材料

1.1 菌株

1.1.1 布鲁氏菌菌株

B.abortus 544A和104M;B.melitensis:Rev-1和16M;B.Suis S2和1330S;B.canis RM6/66;B.ovis 63/290;B.neotomae 5K33标准株, 由中国预防医学科学院流行病学微生物所布病室提供。

1.1.2 其他菌株

Y.enter O9来源与布氏菌相同, E.coli O157:H7和S.typhimriecm 47729由本室保存。

1.2 引物

按B.abortus 31 KD (BCSP-31) 蛋白基因设计P1、P2引物, 由大连Ta Ka Ra公司合成。

1.3 实验试剂

4 d NTP、Taq酶、RNA酶、蛋白酶K为Promega公司生产, 国内分装, SDS、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、氯化钠、Tris、EDTA等试剂均为国产分析纯。

1.4 主要仪器

PCR仪 (PTC-WOTM型) , JM In C., 高速台式离心机 (TGL, 16G) , 上海安亭离心机厂产品;电泳仪 (DYY-3型) , 北京六一仪器厂产品;紫外透射反射分析仪 (WP型) , 永嘉上塘教学仪器厂产品;凝胶自动成像系统, 英国UVA公司产品;可调式恒温水浴箱, 美国PA-LYST HUBER公司产品, 空气浴摇床 (HZS-H) , 哈尔滨市东联电子技术有限公司产品;恒温培养箱 (DHP-120) , 上海实验仪器总厂产品;微波炉 (HR-8805T) , 青岛海尔微波制品有限责任公司产品;移液器 (P2-1000) , 法国洁尔森公司生产。

2 方法

2.1 细菌DNA提取

2.1.1 煮沸法

各菌株培养物以三馏水制成菌悬液, 经100℃煮沸10 min, 12 000 r/min, 离心10 min, 取上清即可用于PCR扩增反应。

2.1.2 酚提法

各菌株培养物加入ST液, 制成菌悬液, 然后加入Na Cl液、TE液、SDS、RNA酶、蛋白酶K处理, 再加入重蒸饱和酚、氯仿异戊醇、再经乙醇沉淀等步骤即可备用。以紫外分光光度计测DNA含量。

2.1.3 试剂盒法

该试剂盒为Promega公司生产, 按照说明进行提取。

2.2 反应程序

总反应为25μl体系, buffer2.5μl, 4 d NTP 1μl (10 m M) , B4、B5引物 (10 pmol/μl) 各1μl, DNA 1μl (96.7 ng/μl) , 双馏水17.5μl, 瞬间离心煮沸10 min, 加入Taq E、液体石蜡。95℃作用5 min, 进入循环, 93℃变性30 s, 62℃退火30 s, 72℃延伸1min, 共计30个循环, 然后72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳, 电压3~5 V/cm, 时间20~30 min, EB染色观察结果。PCR操作在PTC-100型PCR扩增仪上进行。

3 结果

3.1 3种DNA提取方法的比较

我们用煮沸法、酚提法和试剂盒提取法从104M菌株提取DNA进行试验, 其结果见图1, 由图1可见3种提取方法对B4、B5引物扩增结果影响不大。

3.2 Taq E对扩增的影响

以煮沸法从104M菌株提取的DNA为模板, 用不同Taq E量 (0.1 U、0.2 U、0.3 U、0.4 U、0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0 U) 进行扩增, 结果表明0.5 U以上均可以扩增, 0.4 U以下未见扩增, 1 U酶量最佳, 故在以后试验中均采用1 U酶量。

3.3 Mg2+浓度对扩增的影响

Mg2+浓度对PCR反应是有影响的。其他条件固定, 观察0.2～10 mM/L的Mg2+浓度, 其结果表明低于0.2 m M/L不产生扩增, 高于8 m M/L产生非特异扩增。

注:1.MARKER DL 2000;2.煮沸法提取DNA;3.酚提法提取DNA;4.试剂合提取法提取DNA。

3.4 d NTP对扩增的影响

检测20、40、60、80、100、200、400、800μmol/L d NTP浓度的扩增效果, 结果表明在40~400μmol/L均有特异性扩增。

3.5 扩增的特异性

对6个种的布氏菌株扩增和对非布氏菌种的扩增结果见表1, 对6种布氏菌的扩增结果见图2, 由图2表明, PCR对6个种均能扩增。对阴性对照菌的扩增见图3。

注:1.Re v-1;2.S2;3.104M;4.1330S;5.16M;6.544A;7.DL2000 Mar ker;8.阴性对照。

结果表明104M阳性对照有扩增, 未加模板阴性对照无扩增, 而Y.enter O9、S.Typhi及E.Coli.O157均无扩增。

3.6 反应的敏感性

以104M菌株DNA为模板, 将其稀释成不同剂量, 使其每微升含96.7、9.67、0.967、0.096 7、0.009 67、0.000 967、0.000 096 7 pg以引物扩增, 其结果见图4。

图3为特异性扩增注:1.Y.ent er O9;2.S.Typhi;3.104M阳性对照;Mar ker DL2000

注:1.Mar ker DL2000;2.96.7 pg;3.9.67pg;4.0.967pg;5.0.0967 pg;6.0.009 67 pg;7.0.000 967 pg;8.0.000 096 7 pg。

4 讨论

通过对B.abortus 31 KD (BCSP-31) 蛋白基因引物对6个种布氏菌进行PCR扩增试验, 其结果显示, 对布氏菌扩增具有良好的特异性。该引物对6个种布氏DNA都有清晰的扩增, 而对布氏菌有相同抗原、且具有强烈交叉反应的Y.enter O9、S.Typhi及E.Coli O157扩增反应呈阴性。尤其指出的是Y.enter O9菌与布氏菌属细菌血清交叉反应不仅滴度高, 而且是多方位的, 用各种血清学方法都不能区别, 本试验可以将其二者进行区别。

在对布氏菌DNA扩增敏感性检查看到, 最低可查DNA 0.096 7 pg/μl, 如果按每个细菌5 pg计算, 那么这对引物扩增的敏感性约为20个布鲁氏菌。同时在试验的过程中也出现了一些样品交叉污染, 出现了一些假阳性的结果, 因此在操作的过程中一定要注意样品污染的产生。

沙门氏菌的检测方法 第8篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年3月~2014年1月我院收治的118例拟诊为淋病患者或感染者, 患者均为已婚女性患者, 年龄24~36岁。

1.2 方法

分别采集女性宫颈口2.5cm左右位置及后穹窿分泌物, 略转动停留后取出, 装入干净食管, 留取中段尿, 1h内送检。取样时间应避开女性月经期。细菌培养法:取材后, 分别接种2个血琼脂平板和1个巧克力平板。将1个血琼脂平板置于35℃培养箱中, 需氧培养。另外2个平板置于35℃、体积比为6%的CO2培养箱中培养[2]。严格按照说明书操作, 对可疑菌落进行鉴定。直接涂片法:取材后, 立即涂片。自然干燥后进行革兰氏染色:结晶紫初染, 电液媒染, 丙酮乙醇驼色, 复红复染。油镜下观察, 红色或粉红色为淋病奈瑟氏双球菌, 呈现肾形对称分布。尿液淋球菌快速检测法:取材后, 经尿液淋球菌快速检测试剂盒进行检测。严格按照说明书操作, 判断阳性菌。PCR检测法:取材后, 经体外DNA基因扩增进行[3]。通过聚合酶链反应, 扩增DNA条带, 凝胶电泳后, 观察条带, 分析结果。严格按照试剂操作说明进行。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计学软件进行处理。计数资料采用百分率表示, 行χ2检验。P<0.05示差异有统计学意义。

2 结果

经不同方法对118例患者进行检查后, 结果如附表所示。结果表明, 以PCR法检测阳性率最高 (63.56%) , 其次为尿液淋球菌快速检测法 (45.76%) , 再次为细菌培养法 (38.14%) , 直接涂片法的阳性率为最低 (17.80%) 。同其他三种方法比较, P CR检测法阳性率最高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。

3 讨论

淋病是国内外最为常见的性传播疾病之一, 对人们的身心健康有着严重影响。淋病的病原体为淋病奈瑟氏菌, 位于世界性病构成比例中的第二位[4]。通常情况下, 淋病奈瑟氏菌多寄存于患者的泌尿系统、生殖系统中, 新生儿经产道时易感染[5]。当机体免疫能力下降的时候, 病菌会侵入血流经血液循环造成机体其他部位的化脓性炎症[6]。淋病是全世界范围内的流行广泛的性病之一, 有很强的传染性, 临床以发病急促为主要表现。临床诊断淋病以实验室检查为主要方法, 将分泌物直接涂片是各医疗单位最为常用的淋病初诊和婚检方法[7]。然而, 该方法阳性检出率较低, 发生漏诊和误诊的情况比较多。现阶段, 女性患者污染杂菌情况比较多见, 以形态判断失误情况较多。WHO推荐的诊断方法是细菌培养, 这也是诊断淋病的金标准, 然而其阳性率低, 需要检测的时间较长, 和操作技术有一定的关系, 容易受到培养条件、试剂等客观因素的影响, 使得结果存在误差[8]。

PCR技术对标本采集方面要求相对较低, 无论细菌死活都可以进行检测, 在一定程度上优于其它方法。而且PCR法有一定的放大作用, 可以克服临床标本少难以检测的问题。当然, PCR对实验条件的要求则比较高, 需要严格按照操作进行。PCR技术能够改善其他方法存在的不足, 达到较好的检测效果。本文研究结果显示, 以PCR法检测阳性率最高 (63.56%) , 其次为尿液淋球菌快速检测法 (45.76%) , 再次为细菌培养法 (38.14%) , 直接涂片法的阳性率为最低 (17.80%) 。同其他三种方法比较, PCR检测法阳性率最高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。可见, 不同检测方法对淋病奈瑟氏菌的检测灵敏度不同, 临床以PCR检测阳性率为最高。临床检测时, 需要根据实际情况, 选取适当的检测方法。

摘要：选取2012年3月2014年1月我院收治的118例拟诊为淋病患者或感染者, 分别采集女性宫颈口2.5cm左右位置及后穹窿分泌物, 经细菌培养法、直接涂片法、尿液淋球菌快速检测法、PCR检测法进行检测。比较4种检测方法的检测结果。结果以PCR法检测阳性率最高 (63.56%) , 其次为尿液淋球菌快速检测法 (45.76%) , 再次为细菌培养法 (38.14%) , 直接涂片法的阳性率为最低 (17.80%) 。同其他三种方法比较, PCR检测法阳性率最高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。不同检测方法对淋病奈瑟氏菌的检测灵敏度不同, 临床以PCR检测阳性率为最高。

关键词：淋病奈瑟氏菌,不同检测方法,效果评价

参考文献

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[7]By P, Papp JR, Schachter J, et al.Recommendations for the Laboratory-Based Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae-2014[J].MMWR Recomm Rep, 2014, 63 (RR-02) :1-19.

沙门氏菌的检测方法 第9篇

布鲁氏菌病（Brucellosis）病原是布鲁氏杆菌（Brucella），它是革兰氏阴性的兼性细胞内寄生菌，主要侵害动物的淋巴系统和生殖系统，可以引发世界范围内人和牲畜及野生哺乳动物的感染[3]。目前，流行病学、临床病理变化、细菌学和血清学等方法均能诊断本病[4,5]。血清学诊断方法有很多，包括平板凝集反应、试管凝集反应、虎红平板凝集反应、补体结合反应[6]、ELISA等，虽然上述方法均可检测布鲁氏菌病，但由于检测结果不够精确，存在假阴性可能，均不能适应现代快速检验检疫需求。实际临床操作时往往需要多种方法结合应用，成本较高，耗费时间。因此，寻求一种快速检测奶样布鲁氏菌的方法迫在眉睫，本文利用CTAB/Na Cl方法提取牛奶样品的布氏杆菌染色体DNA，以特异性引物进行套式PCR扩增，建立牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法，对奶牛感染布氏杆菌病进行普查和监测，为牛奶制品的食品安全监测提供新的技术手段。建立一种高效准确的布鲁氏菌诊断方法，为在实际生产中检测奶样中布鲁氏菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株

S2型猪布鲁氏菌疫苗株由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医实验室保存

1.2引物

根据Gen Bank中公布猪型布鲁氏菌外膜蛋白25 ku基因序列（Gen Bank登录号为：AM712381），应用Oligo 6.0软件设计2对引物。由上海生工生物工程有限公司合成。

外部上游OMP1:5’-CGTGCCGCAATACCCTC-3’

外部下游OMP2:5’-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3’

内部上游OMP3:5’-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3’

内部下游OMP4:5’-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3’

2 试验方法

2.1细菌培养

在布氏杆菌培养基平板上划线接种S2型猪布鲁氏菌，在37℃保温箱里放置24 h，挑取单菌落接种到液体培养基，37℃温箱培养OD600≈0.5。

2.2细菌计数

取50μL细菌培养物，以液体培养基进行连续10倍的倍比稀释，取10-5、10-6、10-7稀释的菌液各100μL均匀涂布于琼脂平板，置37℃温箱培养24 h，对各稀释度进行菌落计数。

2.3布鲁氏菌基因组的提取

参照邱昌庆等[5]和杜振昆等[2]报道的方法，应用CTAB/Na Cl[6]方法，并在此基础上加以改进。具体方法如下：取1 m L不同稀释度的布鲁氏菌奶样于离心管中，10 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，加100μL NET悬浮沉淀；加入100μL 24%SDS，置于80℃孵育10 min，冰上冷却3 min；在邱昌庆的步骤中提到了使用蛋白酶K和RNase A的终浓度为325μg/μL和75μg/μL，分别作用2 h。本研究将蛋白酶K和RNase A的终浓度都定为800μg/m L，置于50℃水浴2 h。加入预热至65℃的CTAB/Na Cl 300μL，置于65℃水浴锅中10 min。加入600μL酚-氯仿-异戊醇，颠倒混匀，10 000 r/min离心5 min，将上清液移入另一离心管中，加入600μL酚-氯仿-异戊醇，重复操作；在上清液中加入400μL的异丙醇，混匀，室温放置5 min,10 000 r/min离心10 min，弃上清液。用1 m L 70%的乙醇洗2次，混匀，l0 000 r/min离心2 min。加100μL无菌去离子水，溶解DNA。

2.4套式PCR扩增体系及循环参数

PCR一扩反应体系。10×PCR buffer 2.5μL,2.5 m M d NTP2μL，上下游引物各0.5μL，模板0.5μL;TAKARA Taq DNA聚合酶0.2μL；补水至25μL；循环参数为：PCR反应条件为95℃预变性5 min;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环，最后72℃延伸10 min。

二扩反应体系采用25μL反应体系，10×PCR buffer 2.5μL,2.5 m M d NTP 2μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL;TAKARA Taq DNA聚合酶0.2μL；补水至25μL；循环参数为：95℃预变性5 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,20个循环，最后72℃延伸6 min。

2.5套式套式PCR条件的优化

2.5.1退火条件的优化

选择8个温度进行优化，分别为46、47.1、47.9、48.8、50.1、51、52.6和54℃，其他条件按上述参数设置，进行套式PCR反应，确定最佳的退火温度。

2.5.2 d NTP最佳浓度优化

选取d NTP终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 mm,7个梯度，其他条件不变，进行套式PCR反应，确定最佳的d NTP浓度。

2.5.3引物浓度的优化

引物的终浓度分别为0.08、0.16、0.24、0.32、0.4、0.48、0.56和0.62μm，其他条件不变，进行套式PCR反应，确定最佳引物浓度。

2.5.4 Taq DNA聚合酶浓度优化

体系中Taq DNA聚合酶分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3μL，其他条件不变，进行套式PCR反应，确定最佳的Taq DNA聚合酶浓度。分别取4μL上样进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察扩增结果。

2.5.5敏感性试验

对菌液进行细菌计数，确定细菌数为8×106CFU/m L，然后利用奶样对菌液进行10倍连续稀释，分别取1 m L进行基因组DNA提取和套式PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪检测扩增结果。

3 结果

3.1 PCRCR条件优化结果

3.1.1退火温度的优化

最佳退火温度为50.1℃，结果见图1。

3.1.2 d NTP浓度优化

d NTP最佳浓度为0.2 mm(2μL），结果见图2。

3.1.3引物浓度优化

引物最佳浓度为各0.4μM(0.5μL），结果见图3。

M:DL2000 DNA marker;1:46℃；2:47.1℃；3:47.9℃；4:48.8℃；5:50.1℃；6:51℃；7:52.6℃；8:54℃

M:DL2000 DNA marker:1:0.05 mm;2:0.1 mm;3:0.2 mm;4:0.4 mm;5:0.8 mm;6:1.2 mm;7:1.6 mm

M:DL2000 DNA marker:1:0.08μM;2:0.16μM;3:0.24μM;4:0.32μM;5:0.4μM;6:0.48μM;7:0.56μM;8:0.62μM

3.1.4 Taq DNA聚合酶浓度优化

Taq DNA聚合酶最佳浓度为0.1μL，结果见图4。

3.2敏感性试验结果

应用上述最优的套式PCR方法，最佳退火温度50.1℃、d NTP最佳浓度为0.2 mm、引物最佳浓度为0.4μm、Taq DNA聚合酶最佳浓度为0.1μL，进行的敏感性试验检测布鲁氏菌的最少菌数为8 CFU/m L，结果见图5。。

M:DL2000 DNA marker:1:0.05μL;2:0.1μL;3:0.15μL;4:0.2μL;5:0.25μL;6:0.3μL

M:DL2000 DNA marker:1:10倍稀释奶样；2:102倍稀释奶样；3:103倍稀释奶样；4:104倍稀释奶样；5:105倍稀释奶样；6:106倍稀释奶样；7:107倍稀释奶样

4 讨论

在布鲁氏菌病研究中，用PCR的方法检测布鲁氏菌病始见于1990年，Fekete等[8]最早利用PCR扩增布鲁氏菌外膜蛋白基因。1997年首次将PCR应用于中国布病患者的诊断。Bosnakovsk等首次建立了牛乳中布鲁氏菌外膜蛋白（OMP)25 Ku套式PCR检测技术，试验结果表明，此方法具有较强的特异性，只扩增布鲁氏菌DNA。据Lucer报道也有人用其他的布鲁氏菌基因区设计引物进行试验，均能特异性地检测到布鲁氏菌核酸。

鉴于此国内外学者开展了利用PCR方法检测布鲁氏菌的研究。2005年邱昌庆等[7]通过扩增布鲁氏菌外膜蛋白建立了套式PCR检测奶样中布鲁氏菌，其检测的灵敏度为50 CFU/m L。本研究根据邱昌庆发表的奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术的提取DNA方法的基础上优化了提取DNA的步骤。在邱昌庆的提取DNA步骤中提到了使用蛋白酶K和RNase A的终浓度为325μg/μL和75μg/μL，分别作用2 h。本研究应用CTAB/Na Cl，并且将蛋白酶K和RNase A的终浓度都定为800μg/m L，共同作用2 h，提取DNA效果较好，然后对套式PCR条件进行了优化，优化后套式PCR的灵敏度8 CFU/m L，证明本研究建立的方法结果可靠，灵敏度高，节省成本，节省时间。本研究为以后实际生产中检测奶样奠定基础。

参考文献

[1]Aleixo M J,erreira M L,Antunes F.Brucellosis[J].1999,12(12):323-330.

[2]杜振昆,郭军庆,张妙仙,等.牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法的建立[J].浙江大学学报,2008,34(2):169-174.

[3]何明清.畜禽传染病的防治[M].成都:四川科学技术出版社,1985:167-168.

[4]Mantur B G,Mangalgi S S,Mulimaig B.Burcella melitensis-a sexually transmissible agent[J].Lancet,1996,347:1763.

[5]Ruben B,Band J D,Wong P,et al.Person-to-person tras-mission of burcella melitensis[J].Lancet,1991,337:14-5.

[6]孙耀贵,黄姜生,陈佳.三种血清学方法检测奶牛布鲁氏杆菌病的比较试验[J].黑龙江畜牧兽医,2005(1):42-43.

[7]邱昌庆,曹小安.乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究[J].中国兽医科技,2005,35(2):85-89.