改性几丁质范文（精选5篇）
改性几丁质 第1篇
关键词：念珠菌性包皮龟头炎,改性几丁质喷雾剂,氟康唑片,治愈率,复发率
念珠菌性包皮龟头炎是由念珠菌感染引起的一种常见皮肤病,表现为包皮龟头起疹伴分泌物增多,伴有瘙痒及灼热感,临床特点为难根治,易复发。近年来,多方面因素导致了该病出现增多的趋势。该病治疗方法有多种,包括口服抗真菌药、外用抗真菌制剂等。但许多药物及治疗方法因存在疗效不确切、停药后易复发、药物毒副作用大以及导致耐药和菌群失调等问题,临床应用受到限制或逐渐被淘汰,故对于该疾病须寻求一种高效安全的治疗方法。近年来,我科采用口服氟康唑片联合改性几丁质喷雾剂外用对众多念珠菌性包皮龟头炎患者进行治疗,并设对照组进行治疗前后对比观察、分析,取得了满意疗效。现报道如下:
1 资料与方法
1.1 一般资料
我科选取2010年9月~2011年10月在皮肤性病门诊就诊男性患者52例,年龄22~48岁,病程为1周至半年不等。所有入选患者均符合念珠菌性包皮龟头炎的临床诊断标准———临床表现为包皮内板、龟头潮红,龟头可有红色小丘疹,包皮内板及冠状沟表面可覆有白色奶酪样膜状物;自觉不同程度瘙痒及烧灼感;真菌涂片镜检示念珠菌阳性(镜下可见假菌丝或芽生孢子)。就诊前均未使用口服抗真菌药等进行正规治疗。治疗前详细询问病史,了解一般身体状况,并予行肝肾功能等血生化检查,同时行梅毒(RPR)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、艾滋病病毒(HIV)抗体及单纯疱疹病毒(HSV)抗体等性病相关检查。
有以下情况之一者不予入选:肝肾疾病伴肝肾功能不全;严重糖尿病;长期服用抗生素、糖皮质激素或免疫抑制剂(或)伴免疫功能不全;合并艾滋、梅毒、生殖器疱疹等其他性传播疾病并在包皮或龟头部位有皮肤黏膜损害者。
1.2 治疗方法
将52例患者随机分组,其中试验组27例,对照组25例。两组一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。两组均给予氟康唑片(商品名:康锐,扬子江药业集团有限公司)治疗,用法为150 mg每周1次,晚餐后即服,连续2周;同时每日予温水清洗并拭干患处。试验组同时给予改性几丁质喷雾剂(商品名:令皮欣,南宁嘉嘉诺科技有限公司),连续每日在清洗后外用治疗1次。2周后复诊查看疗效,并复查肝肾功能指标。对于治愈者,在停药2个月后分别观察复发情况。此外,治疗期间禁止性生活,并禁止饮酒。做好性伴随访,如性伴同时伴有念珠菌性阴道炎等妇科感染性疾病,亦同时予以相应治疗。
1.3 疗效判定标准
痊愈:皮损全部消退,自觉症状消失,真菌镜检阴性。显效:皮损消退≥70%,自觉症状显著改善,真菌镜检阴性。有效:皮损消退≥30%,自觉症状略好转,真菌镜检阳性。无效:皮损消退<30%,自觉症状无明显改善,真菌镜检阳性。治愈率=(痊愈+显效)/总例数×100%。未愈=有效+无效。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件对所得数据进行分析,计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组近期疗效比较
试验组痊愈17例,显效8例,有效2例,无效0例;对照组痊愈17例,显效3例,有效2例,无效3例。两组治愈率比较差异无统计学意义(χ2=0.85,P=0.356>0.05),可见两组患者都取得了较满意的近期疗效。见表1。
2.2 两组治愈患者复发情况比较
治愈患者2个月后复发情况显示:试验组的复发率明显低于对照组,差异有统计学意义(χ2=4.86,P=0.027<0.05)。见表2。
2.3 不良反应
治疗期间,所有患者均未出现胃肠不适、皮疹等不良反应,复查肝肾功能指标亦未见异常。
3 讨论
念珠菌性包皮龟头炎是由念珠菌感染引起的一种常见真菌性皮肤病,约占所有包皮龟头炎的1/3[1],其中大部分致病菌为白色念珠菌。临床表现为包皮内板、龟头潮红,包皮内板及龟头冠状沟处可有白色奶酪样斑片,龟头可有针头大小淡红色丘疹,伴有异味,严重者可出现包皮水肿及糜烂。自觉症状可有局部烧灼感及瘙痒等。皮损处取材涂片行真菌镜检可找到念珠菌形菌丝和侧生芽生孢子组成的假菌丝体[2]。此病难根治,易复发,原因之一是多数患者包皮过长,龟头包皮内板和冠状沟长期处于温暖潮湿环境,使包皮垢的排泄延缓,念珠菌对龟头的黏附性增加,增加了感染的机会[3]。另一原因则是此病容易通过性接触传播。研究表明,男性与患有阴道念珠菌病的女性发生性接触,其生殖器感染率高达69%[4],且许多患者常于性交后反复发作。近年来该病有逐年增加的趋势,除上述原因外,还与滥用广谱抗生素、滥用糖皮质激素引起生殖器部位微生态环境改变而使局部菌群失调有关。
念珠菌性包皮龟头炎的治疗方法有多种,包括口服抗真菌药、外用抗真菌乳膏剂、洗剂以及包皮环切术等。但其中存在不少缺陷,如一些方法疗效不确切,部分药物毒副作用较大,部分药物易产生耐药及导致菌群失调,手术方法具有创伤性并存在一定风险等。
氟康唑为三唑类抗真菌药,具有广谱抗真菌作用,是一种较理想的口服抗真菌药。其作用机制为特异性地与真菌细胞色素P450依赖酶色素环上的铁结合,使之失去酶活性,从而影响真菌的甾醇(麦角固醇、真菌细胞膜的主要成分)合成,此外还抑制细胞色素氧化酶与过氧化酶,使菌内过氧化物大量积聚造成菌体死亡[5]。现该药在皮肤浅部真菌病治疗中广泛应用,对念珠菌性包皮龟头炎也有较好疗效,并且毒性低,副作用发生率低,耐受好。患者单用该药短期疗效较好,但有时远期效果不佳,容易复发。此外,该药对克柔念珠菌天然耐药,且光滑念珠菌等非白念珠菌对唑类药物耐药性正逐年上升[6]。故必要时须考虑联合用药治疗。
近年来,改性几丁质喷雾剂作为一种新型的外用溶液剂,正日渐广泛应用于临床,可用于治疗多种疾病。它的主要成分和功效如下:(1)改性几丁质:从深海贝壳中提取的一种生物活性物质,又名甲壳素,具有独特的双向免疫调节作用,易与机体亲和,易吸收利用,对皮肤黏膜无刺激性和毒性,具有止血止痛、杀菌消毒、促进创面愈合作用。(2)聚维酮碘:有机碘,其作用机制是隔离并杀灭多种病原体的活性基因;其独有的分子膜构型比软膏剂、霜剂更能快速透过作用表面,比溶液剂黏附力强,速效长效相结合。聚维酮碘有高效广谱杀菌作用,对细菌、真菌、芽孢、病毒都有较强的杀灭作用,缓慢释放碘,作用持久,毒性小,无刺激性,不受血液、脓液、肥皂和局部组织p H值的影响[7,8],故更适合包皮内板及龟头黏膜等部位的治疗。氟康唑片与改性几丁质喷雾剂联合应用,可迅速有效杀灭致病念珠菌,改善临床症状,并能有效抑制复发。此外由于该病易通过性接触传播,在诊治中做好性伴告知、随访和同治也是一个不可忽视的重要环节[9]。
综上所述,氟康唑片联合改性几丁质喷雾剂用于治疗念珠菌性包皮龟头炎疗效理想,安全可靠,复发率低,无严重副作用,适合在临床开展。
参考文献
[1]Dockerty WG,Sonnex C.Candidal balanoposthitis:a study of diagnostic methods[J].Genitourin Med,1995,71(6):407.
[2]Drayton GE.Onychomycosis[J].Current Treatment Options in Infectious Disease,2001,3:237.
[3]杜耀武,焦来文,李钰.激光包皮环切术联合氟康唑治疗念珠菌性包皮龟头炎43例疗效分析[J].岭南皮肤性病科杂志,2007,14(2):88-93.
[4]陈在贤.实用男科学[M].北京:人民军医出版社,2006:168.
[5]赵辨.临床皮肤病学[M].3版.南京:江苏科学技术出版社,2001:123-125.
[6]祝建军,叶金艳,杜玉海,等.复发性外阴阴道假丝酵母菌病的病原真菌学与耐药性研究[J].中华医院感染学杂志,2008,18(2):287.
[7]刘军.改性几丁质喷雾剂治疗外耳湿疹疗效观察[J].中国当代医药,2009,16(1):76.
[8]吕金霞,王明志.改性几丁质喷雾剂治疗术后尖锐湿疣疗效观察[J].中国现代医生,2010,48(17):159-160.
从甲壳类动物下脚料中获取几丁质 第2篇
甲壳类动物壳体中含有的一个关键组分就是被称为几丁质的一种糖类聚合物物质。研究开发出了一个可生产生物源聚合物的综合性生物提炼平台,为获取几丁质,该平台利用微生物降解甲壳类动物的壳体,免除了使用任何化学品的需求。然后通过使用酶而获得糖类,而该糖类可进一步分解成化学工业和聚合物工业所感兴趣的化学成分。该方法不仅为海产品行业节省了处置加工废物所需的成本,还开辟了一个可能的新收入来源。单单在欧洲每年必须加以谨慎处理的甲壳类动物壳体就有成千上万吨,由于可能影响到环境的毒性风险而必须花费成本进行处理。( 中国渔业装备与工程科技信息网)
改性几丁质 第3篇
1 材料
土样,分别采自江阴长江沿岸泥样、树林土壤。
几丁质粉,购自上海研域生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯,市购。
富集培养基:几丁质细粉3 g/L、Mg SO40.6 g/L、K2HPO40.6 g/L、KH2PO40.4 g/L、Fe SO40.02 g/L,p H值7.0,121℃灭菌20 min。
分离培养基:几丁质胶体3 g/L、KH2PO40.4 g/L、Mg SO40.6 g/L、K2HPO40.6 g/L、Fe SO40.02 g/L、琼脂20 g/L,p H值为7.0,121℃灭菌20 min。
优化培养基:几丁质细粉12 g/L、Fe SO40.01 g/L、K2HPO40.6 g/L、KH2PO40.4 g/L、蛋白胨5 g/L、Mg SO40.6 g/L、酵母膏6 g/L、Zn SO40.01 g/L,p H值为7.0,121℃灭菌20 min。
2 方法
2.1 胶体几丁质的配制
将5 g细粉几丁质(过100目筛)放入200 m L烧杯中,加丙酮40 m L,充分浸润2 min;缓缓加入HCl100 m L,充分搅拌至糊状,停放3 h后,边加边搅拌入装有1 000 m L冷水的烧杯里面;静置,胶体几丁质析出后将胶体几丁质离心收集,用去离子水冲洗;然后把收集的胶体几丁质用纤维细纱过滤到1 000 m L去离子水中,至p H值达到5.4左右。检测胶体几丁质浓度(0.5%),灭菌,备用[5]。
2.2 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)的配制
称取酒石酸钾钠182 g,在500 m L温水(温度低于60℃)中溶解,再加入3,5-二硝基水杨酸6.3 g、Na OH 21 g、苯酚5 g、Na2SO35 g,溶解均匀后冷却,定容至1 000 m L,保存于棕色试剂瓶,静置1周后使用。
2.3 标准曲线的制作(DNS法)
采用N-乙酰氨基葡萄糖作为标准品,根据参考文献[6]的方法(DNS法)制作标准曲线。
2.4 酶活性的测定(DNS法)
采用DNS比色法测定还原糖,以胶体几丁质作为底物,将0.5 m L纯化水和0.5%胶体几丁质1.0 m L、100μL酶液(取发酵液,3 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液)混合组成反应体系,37℃水浴30 min,沸水浴5 min中止反应;加入1.5 m L DNS试剂,沸水浴5 min,冷却至室温,然后离心,取上清液进行测定。采用等量被灭活的酶液为空白,测定样品在535 nm处的吸光度,然后根据N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线来计算酶活性。酶活性定义:在37℃条件下,每分钟转化底物(胶体几丁质)生成1μmol还原糖要消耗的酶量定为一个活力单位(U)。
2.5 菌株的筛选及鉴定
将1 g土样加入50 m L富集培养基中,于30℃、200 r/min培养1 d,然后取富集培养液样品上清液,用无菌水稀释10~105倍;然后取5个稀释倍数的样品各0.2 m L,分别涂布到筛选培养基平板上,30℃培养5~7 d,观察菌落周围是否有透明圈产生。选择能产生透明圈且透明圈较清晰的菌落测定直径,根据透明圈大小初步确定菌株产几丁质酶的能力。
菌种鉴定采用分子生物学和生理生化鉴定相结合的方式。将筛选出的目标菌株提DNA后,利用细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,扩增结果委托生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司进行测序。测序结果在NCBI数据库上进行基因比对。对比对结果采用XEGA和Clustalx软件构建属于该菌株的系统进化树。根据以上分子生物学的鉴定结果,结合伯杰氏细菌鉴定手册同时进行形态、生理生化指标的测定。
3 结果与分析
3.1 产酶菌株的筛选及鉴定结果
见图1、表1。
筛选到产透明圈较大的菌株5株,选取产生透明圈最大(透明圈直径为76 mm)、最稳定的一株命名为HF-3。该菌落呈圆形凸起,为乳白色,有黏液,在光学显微镜下观察菌体形态为直杆状。根据Biolog细菌鉴定系统,菌株HF-3的基因序列与地衣芽孢杆菌相似性可达100%,结合该菌的生理生化特征,参照伯杰氏手册,判定该菌株属于地衣芽孢杆菌。
3.2 菌株HF-3几丁质酶发酵条件的优化结果
3.2.1 培养温度对产酶的影响
接种基础培养基,其他培养条件不变,分别考察不同的培养温度(22,26,30,34,38,42℃)对酶活性的影响,具体结果见图2。
由图2可见,培养温度为34℃时菌株的酶活性最高,高于或低于该温度时菌株产酶能力大大下降;因此,选取菌株培养温度为34℃。
3.2.2 接种量对产酶的影响
在以上温度优化的基础上,研究了不同接种量(1%、3%、5%、7%、10%)对酶活性的影响,结果见图3。
由图3可见,接种量为5%时所产的几丁质酶活性最高,为1.26 U/m L,提高或者降低接种量酶活性力均降低;因此,选取5%的接种量。
3.2.3 碳源对产酶的影响
在上述接种量优化的基础上,分别以胶体几丁质、粉末几丁质、玉米粉、羧甲基纤维素、菊粉、羧甲基纤维素钠作为碳源,加入量均为10%,其他成分保持不变,测定对酶活性的影响,结果见图4。
由图4可见,由于胶体几丁质在溶液中的分散度更好,较粉状几丁质的诱导产酶效果更好,而玉米粉、羧甲基纤维素、菊粉等能诱导产生的几丁质酶较少;因此,选用胶体几丁质作为碳源。
3.2.4 表面活性剂对产酶的影响
在上述碳源优化的基础之上,考察添加不同表面活性剂(0.1%)对几丁质酶酶活性的影响,结果见图5。
由图4可见:添加吐温类表面活性剂对产酶有明显的促进作用,其中吐温-80的作用最为明显,最高活力达到1.58 U/m L;吐温-20对产酶也有一定的促进作用,而添加十二烷基硫酸钠(SDS)则严重抑制几丁质酶的产生。
4 结论
注:SDS为十二烷基硫酸钠。
1)采用透明圈法,从长江沿岸泥浆、森林泥样中筛选到几丁质酶活性较高的一株菌,透明圈直径达76 mm,命名为HF-3。根据菌落形态、生理生化特性和16S r DNA序列测定,判定该菌为地衣芽孢杆菌。
2)菌株HF-3优化后的产酶条件:发酵温度为34℃、接种量5%、碳源胶体几丁质、表面活性剂吐温-80,优化后酶活性可达1.58 U/m L。
参考文献
[1]张灿,黄德智,李丰硕,等.海洋产几丁质酶菌株的筛选及发酵条件优化[J].吉林农业大学学报,2010,34(2):141-146.
[2]BENECKE U.Bacillus chitinovorus,eien chitin zersetzenden spaltpilz[J].Bot Ztg,1995,63:227-231.
[3]FLACH J,PILET P E,JOLLES P.What’s new in chitinase research[J].Experientia,1992,48(8):701-716.
[4]邓红梅,毕方铖,叶炬斌.几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究[J].化学与生物工程,2010,27(5):62-65.
[5]KANG S C,PARK S,LEE D G.Purification and characterization of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus,Metarhizium anisopliae[J].J Invertebr Pathol,1999,73:276-281.
改性几丁质 第4篇
几丁质 (N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物) 是病原真菌细胞壁的主要成分, 几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质, 使病原真菌细胞壁中的几丁质降解;破坏细胞新物质的沉积, 致使病原体死亡, 且所产生的细胞壁碎片具有诱导作用, 可激发寄主植物的抗病反应[1]。植物几丁质酶具有广泛的生理活性[2], 尤其在植物抗病方面具有重要作用[3]。
研究发现几丁质酶参与植物的发育调控:植物几丁质酶基因的表达具有组织特异性, 参与了植物的发育调控。如几丁质酶参与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共生作用:几丁质酶可以降解固氮菌的结瘤因子, Minic等研究苜蓿中的几丁质酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几丁质酶通过控制结瘤因子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡, 而不产生过量的根瘤。此外, 几丁质酶对结瘤因子的降解具有专化性, 可能是决定根瘤菌的寄主专化性的因素之一[5]。本研究旨在通过构建几丁质酶表达载体制备几丁质酶, 用于抗真菌等方面的相关研究。
2 材料与方法
2.1 实验材料
人参由吉林农业大学基因工程实验室培育。大肠杆菌菌株为DH5-α, 原核表达载体p ET-28a (+) 、BL21均是由吉林农业大学生命科学学院基因工程实验室保存。质粒小提试剂盒、Ex Taq酶、solution I连接酶、限制性内切酶、分子量标准DL-2, 000购自大连宝生物公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 等均购自北京鼎国生物公司。植物基因组DNA小量提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒及清洁试剂为美国Axygene公司产品。引物和测序均由上海生工公司完成。
2.2 实验方法
2.2.1 人参Gchi1基因扩增
按Gen Bank中人参Gchi I基因序列 (Gene ID:DQ532359) 及p ET-28a (+) 原核表达载体的多克隆位点设计特异引物, 并在引物两端分别加酶切位点。上游引物序列为5'CAA TTAgg A TCCATg g CA TCT CAT TTg TCg 3’, 含有XhoⅠ酶切位点 (下划线) 。下游引物序列为5'CTA TATCTC g AgTCA CAC ATC g CT CTT g AT3’含有Bam HⅠ酶切位点 (下划线) 。采用上述引物进行PCR扩增反应, 以人参c DNA为模板, 反应程序如下:94℃预变性8分钟;94℃变性30秒, 62℃退火30秒, 72℃延伸30秒, 35个循环;反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.2 人参Gchi1基因原核表达载体的构建
将纯化后的PCR产物用Xho I及Bam HI进行双酶切, 同时对p ET-28a (+) 质粒进行双酶切, 然后进行去磷酸化处理, 构建重组载体p ET-28a (+) -Gchi1。将此重组载体转化感受态大肠杆菌, 筛选阳性克隆并进行PCR及酶切鉴定, 将鉴定后质粒送至上海生工公司完成测序鉴定。
2.2.3 目的蛋白的诱导表达及检测
将含有表达载体p ET-28a (+) -Gchi I的大肠杆菌振荡培养至OD600=0.6时, 加入终浓度分别为0.4、0.6、0.8和1.0 m M/L的IPTG。30℃, 200 rpm/min振荡培养, 诱导表达5h后, 离心收集菌体, 菌体以含0.2mg/ml溶菌酶和10 m M DTT的磷酸钠缓冲液 (20 m M, p H 7.2) 悬浮, 反复冻融4次, 以超声波破碎后的样品离心, 收集上清液进行PAGE检测。
2.2.4 目的蛋白活性鉴定
目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定, 将锈腐菌接种到PDA培养基, 使其在25℃下生长1周左右。用直径1cm沾有上清液的滤纸放到菌丝边缘, 以沾有无菌水的滤纸为对照, 一周之后观察生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大小确定菌株是否诱导表达几丁质酶, 以及所产几丁质酶的活性。
3 结果
3.1 人参Gchi1基因扩增及重组表达载体p ET-28a (+) Gchi I的鉴定
经PCR扩增的Gchi1基因片段经过1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果图1A显示能够扩增出897bp大小的特异核酸片段与预期相符。将构建的重组载体进行酶切鉴定后, 能够获得约897bp的大小的条带与预期结果相一致, 结果见图1B。将菌落PCR及双酶切检测均呈阳性的p ET-28a (+) Gchi I质粒进行测序, 测序结果表明p ET-28a (+) Gchi I重组载体构建正确, 且具有正确的读码框。
A:Gchi1基因PCR产物凝胶电泳M1:DL2000 Marker, 1.阳性扩增产物2.阴性对照B:p ET-28a (+) Gchi I质粒双酶切鉴定M2:DL2000Marker, 3.Bam HI和XhoⅠ双酶切鉴定4.p ET-28a (+) Gchi I重组质粒
3.2 目的蛋白的诱导表达及检测
在E.coli BL21 (DE3) 中, 经IPTG诱导, 相对于未诱导菌株对照, 经SDS-PAGE分析表明p ET-28a (+) -Gchi I经不同浓度的IPTG诱导后, 均可明显表达约34KDa的特异蛋白, IPTG浓度为0.6 mol/L时, 表达效果最佳。
M:蛋白Marker, 1-2:未诱导的重组质粒3:0.4mol/LIPTG诱导4:0.6 mol/LIPTG诱导5:0.8 mol/LIPTG诱导6:1.0mol/LIPTG诱导
3.3 表达蛋白对真菌的抑制作用
重组E.coli BL21 (DE3) 菌株经0.6mmol/L IPTG诱导表达之后, 经透明圈法测定, 沾有无菌水的A C E滤纸处锈腐菌正常生长, 沾有粗酶液的B D F滤纸处锈腐菌生长受到抑制, 表明表达蛋白对锈腐菌有一定的抑制效果 (图6) , 提示本研究表达几丁质酶具有抑菌活力。
A C E含无菌水的滤纸, B D F含表达蛋白液的滤纸
4 讨论
植物几丁质酶具有广泛抗细菌、真菌、抗虫等生物学作用。Class III类几丁质酶大多为兼具几丁质酶/溶菌酶的双功能酶, 可分解细菌细胞壁的肽聚糖, 对细菌产生影响。实验证明提纯的烟草、马铃薯、黄瓜。菜豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等的几丁质酶对20多种真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用, 如灰色葡萄孢Botrytis cinerea[6]、立枯丝核菌Rhizoctonia solani[7]、绿色木霉菌Trichoderma viride[8]、T.reesei[9]、串珠镰刀菌Fusarium solani等。在AM共生体中, 共生相关的几丁质酶能降解有丛枝菌丝释放的几丁质片段, 进而组织防御反应的诱导。Salzer等在讨论苜蓿菌根中由AM真菌特异诱导的Class III-2, Class III-3几丁质酶功能时, 认为菌根定殖后期阶段Class III几丁质酶的表达与植物防御反应的抑制有关, 几丁质酶水解真菌释放的诱导物, 使防御反应变弱, 从而促进AM真菌与寄主植物间共生关系的建立。本研究表达的Class III几丁质酶具有抑制真菌的活性功能, 可通过微生物发酵的方式获得大量活性抑菌几丁质酶物质。因此, 开展人参几丁质的基因工程研究对培育抗病植物品种, 提高作物抗病性具有重要意义。
摘要：几丁质 (N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物) 是病原真菌细胞壁的主要成分, 几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积, 激发寄主植物的抗病反应, 使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆, 构建原核表达载体pET-28a (+) -GchiI, 利用IPTG诱导表达, 经PAGE分析表明, 该基因表达的蛋白分子量为34kD左右, 其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑菌圈试验发现, IPTG浓度为0.6mmol/L时抑菌效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种, 提高作物抗病性具有重要参考价值。
关键词：人参,几丁质酶,基因,分析
参考文献
[1]陈崇顺, 朱雪峰, 郁志芳.豇豆几丁质酶纯酶液对不同真菌的作用[J].植物保护学报, 2000, 27 (4) :375-376.
[2]Ding Xuezhi, Luo Zhaohui, Xia Liqiu, et al.Improving the insecticidal activity by expression of a recombinant cry1Ac gene with chitinaseencoding gene in acrystalliferous Bacillus thuringiensis[J].Current microbiology, 2008, 56 (5) :442-446.
[3]Tokunaga Takaaki, Esaka Muneharu.Induction of a novel XIP-type xylanase inhibitor by external ascorbic acid treatment and differential expression of XIP-family genes in rice[J].Plant and cell physiology, 2007, 48 (5) :700-714.
[4]Kragh Karsten M, Hendriks Theo, de Jong Anke J, et al.Characterzation of chitinases able to rescue somatic embryos of the temperature-sensitive carrot variantts11[J].Plant molecular biology, 1996, 31 (3) :631-645.
[5]Fenino Elena.Genetic Dissection of Organellar-Translation-Dependent Retrograde Signalling in Arabidopsis[D].lmu, 2010.
[6]Pocock Kenneth F, Hayasaka Yoji, McCarthy Michael G, et al.Thaumatin-like Proteins and Chitinases, the Haze-Forming Proteins of Wine, Accumulate during Ripening of Grape (Vitis v inifera) Berries and Drought Stress Does Not Affect the Final Levels per Berry at Maturity[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2000, 48 (5) :1637-1643.
[7]Muthukrishnan S, Liang George H, Trick Harold N, et al.Pathogenesisrelated proteins and their genes in cereals[J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2001, 64 (2-3) :93-114.
[8]Mauch Felix, Mauch-Mani Brigitte, Boller Thomas.Antifungal hydrolases in pea tissue II.Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase andβ-1, 3-glucanase[J].Plant Physiology, 1988, 88 (3) :936-942.
改性几丁质 第5篇
1 研究内容
1.1 研究对象
随机选择2015年1月至2015年6月于保定市第一中心医院内分泌科住院的2型糖尿病患者90例。所有患者年龄41~65岁, 男性患者47例, 女性患者43例。T2DM诊断标准均符合世界卫生组织 (WHO) 1999年制定的糖尿病诊断标准。排除标准:排除1型糖尿病和特殊类型糖尿病者;糖尿病急性并发症者;恶性肿瘤、血液疾病患者;急、慢性感染者;肝肾功能异常、心脑血管病史者;近期有创伤、手术者。
1.2 临床指标
收集患者一般指标, 包括姓名、性别、身高 (m) 、体重 (kg) 、收缩压 (SBP) 、舒张压 (DBP) 、糖尿病病程, 并计算体质指数 (BMI) [BMI=体重 (kg) /身高2 (m2) ]。
1.3 血液指标检测
所有患者均在禁食8~10 h后, 于入院次日清晨服用药物前抽取肘中静脉血, 检测血清空腹静脉血糖 (FPG) 、空腹胰岛素 (FINS) 、糖化血红蛋白 (Hb A1c) 、总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、高密度脂蛋白 (HDL-C) 、低密度脂蛋白 (LDL-C) 、肌酐 (CREA) 、尿酸 (DA) 、血肌酐 (Scr) 及尿素氮 (BUN) 。计算胰岛素抵抗指数:HOMA-IR=FPG (mmol/L) ×FINS (m U/L) /22.5。检测患者血液中的IR (红细胞刚性指数) 。血清YKL-40的检测采用酶联免疫吸附试验法 (ELISA) 测定, 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司, 批内CV≤6%, 批间CV≤10%, 操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.4 下肢血管超声检测
全部患者均行下肢动脉血管形态及血流动力学检测。取仰卧位或俯卧位, 从腹股沟管起向下追踪两侧下肢动脉 (股总动脉、股浅动脉、腘动脉、胫前动脉、胫后动脉及足背动脉) 。检测血管内径、管腔内有无实性回声、充盈缺损、侧支血管的形成及最大血流速度。以多普勒超声检查到下肢动脉存在广泛性不规则狭窄或节段性闭塞或血管硬化或出现斑块或内膜厚度增厚, 作为下肢血管病变的标志。将所有患者分为单纯2型糖尿病组 (A组) 和2型糖尿病合并下肢血管病变组 (B组) 。
1.5 统计学方法
采用SPSS20.0软件进行统计学分析, 计量资料以x軃±s表示, 两组间均数的比较采用t检验, 计数资料采用χ2检验;各影响因素与YKL-40的相关性采用Pearson相关分析。下肢血管病变的相关因素采用多元Logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者一般临床指标比较
比较两组患者临床资料, B组患者年龄、糖尿病病程明显大于A组患者, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;A组与B组患者的BMI、性别、SBP、DBP水平无显著差异 (P>0.05, 表1) 。
2.2 两组患者血液指标比较
B组TG、YKL-40、Hb A1c、FPG、IR显著高于A组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;A组HDL显著高于B组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。两组间在TC、LDL、BUN、CREA、UA等方面相比, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 详见表2。
2.3 YKL-40与各影响因素的相关性研究
YKL-40与年龄、病程、TG、IR、FPG、Hb A1c呈正相关 (r=0.326、0.617、0.550、0.378、0.395、0.227, 均P<0.05) ;YKL-40与HDL呈负相关 (r=-0.247, P<0.05) , 详见表3。
2.4 Logistic回归分析结果
以是否存在2型糖尿病下肢血管病变为因变量, 以年龄、病程、TG、HDL、YKL-40等为自变量, 通过Logistic回归分析研究影响下肢血管病变的危险因素。结果显示, YKL-40、病程和TG为2型糖尿病下肢血管病变的独立危险因素 (β=0.275、0.820、1.878, 均P<0.05, 表4) 。
3 讨论
糖尿病下肢血管病变的主要病理改变为动脉粥样硬化, 主要由动脉壁上脂质颗粒的堆积和纤维化引起, 另外炎症和内皮功能障碍也参与了动脉粥样硬化。其临床主要表现为间歇性跛行、静息痛和缺血性坏疽等, 严重者可引发溃疡、肢端坏死, 严重降低患者的生活质量, 甚至导致患者死亡[5]。血管病变的发生和发展与机体本身炎症相关, 若早期发现存在高危血管病变的糖尿病患者, 可以很大程度改善患者当前的诊治情况。
血清几丁质酶3样蛋白1 (YKL-40) 是肝素与几丁质结合的糖化蛋白, 为哺乳动物甲壳酶样蛋白家族成员之一。YKL-40由不同炎症组织中的活化巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞分泌, 参与了炎症反应与血管反应, 可能在血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化形成中也起到一定的作用。在关于血管内皮功能障碍的研究中发现, 升高的YKL-40与细胞迁移、重组和组织重塑相关, 最终造成血管内皮受损[6]。体外实验研究发现, 从单层培养转化非增殖分化多层培养过程中合成YKL-40[7]。在细胞重组形成多细胞结节过程中血管平滑肌细胞继续分泌YKL-40, 这些细胞结节会重新表达, 且不同于血管平滑肌细胞的其它标志物。YKL-40 m RNA在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞内表达明显上调, 斑块中的血管内皮下浸满单核细胞, 随后脂质积累在活化的巨噬细胞中, 尤其是血管病变深处浸润的巨噬细胞YKL-40m RNA高表达, 并且在动脉粥样硬化病变早期的表达水平达到最高[8]。
本研究结果显示, 2型糖尿病患者下肢血管病变与增龄、糖尿病病程、TG、HDL、IR、FPG和YKL-40有关, 并且血清YKL-40水平升高是2型糖尿病患者下肢血管病变的独立危险因素。2型糖尿病下肢血管病变患者血清YKL-40升高的原因可能有以下几方面: (1) 血清YKL-40参与了血管炎性病变, 促使炎症处活化的巨噬细胞和中性粒细胞分泌YKL-40; (2) YKL-40与脂代谢有关, 且参与了动脉粥样硬化的发生与发展。此外, TG与糖尿病病程也是糖尿病下肢血管病变的危险因素, 这可能与长期的脂紊乱与高血糖所导致的动脉粥样硬化有关。
综上所述, YKL-40参与了下肢血管病变的发生与发展, 是2型糖尿病下肢血管病变的独立危险因素。对YKL-40作用机制的研究, 有助于为认识糖尿病下肢血管病变的病因机制提供新思路, 并为诊断下肢血管病变提供新的途径。
参考文献
[1]BONHAM PA, FLEMISTER BG, DROSTE LR, et al.2014 guideline for management of wounds in patients with lower-extremity arterial disease (LEAD) :an executive summary[J].J Wound Ostomy Continence Nurs.2016, 43 (1) :23-31.
[2]GUAN H, LI YJ, XU ZR, et al.Prevalence and risk factors of peripheral arterial disease in diabetic patients over 50 years old in China[J].Chin Med Sci J, 2007, 22 (2) :83-88.
[3]王椿, 余婷婷, 王艳, 等.糖尿病患者下肢动脉病变筛查及危险因素分析[J].中国糖尿病杂志, 2007, 15 (11) :643-646.
[4]KASTRUP J.Can YKL-40 be a new inflammatory biomarker in cardiovascular disease[J].Immunobiology, 2012, 217 (5) :483-491.
[5]THORUD JC, PLEMMONS B, BUCKLEY CJ, et al.Mortality after nontraumatic major amputation among patients with diabetes and peripheral vascular disease:a systematic review[J].J Foot Ankle Surg, 2016, 55 (3) :591-599.
[6]NISHIKAWA KC, MILLIS AJ.gp38k (CHI3L1) is a novel adhesion and migration factor for vascular cells[J].Exp Cell Res, 2003, 287 (1) :79-87.
[7]MILLIS AJ, HOYLE M, KENT L.In vitro expression of a 38, 000 dalton heparin-binding glycoprotein by morphologically differentiated smooth muscle cells[J].J Cell Physiol, 1986, 127 (3) :366-372.