低温保存范文（精选9篇）
低温保存 第1篇
关键词：犬,附睾,精子,低温保存
附睾在雄性动物生殖生理中具有重要作用, 它不仅是雄性动物生殖道的一部分, 而且和精子成熟有十分密切的关系。精子只有通过在附睾中的运输、贮存, 才能逐渐成熟, 获得运动、识别卵子透明带、与卵子结合的能力[1]。在最初的体外受精研究中, 普遍使用鲜精进行受精, 并获得优于冷冻精液受精的效果。Shalgi研究发现, 大鼠体外受精时附睾精子优于鲜精。此后学者们对猪、绵羊、水牛等的研究证明了附睾精子用于体外受精的可行性[2]。近年来, 学者对水牛、绵羊、野生梅花鹿 、家猫等动物的附睾精液品质进行分析及保存试验[3]。目前, 犬体外受精技术主要应用鲜精, 而未见到采用附睾精子体外受精及关于犬附睾精子保存方面的报道。因此, 试验以犬附睾为材料, 在对附睾各区段精液品质分析的基础上, 初步探讨了不同稀释液对犬附睾尾部精液的保存效果, 为进一步研究犬体外受精技术奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物
2009年5月末—7月末, 选择吉林省龙井市屠宰场提供的50只2～7岁肉用公犬进行试验。
1.2 附睾精子的采集
用灭菌剪刀将睾丸连包皮从睾丸基部处切下并扎紧切口, 放入保温瓶中保存。采用保温干储法将采集到的睾丸放在干燥保温瓶的内胆中, 30 min内运回实验室。在室温 (25～26 ℃) 条件下置于无菌手术盘中, 用灭菌剪刀将睾丸鞘膜和白膜剖开剪取附睾部置于无菌的100 mm玻璃平皿中, 用含双抗的生理盐水冲洗2～3次。分离附睾头、附睾体、附睾尾, 分别置于无菌的盛有2 mL生理盐水的35 mm的玻璃平皿中, 用无菌剪刀将附睾各段剪碎, 使精子充分游出, 采用注射器吸取2 mL生理盐水将输精管中的精子冲出。分别吸取精子悬液置于10 mL灭菌离心管中。
1.3 精液品质检查
观测精子密度、活率、活力、畸形率、顶体完整率及pH值。
1.4 精液的稀释与筛选
1.4.1 稀释液的配制
稀释液Ⅰ:柠檬酸钠3.00 g、卵黄20 mL、纯化水80 mL、青链霉素1 000 IU/mL。稀释液Ⅱ:Tris 2.40 g、柠檬酸1.30 g、果糖1.00 g、卵黄20 mL、双蒸水80 mL和青链霉素1 000 IU/mL。稀释液Ⅲ (自制配方) :Tris 3.04 g、柠檬酸1.68 g、果糖1.00 g、卵黄20 mL、双蒸水80 mL和青链霉素1 000 IU/mL。
1.4.2 稀释液的筛选
将每次采出的精液平均分为3份, 分别用稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ、稀释液Ⅲ进行稀释, 每4 h 观察1次精子活力, 重复10次。
1.5 精液的保存
精液稀释后每3～4 min 降低1 ℃, 缓慢降到4 ℃, 放入4 ℃冰箱保存。
1.6 统计分析
采用SPSS 11.0软件对试验数据进行统计分析。
2 结果
2.1 犬附睾各区段精液品质分析结果
试验组中附睾头、附睾体、附睾尾和输精管中的精子活率分别为 (11.91±3.70) %、 (12.20±3.63) %、 (39.70±4.01) %和 (23.84±3.47) %;精子密度分别为 (0.30±0.08) ×108个/mL、 (0.25±0.06) ×108个/mL、 (4.94±0.79) ×108个/mL、 (0.42±0.11) ×108个/mL。可见, 附睾尾的精子密度高于附睾头、附睾体和输精管, 差异极显著 (P<0.01) ;附睾尾的精子活率极显著高于附睾头、附睾体 (P<0.01) , 显著高于输精管 (P<0.05) 。附睾各区段的精子pH值、畸形率和顶体完整率差异不显著 (P>0.05) , 见表1。
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05) ;字母相同、大小写不同表示差异显著 (P<0.05) ;字母不同、大小写也不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.2 不同稀释液对犬附睾尾部精子活力及保存时间的影响 (见表2)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05) ;字母相同、大小写不同表示差异显著 (P<0.05) ;字母不同、大小写也不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
由表2可知:精子活力在0.6～0.7之间时, 稀释液Ⅰ稀释的精子活力下降较快, 保存时间为0.50～4.68 h, 平均为2.59 h;用稀释液Ⅱ稀释的精子保存时间为4.35～6.29 h, 平均为5.32 h;用稀释液Ⅲ稀释的精子保存时间为13.34～17.04 h, 平均为15.19 h。可见, 稀释液Ⅲ比稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ保存时间长, 差异极显著 (P<0.01) ;稀释液Ⅱ比稀释液Ⅰ保存时间长, 差异极显著 (P<0.01) 。精子活力在0.4～0.5之间时, 稀释液Ⅰ与稀释液Ⅱ的保存时间平均为11.90 h和16.25 h, 差异显著 (P<0.05) , 而稀释液Ⅲ保存时间平均为31.40 h, 与稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ相比差异极显著 (P<0.01) 。
3 讨论
3.1 对附睾各区段精子品质的分析
哺乳动物的附睾为精子成熟提供了特殊的微环境, 是精子成熟、保护、运输和贮存的部位, 在生殖过程中起重要作用。附睾上皮细胞的合成、分泌、转运等功能使精子发生了一系列结构、生化和功能的改变。从而使精子获得受精和运动能力。附睾各区段的精子在密度、活力、活率和运动特性等方面存在较大的差异。从表1的结果可知, 附睾尾的精子密度为 (4.94±0.79) ×108个/mL, 极显著高于其他区段;附睾头精子活力差, 主要以转圈运动为主, 越趋近于附睾尾部精子的活力和运动能力越强, 这与张世生等[2]在水牛附睾精子品质初步观察所得数据相似。试验中犬附睾各区段带有原生质小滴的畸形精子具有一定的比例, 导致精子畸形率偏高。张世生等[2]通过姬姆萨染色后观察顶体完整性时发现, 水牛附睾各区段精子的顶体完整率都在88%左右, 各区段差异不显著, 这与本试验所得结果相似。
3.2 对精液稀释液筛选的分析
在精子保存过程中, 稀释液具有为精子补充适量的营养和保护物质、抑制精液中有害微生物活动、延长精子寿命等作用。稀释液种类繁多, 不同动物的稀释液各不相同。张齐卉等[4]认为, 稀释液中用果糖代替乳糖效果较好。Gundogan M等[5]认为, 常等渗或稍高渗的介质比高渗更利于保护精子功能。适宜降低稀释液的pH值可以起到减慢精子代谢速度, 延长保存时间等作用。因此, 保存时稀释液要与正常精液的pH值相等或偏低。还有人认为, 采用Tris碱性缓冲液, 对代谢中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用。由于哺乳动物的精子在37～38 ℃的条件下运动速度快, 在稀释过程中, 稀释液温度应稍低于37 ℃, 以防止精液温度出现波动, 影响精液的保存。从不同稀释液对犬附睾尾精液的保存结果来看, 3种稀释液在精子活力为0.4～0.5时平均保存时间分别为11.9 h、16.25 h和31.4 h, 稀释液Ⅲ保存时间比稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ保存时间长19.50～15.15 h, 差异极显著 (P<0.01) 。稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ保存时间差异显著 (P<0.05) 。由于溶液成分的复杂性, 单一成分的影响不易说明, 也可能与试验条件、药品质量和精子采出后处理方式不同有关。稀释液Ⅲ在各项指标上均优, 可作为进一步研究的首选。
参考文献
[1]刘雅峰, 欧建平, 王琼, 等.附睾精子和睾丸精子妊娠结局比较[J].中国优生与遗传杂志, 2006, 14 (11) :100-101.
[2]张世生, 李跃民.水牛附睾精子品质初步观察[J].草食家畜, 2004, 122 (1) :43-45.
[3]库尔班.吐拉克, 高桥方幸.野生梅花鹿附睾尾精子冷冻保存的初步试验[J].经济动物学报, 2008, 12 (3) :128-130.
[4]张齐卉, 孙鹃, 李波, 等.细管冻精稀释液以果糖部分替代乳糖配方试验初报[J].云南畜牧兽医, 2006 (4) :1-2.
甘薯茎尖超低温保存技术研究 第2篇
关键词:徐薯18号;茎尖;包埋玻璃化法
中图分类号:S531.024 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0055-02
长期以来,甘薯的很多品种在推向生产后迅速退化,丧失新品种的优良种性,对甘薯的产量与品质造成极大影响[1],因而如何较好地收集和保存甘薯种质资源逐渐受到重视。目前常用的保护植物种质资源的方法都有着各自的局限性。众多的试验表明,超低温冷冻保存植物种质技术是较为理想的一种方法[2]。在超低温(一般指液氮低温,-196℃)条件下,几乎所有的细胞生长代谢活动都停止进行,而细胞发育成完整植株的潜能和遗传信息得以保存,更有利于保持遗传稳定性[3],且超低温条件能够将种质所感染的真菌和细菌病原物一并脱除,脱毒种质的再生苗在一定时期内没有病毒、细菌和真菌病害,其生活力特别旺盛[4]。包埋玻璃化法结合了玻璃化法与包埋脱水法两个超低温技术的优点,能在同一时间内处理大量材料且植物恢复生长较快,冻存植物茎尖不经愈伤组织而直接成芽,其发育成的植株无形态变异且有更高的成芽率,目前已成功应用于马铃薯和苹果[5,6]等多种植物。由于茎尖分生组织细胞分化程度小,比其它组织细胞培养物的遗传性稳定[7],是较为理想的超低温保存材料,因而本试验采用甘薯茎尖分生组织作为试验材料。
1 材料与方法
1.1 材料
徐薯18号,由山东省农业科学院作物研究所甘薯室提供。
1.2 方法
1.2.1 包埋及预培养 在6-BA添加浓度为0.5 mg/L的MS培养基上培养带芽茎段10～12 d,分别剥取大小为0.5、1.0～1.5、2.0～3.0 mm的茎尖。将茎尖移入2.5% Na-alginate溶液中,随后将茎尖连同Na-alginate溶液放入预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中,约20 min后形成小球(直径约4 mm)。包埋后25℃、90 r/min预培养。
1.2.3 玻璃化溶液脱水 将小球移入玻璃化溶液PVS中进行玻璃化处理,设计处理时间对比,分别为0、30、60、90、120、150 min。
1.2.4 冷冻保存 将小球快速置入液氮中,处理1 h。设置一组不经液氮处理的对照。
1.2.5 解冻及恢复培养 将盛有小球的超低温管快速转移到38℃的水浴锅中解冻3 min。将小球转移到1.2 mol/L蔗糖卸载溶液中,处理20 min。将小球移入成活培养基中,黑暗培养3 d,然后转到正常光周期培养7 d,置于电子显微镜下观察成活状况。
2 结果与分析
2.1 茎尖大小对存活率的影响
试验表明,1.0～1.5 mm大小的茎尖成活率可达到80%以上, 而0.5 mm和2.0～3.0 mm茎尖成活率则低于50%(表1)。1.0～1.5 mm大小的茎尖再生能力较高[8],且机械剥离操作较为方便简单。
2.2 玻璃化溶液处理时间对存活率的影响
玻璃化溶液即冰冻保护剂PVS,可以有效降低冰点,从而阻止植物体内冰晶的形成,减少细胞的失水,降低对植物组织的伤害。处理时间过短,则不能有效地降低冰点,易产生冰晶;而由于PVS本身具有较强的毒性,若处理时间过长,植物组织受毒害而死亡。试验结果(表2)表明,徐薯18号的最适宜处理时间为90 min,成活率达85%以上。
3 讨论
徐薯18号作为淀粉型甘薯品种在全国大面积应用,具有产量高、品质好、抗病性强、适应性广、增产潜力大等特点,既可用作鲜食品种,又可用作淀粉加工及燃料乙醇生产专用品种。作为北方主栽品种,无论是在生产力还是品质方面都有突出优势,有着较高的保存和研究价值,因而为本试验所采用。
超低温冷冻保存种质在多种植物中都早有研究,但在甘薯中的应用却鲜有报道。本试验针对不同品种,在操作过程中对其冰冻前的驯化、冷冻处理时间及其再生条件进行了优化组合配置,获得了较为适宜的配置条件。且本试验选用茎尖的分生组织为材料,细胞分化程度小,在再生过程中比其它组织细胞培养物的遗传性稳定,并有着更高的再生效率,更有利于种质的优良品质保存。
参 考 文 献:
[1] 李洪民,邢继英,马代夫,等.甘薯抗病毒种质资源的鉴定与筛选[A]. 中国甘薯育种与产业化学术研讨会论文集[C].成都,2005,17-21.
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[4] 安颖蔚,孟令文,张 辉.马铃薯脱毒及微型薯繁育技术体系的研究与应用[J].杂粮作物,2006,26(3):197-199.
[5] Hirai D, Sakai A. Cryopreservation of in vitro grown meristems of potato (Solanum tuberosum L.) by encapsulation-vitrification[J]. Potato Research,1999,42:153-160.
[6] Paul H,Daigny G,Sangwan-Norreel B S.Cryopreservation of apple (Malus×domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulation-vitrification[J]. Plant Cell Reports,2000,19:768-774.
[7] Kartha K K. Cryopreservation of plant cells and organs[M]. Boca Katon, Florida:CRC Press,1985,276.
不同低温条件保存血小板的效果 第3篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
依照计算机随机抽样法选取20份血小板标本, 均来自无偿献血人员, 每人采取外周静脉血液标本总量为200 ml, 所有无偿献血人员均为健康体检者, 献血前1 d未服用含有乙醇类饮品, 14 d内未使用抗凝血与抗血小板药物, 同时将伴有凝血障碍性疾病、出血性疾病、外周血血小板计数在150×109/L的人群排除;将收集好的静脉血液标本在室温条件下进行离心处理。
1.2 方法
(1) 选取离心机由长沙湘智离心机仪器有限责任公司提供, 型号为TG-20, 另外实验试剂与仪器还包括FASC Calibur流式细胞仪、MD192低温冰箱、分析软件。37℃循环式水浴箱、PHS-3C型p H计、MEK 6180K血细胞计数仪、LDH Elisa试剂盒等。 (2) 对血小板标本进行冻存, 分别置于低温冰箱 (A组) 与液氮 (B组) 中进行冷冻保存, 同时与新鲜的血小板标本 (C组) 进行对照, 将血小板标本分别置于PVC管内进行操作, 其中A组低温冰箱温度为-80℃。 (3) 对三组血小板标本均进行血小板复温与质量检测, 其中C组标本直接在室温下进行检测, 未经过冻存处理;A组与B组标本均连续保存2个月后进行指标检测。将血小板标本 (经过冻存) 取出后置于温度在-37℃的水浴箱内进行复苏, 并分别检测血小板标本的PLT、MPV、PDW指标值 (采用血细胞计数仪检测) ;检测血小板标本的p H (p H计) ;检测血小板标本的LDH浓度 (采用ELISA试剂盒进行酶标仪检测) , 检测血小板标本的CD62p与PS表达 (采用流式细胞仪进行检测) 。
1.3 评价指标
比较三组血小板标本的相关指标水平, 包括p H、PLT、MPV、PDW、LDH、PS阳性率、CD62 p阳性率。
1.4 统计学处理
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析, 计量资料用±s表示, 组间比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
A、B两组血小板标本分别与C组新鲜血小板标本的p H比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;另外, B组与C组血小板标本分别与A组标本的PLT、MPV、PDW、LDH、PS阳性率、CD62p阳性率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
注:与A组比较, aP<0.05
3 讨论
血小板的止血效果十分显著, 并广泛应用于临床各个领域当中。但是我国医疗单位目前面临血小板供给严重不足的现状, 其中较为常见的保存方法为22℃常温震荡法[1], 但是往往由于细菌感染、保存时活性丧失等因素导致血小板保存时间通常较短, 仅仅能够维持7 d左右。相关研究[2]显示, 我国每年有数百万的无偿献血者由于血小板保存不当被丢弃, 出现了极大的浪费, 因此如何有效保存活性的血小板成为临床上急需解决的问题。
将血小板置于温度-80℃的冰箱内或者液氮中可解决上述难题, 在此环境下细胞代谢受阻, 从而保证细胞可以长时间的保存[3]。但是从另一方面而言, 低温环境会使得细胞出现一定的损伤, 导致复温后细胞活性受到影响。有学者指出, 若给予低温保护剂将使得细胞低温受损的程度减轻, 利于血小板的长期保存。另外, 有关研究表明[4], 相比新鲜的血小板, 在低温条件下进行保存一段时间后再进行复温将有效增强膜表面黏附受体的结合能力, 提高促凝血活性, 止血效果明显。
本研究对C组血小板标本不进行低温保存, A组与B组血小板标本分别在低温冰箱与液氮条件下进行保存, 结果显示, A、B两组分别与C组p H比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;B组与C组分别与A组的PLT、MPV、PDW、LDH、PS阳性率、CD62p阳性率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
综上所述, 对血小板标本进行保存时, 选择低温冰箱或者液氮环境下进行标本保存均会在一定程度上对血小板质量造成损伤, 临床研究中应妥善选择。
参考文献
[1]刘国强, 丁慧芳, 路希敬, 等.深低温冻存自体血小板输注治疗恶性血液病化疗后血小板减少症的疗效和安全性[J].中华内科杂志, 2012, 51 (3) :188-191.
[2]刘国强, 丁慧芳, 路希敬, 等.深低温冻存自体血小板输注治疗恶性血液病化疗后血小板减少症临床观察[J].山东医药, 2011, 51 (33) :43-44.
[3]刘立坤, 李永乾.血小板添加液体外保存血小板质量的研究[J].河北医科大学学报, 2014, 35 (1) :105-107.
低温保存 第4篇
关键词：兔；精液保存；活率；顶体；完整性；质膜；精清留量
中图分类号：S82913+4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（201412-0243-02
精液超低温冷冻保存，对动物种质资源保护有重要作用。精液冷冻保存在牛、猪上都有比较成熟的技术方案，在生产实践上应用较广泛。但迄今为止，关于兔精液的冷冻保存研究相对较少，尚未形成完整的技术方案和技术突破。由于夏季气温较高，兔的受孕率不论是自然受孕还是人工授精都比春秋季大幅降低，给养兔业带来了较大的影响，因此研究兔精液超低温保存、形成完整的技术准则成为当前最迫切的研究任务。
1材料与方法
11材料
111仪器设备
电子天平、荧光倒置显微镜、电热恒温水浴锅、电热恒温干燥箱、CO2培养箱、离心机、液氮生物容器、冰箱、蒸汽灭菌器、双人单面净化工作台、超声波清洗仪、加热板、025 mL细管等。
112试剂
NaCl、Cl、Na2HPO4·12H2O、H2PO4、CaCl2、MgCl2、无水葡萄糖、二水柠檬酸钠、青霉素钾、硫酸链霉素、柠檬酸、甘氨酸、甘油、牛血清白蛋白、Tris。
113试验动物
江苏盐城正山兔业有限公司的1～2岁优质新西兰种公兔，体质健康，无繁殖疾病。试验兔单笼饲养，饲养温度24 ℃左右，湿度50%左右，每天光照12 h，定量喂食全价配合饲料，自由饮水。
12方法
121溶液的配制
PBS液（磷酸盐缓冲液的配制： NaCl 08 g，Cl 002 g，CaCl2 0013 2 g，Na2HPO4·12H2O 0289 8 g，H2PO4 002 g，MgCl2·6H2O 0012 1 g，加雙蒸水至100 mL，pH值调至72，022 μm滤膜过滤，4℃保存备用。
BTS液（常温保存液的配制：葡萄搪37 g，二水柠檬酸三钠06 g，乙二胺四乙酸二钠0125 g，NaHCO3 0125 g，Cl 0007 5 g，青霉素钠006 g，硫酸链霉素01 g，加双蒸水至100 mL，pH值调至72，022 μm滤膜过滤，4℃保存备用。
冷冻稀释液的配制：葡萄糖159 g，柠檬酸196 g，Tirs 352 g，青霉素钠006 g，硫酸链霉素01 g，甘油4%，卵黄20%，加双蒸水至100 mL，pH值调至621，022 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。
解冻液的配制：葡萄糖50 g，柠檬酸钠05 g，10%安钠咖5 mL，青霉素8万IU，硫酸链霉素10万IU，加双蒸水至100 mL，022 μm滤膜过滤，4 ℃保存备用。
PI染色溶液的配制： PI 005 g溶解于20 mL PBS液中，4℃保存备用。
DABCO防荧光淬灭剂的配制：甘油/PBS（9 ∶[G-3]110 mL、DABCO 0024 6 g，1 mL分装，4 ℃保存备用。
122精液采集
在采精器中注入温水并装上预热至35～37 ℃的集精管，将发情成年母兔放入公兔笼内，诱导公兔爬跨母兔，将阴茎导入母兔阴门处的采精器内，公兔射精后侧倒时迅速将采精器竖立拿出兔笼，弃去夹层中的温水，使精液全部流入集精管中。于 37 ℃下进行精液常规质量检查，选择无异味、乳白色、精子形态正常、活率在07以上、密度适中的精液用于试验。精子活率的检测方法：20 μL精液充入37 ℃预热的血细胞计数板上，显微镜下观察向前运动精子所占的比值即为精子活率。
123精液的预处理
1231离心前静置时间将采集的合格精液保存在37℃的保温瓶中，分别静置15、30、60、90 min。
1232离心速率分别以500、1 000、1 500、2 000 r/min的速度分别离心5、10、15 min。
1233精清留存量将离心后的精液分别按照精清与精子的体积比为0 ∶[G-3]1、1 ∶[G-3]1和1 ∶[G-3]2的量留取，然后用等温稀释液进行稀释。
1234稀释与平衡将符合要求并且经过预处理的精液按1 ∶[G-3]2的体积比与等温的稀释液混合，摇匀，放入5 ℃冰箱中平衡2 h。
1235冷冻精液的制备与解冻采用025 mL细管法进行冷冻，将装有精液的细管置于充分预冷广口冷冻容器内的管架上，距离液氮面3 cm，熏蒸10 min，然后投入液氮罐提桶内保存。解冻时，将细管取出后直接投入37 ℃温水中解冻45 s，用等温解冻液按体积比为1 ∶[G-3]10稀释，37℃水浴10 min。
1236精液品质检测指标及方法（1精子活率。取 10 μL 精液PI荧光染色法进行判断（死精子PI染色后呈阳性，活精子PI染色后呈阴性，置于载玻片上，盖上盖玻片，在 400×显微镜下评定精子活率。每次至少检查 200 个精子。计算公式：活率=未着色精子数/总精子数。（2质膜完整率。将解冻后的精液用果糖-柠檬酸钠低渗液（0675 6 g 果糖、0367 6 g二水柠檬酸钠溶于50 mL双蒸水中稀释，调整精子密度为 100万～200万spz/mL，37 ℃孵育 30 min，取 20 μL 精子悬液于血细胞计数板上，400×倒置显微镜观察，每次至少计数 200 个精子，计算弯尾精子的比率，计算公式：质膜完整率=弯尾精子数/总精子数×100%。（3精子顶体完整率。采用姬姆萨染色法测定，计算公式：精子顶体完整率=顶体完整精子数/总精子数×100%。
13数据统计
所有处理均至少重复5次，每次计数精子数不少于200个。采用t检验和方差分析法对试验数据进行统计分析，P<005为差异显著。
2结果与分析
3结论与讨论
试验结果表明，在稀释前将精液静置60～90 min可有效地使精子和精清接触，精子获得了对冷休克及冷冻损伤更强的抵抗力，静置时间太长可引起精清变质，从而对精子质量产生影响。同时，精子不运动也容易形成假死状态，静置时间过短，精子不能和精清充分接触，对冷休克和冷损失的抵抗能力较差。
以1 000 r/min的离心速度离心10 min，解冻后活率、复苏率、质膜完整率和顶体完整率分别达到038、5429%、5326%、7438%。不离心或者离心速率太小、时间太短，精液体积过大稀释效果不佳，而如果离心速度过快、时间过长则会使精子在离心管底部凝结，从而导致形态异常，活率下降。
低温保存 第5篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 精液的采集
选取4只繁殖期公蓝狐采精, 检查并选取活力在0.8、密度在10×108个/mL以上的精液, 与预热好的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释液及常温稀释液东林Ⅱ号 (对照组) 按常规稀释至10×107个/mL, 分装在5个集精杯中。
1.1.2 精液的保存
将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释液稀释的精液置于4 ℃的冰箱中, 以2 ℃/10 min的速度降温。东林Ⅱ号稀释的精液放于37 ℃的恒温水浴箱中, 在室温 (15～20 ℃) 环境下自然降温。将稀释后的5份精液分别在0, 2, 4, 8, 12小时及1, 2, 3, 4, 5天取出适量的精液, 放入37 ℃的恒温水浴中升温处理, 升温后的精子用伊红-苯胺黑染色、低渗肿胀试验和考马斯亮蓝染色进行质量评价。4种稀释液配方见表1。
1.2 方法
1.2.1 精子活率的检测
将染色液伊红 (5%) 、苯胺黑 (1%) 按1∶1混合, 37 ℃预热。取少量稀释后的精子与染色液迅速混合, 制成抹片自然干燥, 显微镜下观察, 死精子为红色, 活精子不着色或只在头部的核环处呈淡红色。随机观察200个精子并计算出死活精子的比例。
1.2.2 质膜完整性的检测
取1mL低渗液于集精杯中, 37 ℃预热5 min, 取稀释后的精液0.1 mL加入预热的低渗液中, 37 ℃孵育30 min。在高倍镜下计数200个精子, 数出精子尾部出现肿胀的百分率。
1.2.3 顶体状态的检测 (考马斯亮蓝染色法)
取80 μL精子稀释液置于1 mL生理盐水中, 10 000 r/min离心15 s;弃上清液, 取沉淀加1 mL 3.7%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液 (PBS) 后, 用加样器悬浮, 室温固定30 min, 离心, 弃上清液, 取沉淀用1 mL PBS悬浮, 离心, 弃上清液, 取沉淀用500～800 μL PBS悬浮, 涂片干燥;0.22%考马斯亮蓝染色5 min;用dH2O洗去染液后, 干燥;中性树胶封片、观察。随机选取200个顶体蓝色、边缘光滑的精子为具有完整顶体的精子类型。
2 结果与分析
2.1 伊红-苯胺黑染色法检测精子活率 (见表2)
注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著 (P<0.05) ;同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表2可知:5种稀释液保存精子活率的效果依次为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ>东林Ⅱ号。新鲜精液的精子活率是 (82.94±1.08) %。5种稀释液保存8 h后活率仍在70%以上, 东林Ⅱ号稀释液保存的精子活率下降的最慢, 而Ⅲ号稀释液下降的最明显。保存12 h后, 只有Ⅱ号活率下降缓慢, 其他几种活率下降显著。第5天时, 5种稀释液保存的精子活率都显著下降, Ⅱ号液最好, 为 (55.93±3.72) %。
2.2 低渗肿胀试验检测精子质膜完整性 (见表3)
注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著 (P<0.05) ;同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表3可知:5种稀释液保存精子质膜完整性比率依次为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ>东林Ⅱ号。新鲜精液中精子质膜完整的比例为 (83.42±1.76) %。常温稀释液东林Ⅱ号在保存1 d后精子质膜完整性迅速下降, 4种低温稀释液中, Ⅱ号保存效果最好, Ⅲ号最差。
2.3 考马斯亮蓝染色法检测蓝狐精液中顶体完整精子的比率 (见表4)
注:同行数据肩标大写字母不同表示差异显著 (P<0.05) ;同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表4可知:5种稀释液对蓝狐精液顶体完整性的保存效果依次为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ>东林Ⅱ号。新鲜的精液中, 具有完整顶体精子的百分率为 (83.65±1.49) %。5种稀释剂保存12 h精子顶体完整比率非常高。当保存1 d时, 常温稀释液东林Ⅱ号的精液精子顶体的完整性显著下降。而4种低温稀释液在保存的第2天顶体完整性还很高, 之后顶体完整性比率不断下降, Ⅱ号稀释液下降缓慢。
2.4 蓝狐精液在不同稀释剂保存下不同方法间的相关系数 (见表5)
用低渗肿胀试验和考马斯亮蓝染色法同时检测精子头尾部膜的功能状态, 用伊红-苯胺黑染色和考马斯亮蓝染色法同时检测精子的活率和顶体的完整性, 结果均高度相关, 显示数据稳定可靠。
3 讨论
稀释液对精子的体外保存起着决定性的作用, 稀释液的成分影响精液的质量。试验选择的4种稀释液中都加入了卵黄, 通常卵黄被用来防止冷刺激, 它可以直接渗透到质膜内, 保持质膜稳定性[1], 防止由于膜不稳定引起获能、顶体反应导致的精子死亡。试验中保存精子的效果加入卵黄的稀释液明显高于未加卵黄的稀释液, 由此推测卵黄可能是稀释液中起保护作用的主要成分[2]。此外, 在保存过程中, 精清对于维持精子的活率也起着非常重要的作用[3]。试验结果表明:用4种不同稀释液保存的蓝狐精液, 在 0～5 ℃保存的前2 d发生顶体反应的精子还不多, 第2天时顶体的完整率分别为 (61.80±2.84) % (Ⅰ) 、 (69.27±3.77) % (Ⅱ) 、 (61.82±2.11) % (Ⅲ) 、 (66.61±2.74) % (Ⅳ) , 常温条件下东林Ⅱ号在保存1 d后顶体的完整率为 (64.57±2.62) %。低温和常温保存效果相差无几, 说明蓝狐精液中可能存在的去获能因子起到了抑制精子发生顶体反应的作用。
试验选用的4种稀释液在低温条件下对精子的保存都比东林Ⅱ号在常温条件下效果好。这可能是由于Ⅱ号稀释液中的氨基乙酸可以降低精清中电解质的浓度, 抑制精子的活动, 防止精子中脂蛋白的破坏, 降低由于失去电荷而引起的凝集反应等, 有利于精子的长时间保存。另外, 氨基乙酸可作为精子呼吸的代谢基质, 增强其存活时间。Ⅳ号稀释液中加入了甘油, 甘油作为一种抗冻物质已广泛应用于冷冻精液中, 但在低温稀释液中加入甘油, 保存效果并不十分理想。这可能是由于低温保存时精子的新陈代谢作用比冷冻保存时活跃, 而甘油具有弱毒性且能渗入到精子内, 使精子的形态受到损伤。Ⅰ号稀释液中的碳酸氢钠和氯化钾虽能补充保存过程中钠、钾离子的缺失, 但对精子保存效果并不理想。Ⅲ号稀释液中的牛奶和卵黄都含有卵磷脂、脂蛋白及其复合物, 具有防止精子冷休克的作用, 但二者在同一稀释液中的保存效果不明显, Ⅲ号稀释液稍好于常温稀释液, 是4种低温稀释液中对精子保存效果最差的, 与期望结果差异显著, 其原因还需进一步深入研究。
4 小结
4种稀释液对蓝狐精子低温保存效果依次为Ⅱ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅲ, 且都好于常温稀释液的保存效果。低温稀释液Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在保存2 d、Ⅱ号稀释液在保存4 d、常温稀释液保存1 d时精液中精子的活率、质膜及顶体的完整性仍高于60%, 均可用于输精, Ⅱ号稀释液是4种稀释液中对精子低温保存效果最好的。
摘要：为探讨行之有效的精液保存方法, 提高狐人工授精技术的效率, 用4种稀释液对4只公蓝狐精液进行体外低温保存, 采用伊红-苯胺黑法检测精子活率, 低渗肿胀法检测精子质膜的完整性, 考马斯亮蓝染色法检测精子的顶体状态。结果表明:低温保存时精子的活率、质膜的完整性、顶体的完整性明显比常温保存时比率高;氨基乙酸稀释液对精子的保存效果优于其他3种稀释液, 精子活率为 (63.62±2.47) %, 质膜完整性为 (57.00±3.17) %, 顶体完整性为 (65.30±2.48) %。
关键词：蓝狐,精子,低温保存,稀释剂
参考文献
[1]MOUSSA M, MARTINETV, TRIMECHE A, et al.Loe density lipo-proteins extracted from hen egg yolk by an easy method:cryoprotec-tive effect on frozen-thawed bull semen[J].Theriogenology, 2000, 5:1695-1706.
[2]PETTITTM, BUHR MM.Extender components and surfactants af-fect boar sperm function and membrane structure during cryopreser-vation[J].Androl, 1998, 19:736-746.
低温保存 第6篇
关键词：豫杂一号泡桐,花粉,超低温保存,直接冻存法,程序冻存法
超低温保存技术是目前长期稳定保存植物种质资源较为理想的方法,它是指将活体材料通过一定方法安全存入超低温(通常指液氮温度,-196℃)下,以使细胞的全部代谢活动近乎完全中止,从而达到长期保存目的的技术。超低温保存本身不引起遗传变异,可以保持所存材料形态发生的潜能,从而近乎无限期的保存种质[1]。自从1973年Nag和Street首次成功保存胡萝卜悬浮细胞于液氮中以来[2],植物种质资源超低温保存取得了长足的进展,许多植物材料如原生质体、愈伤组织、体胚、茎尖分生组织、花粉等采用超低温保存都取得成功[3]。植物花粉具有体积小、易携带的特点,用超低温技术进行花粉保存是种质资源保存的必要补充[4]。随着花粉单倍体育种、花粉遗传转化等工作的开展,花粉超低温保存的研究愈来愈受到重视。
豫杂一号泡桐是重要的速生用材树种,在平原绿化中占有重要的地位[5]。本文对豫杂一号泡桐花粉的超低温保存技术进行了研究,以期解决豫杂一号泡桐花粉超低温长期保存的技术问题,为泡桐的育种实践和种质保存服务。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料取自河南省林业科学研究院内豫杂一号泡桐在盛花期的花粉。于2008年3月底,晴天中午采集刚开放或即将开放花朵,带回实验室采下花药,于硫酸纸上常温放置1 d后收集花粉放入干燥处理过的密闭玻璃瓶备用。
1.2 试验方法
1.2.1 花粉生活力的测定和最适萌发培养基的筛选
花粉生活力的测定采用悬滴法[6]进行离体萌发,以新鲜花粉为材料进行不同萌发培养基的萌发对比试验,测定其萌发率,并以自来水为对照进行显著性水平计算,以期筛选出豫杂一号泡桐花粉的最适萌发培养基。培养液配方设置9个组合(见表1),花粉统一在其中于25℃±2℃下培养4 h后使用日本产型号为BX51TRF的OLYMPUS生物荧光显微镜进行观察,判定花粉萌发以花粉管长度是否超过花粉直径的二倍为标准。每个处理组合重复3次,每个重复随机选取3个视野统计萌发数,每个视野花粉数量约在100个左右。取萌发率均值为该处理下花粉的萌发率。
1.2.2 花粉含水量的测定
花粉含水量测定采用烘干法[7],烘干温度为120℃,烘干时间60 min,反复2~3次,直至恒重。花粉含水量=花粉鲜重-花粉干重/花粉鲜重×l00%。
1.2.3 花粉的干燥和超低温保存
本研究采用较为常见的室温下自然干燥和硅胶干燥两种方法。自然干燥法的具体做法为:将花粉平铺在硫酸纸上,置于25℃±2℃下的室内空气中。硅胶干燥法具体做法为:将花粉平铺在硫酸纸上,放入底部铺满100g硅胶颗粒的2L干燥器当中,置于25℃±2℃下的室内。干燥时间和方式上设置了以下几个处理:未干燥,自然干燥3 d,硅胶干燥1 d,硅胶干燥2 d,硅胶干燥3 d,硅胶干燥4 d,硅胶干燥5 d。研究采用直接冻存法和程序冻存法。将花粉送入液氮后,再在保存2 h和30 d后分别取出进行萌发试验。直接冻存法为花粉经过脱水处理后直接装入2ml冻存管送入液氮。程序冻存法为花粉经过脱水处理后于冻存液(10%DMSO+0.5 mol·L-1suc)中于0℃平衡30 min,装入2 ml冻存管中以1 oC·min-1的速率降至-40℃,然后送入液氮。
1.2.4 花粉的解冻与萌发
上述经过处理的花粉在液氮中保存一定时间后取出,于38℃恒温水浴中快速化冻120 s。直接冻存法处理的花粉直接加入内有5%suc+500 mg/l硼酸的萌发液体培养基于25℃±2℃下培养4 h;程序冻存法处理的花粉解冻后以0.5 mol·L-1的蔗糖液洗涤2次,每次10 min,之后加入内有5%suc+500 mg/l硼酸的萌发液体培养基于25℃±2℃下培养4h。培养时间结束后观察萌发率并记录。
2 结果与分析
2.1 花粉适宜萌发的环境条件
如表1所示,豫杂一号泡桐花粉在不同的花粉萌发培养基中萌发率皆不相同。除了作为对照的自来水外,其余萌发培养基均能保证花粉60%以上的萌发率。在这9种萌发培养基中以5%suc+500 mg/l硼酸的萌发效果最好,平均萌发率可达81.23%。萌发效果最差的是5%suc+300 mg/l硼酸,平均萌发率为65.08%,但依然有60%以上的萌发率。由此可见,豫杂一号泡桐花粉的萌发率测定采用内有5%suc+500 mg/l硼酸的萌发液体培养基最为适宜。
2.2 不同干燥方式下花粉萌发率比较
由表2可以看出,随着干燥时间的延长花粉含水率和萌发率均呈现逐渐下降的态势,自然干燥3 d时和硅胶干燥5 d时两种方法处理下的样品含水率相近,其萌发率前者为63.34%,后者为63.27%。这表明花粉的萌发率受到含水率影响很大且紧密相关,低含水率在冻前就会影响花粉的萌发率。
2.3 不同冻存方式下花粉萌发率比较
由图1可见,随着硅胶干燥时间的延长,直接冻存法处理下的豫杂一号泡桐花粉萌发率首先上升、继而下降,以硅胶干燥4 d下的花粉萌发率为最高,冻存2 h萌发率可达77.35%,冻存30 d萌发率可达74.38%。这表明以直接冻存法冻存豫杂一号泡桐花粉前,以硅胶干燥处理花粉4d的方式将花粉含水率降至约30%是较好的干燥脱水方式。未经干燥的新鲜花粉冻存2 h萌发率不到20%,冻存30 d萌发率仅为3.95%,远远低于其他经过干燥处理的样品,表明直接冻存法处理下的花粉必须经过适当的干燥处理才能得到较好的冻存效果。由图2可见,随着硅胶干燥时间的延长,程序冻存法处理下的豫杂一号泡桐花粉其萌发率也呈现首先上升继而下降的趋势,花粉萌发率最高的处理组为硅胶干燥处理2d组,冻存2 h萌发率可达88.41%,冻存30 d萌发率可达67.29%。表明以程序冻存法冻存豫杂一号泡桐花粉前,以硅胶干燥处理花粉2 d的方式将花粉含水率降至约35%是较好的干燥脱水方式。未经干燥的新鲜花粉其萌发率相较直接冻存法有较大提高,冻存30 d萌发率可达39.75%,但相对其他处理组仍然过低。由此可见程序冻存法处理下适当的干燥处理对于提高花粉冻后存活率仍然必不可少。对图1、图2中相同干燥处理时间下的花粉冻存2 h和冻存30 d的萌发率进行比较可以发现,冻存30 d的萌发率均低于冻存2 h的萌发率,表明花粉活力在液氮冻存的初期仍会有部分下降。比较两种方法在冻存30d时的最高萌发率可知,豫杂一号泡桐花粉采用直接冻存法效果更佳。
3 讨论与结论
花粉萌发率是花粉超低温保存效果的重要评价因子,花粉离体萌发由于其操作简便易行而成为检验花粉萌发率的重要手段[10]。萌发培养基为花粉的萌发提供必要的营养物质,是影响花粉离体萌发的重要因子,因此有必要对适合豫杂一号泡桐花粉的萌发培养基进行研究。本试验得出豫杂一号泡桐花粉的最适萌发培养基为5%suc+500 mg/l硼酸,正常成熟花粉在其上的平均萌发率可达81.23%。
花粉含水率是决定花粉超低温保存成功与否的重要原因。花粉含水率越高,进行冷冻的时候越容易形成冰晶使细胞膜受损,花粉死亡率就越高,不能达到贮存的目的[8]。本实验结果表明随着豫杂一号泡桐花粉含水率的降低其萌发率也相应降低,经LN2贮藏后保留的萌发率却逐渐提高,含水率过低的情况下又有下降,表明超低温保存过程中,花粉含水率是影响花粉寿命的主要因素,含水过高或过低,都会使花粉细胞受损而丧失生活力。因此为了保证冻存效果,必须控制花粉含水量在适宜的范围内。在适宜范围内,花粉含水量愈低,经LN2贮藏后生活力愈高,但是过度脱水会使花粉萌发率降低,这与宋尚伟等人的结论是相符合的[9]。在实验中我们发现豫杂一号泡桐花粉冻存2 h的萌发率较之冻存30 d的萌发率均有降低,这说明豫杂一号泡桐花粉在投入液氮的初期阶段中仍会有部分活力的丧失,短时间冻存后的萌发率并不足以用来证明冻存方法的适当与否。
进行花粉超低温保存的主要目的是为了满足杂交育种工作的需要。为了探索适于豫杂一号泡桐花粉的超低温保存方式,本研究采用直接冻存法和程序冻存法分别对花粉进行冻存,将花粉送入液氮后,再经过不同的保存时间然后取出进行萌发试验。对保存效果进行比较从而得出的豫杂一号泡桐花粉较好的保存技术体系为:25℃条件下硅胶(2 L干燥器中加入100 g硅胶)干燥脱水4 d后,快速投入液氮保存;保存后以38℃温水浴快速解冻120 s,萌发率可达70%以上。该技术体系简单易行,保存效果好,长期保存后的花粉仍保持较高的花粉萌发率,值得在科研和生产上推广和应用。
参考文献
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[4]王越,刘燕.观赏植物种质资源的超低温保存[J].植物生理学通讯,2006,42(3):559-566.
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[9]宋尚伟,闫锋,苗红霞,等.金太阳杏花粉超低温保存方法研究[J].果树学报2007,24(5):689-691.
低温保存 第7篇
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
SANYO低温储血冰箱, (日立CR-7) 大容量低温离心机, 复方甘油溶液, 9%氯化钠溶液, 羟基淀粉, 所有材料均购自乐普 (北京) 医疗器械股份有限公司。
1.2 保存方法
将Rh (D) 阴性稀有血型少白细胞悬浮红细胞6 d内进行冰冻保存, 其中前处理制备为将冰冻红细胞置于-80℃深低温储血冰箱中, 同时建立稀有血型红细胞深低温保存血库。如临床有相应血型的血液需求, 则对库存血液解冻。
1.3 复苏方法
选用以CPD-A液保存7 d内的红细胞悬液40袋, 共分为两份, 所有细胞悬液的ALT在40~45 U, 分别作为试验组和对照组, 分别对两组材料进行处置。两组实验条件均一致, 包括操作人员、离心转速和时间、复融温度等, 降低外界对实验的干扰。具体操作如下。
(1) 甘油化冻存:取两组血液2500 r/min离心15 min, 移去上清及白膜层, 滴速加入57%的复方甘油160 m L, 边加边震荡, 试验组为8 min, 对照组为25 min。置室温平衡半小时后, 留取血液样本1 m L, 离心, 观察两组上清溶血情况, 血袋移入-80℃低温冰箱中保存15 d后复苏。
(2) 复苏去甘油:将深低温保存的血液取出, 置40℃水浴箱中快速解冻, 2500 r/min离心15 min后弃上清。去甘油的各操作步骤见表1。
1.4 观察指标
统计2012年1-6月Rh (D) 阴性红细胞采集使用情况、复苏后2, 3-DPG含量和甘油残存量、红细胞回收率。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以±s表示, 采用t检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2012年1-6月Rh阴性红细胞采集使用情况
统计2012年1-6月间红细胞采集情况, 结果显示, 随着“稀有血型红细胞的低温保存及冰冻技术”的开展及完善, 其Rh阴性红细胞采集量逐步增多, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
2.2 两组血液经复苏后去甘油后相关指标比较
结果显示, 两组血液经复苏后去甘油后, 红细胞回收率差异有统计学意义 (P<0.05) 。复苏后2, 3-DPG含量和甘油残存量则无明显差异, 见表3。
3 讨论
目前我国Rh (D) 阴性样本占献血人群比例平均为2‰~3‰的水平, 在很大程度上不能满足临床需求[2]。并且目前先初筛检验合格采血、后实行全面初复检的献血方式及血液保质期的限制, 造成了稀有血型血液资源的严重浪费和突出的供需矛盾[3]。
摘要：目的 探讨稀有血型红细胞低温保存及复苏方法。方法 将Rh (D) 阴性稀有血型少白细胞悬浮红细胞6 d内进行冰冻保存, 取保存7 d内的红细胞悬液40袋, 共分为两份, 分别作为试验组和对照组, 分别对两组材料进行甘油化冻存及复苏去甘油处置, 除处理时间不同外, 两组实验条件均一致, 包括操作人员、离心转速和时间、复融温度等, 降低外界对实验的干扰。统计2012年1-6月Rh (D) 阴性红细胞采集使用情况、复苏后2, 3-DPG含量和甘油残存量、红细胞回收率。结果 2012年1-6月间, Rh (D) 阴性红细胞采集量逐步增多, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。两组血液经复苏后去甘油后, 红细胞回收率差异有统计学意义 (P<0.05) 。复苏后2, 3-DPG含量和甘油残存量则无明显差异。结论 本研究方法不仅为患者赢得急救时间, 还保证了血液的输注效果, 对临床应用意义重大, 值得推广。
关键词：稀有血型红细胞,低温保存,复苏,Rh (D) 阴性
参考文献
[1]段前碧, 李忠俊.自体输血在外科手术中的应用探讨[J].重庆医学, 2006, 35 (12) :1072, 1081.
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低温保存 第8篇
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用背角无齿蚌取自江苏省淡水水产研究所禄口基地, 选择闭壳肌张合有力的性成熟雄蚌, 实验室暂养。实验时用无菌手术刀切开背角无齿蚌的闭壳肌, 选择性腺成熟饱满的, 在性腺一侧开一小口, 用吸管直接从中吸取精液用于试验。
1.2 方法
1.2.1 精子的检测
取少量精液于载玻片上, 滴加氨水激活镜检。观察3~5个视野, 估测视野中活动精子的数量占全部精子数量的百分比取平均值 (精子存活率或激活率) , 选取活力强 (90%以上精子快速运动) 的作为实验材料。
1.2.2 稀释液、抗冻剂的筛选
稀释液5种:水、任氏液、Kurokura-1、D-15、D-20 (成分见表1) 。抗冻剂2种:二甲基亚砜 (DMSO) 、甘油 (Gly) 。
分别配制体积分数为4%、6%、8%、10%、12%、14%的DMSO和Gly抗冻保护剂, 置4℃冰箱预冷备用。
1.2.3 不同稀释倍数的精液样品制备
经氨水激活镜检后, 选择精子活力好的精液与抗冻保护剂按1∶2、1∶5、1∶10和1∶20 (体积比) 稀释, 样品混匀后, 分别置于2 m L的塑料冻存管中, 样品体积为1 m L/管。
1.2.4 不同冻前平衡时间的精液样品制备与冷冻方法
4℃冰箱中分别平衡0、10、20和30 min, 再于液氮面上方6 cm处平衡10 min, 液氮面上平衡5min, 然后投入液氮中保存。
1.2.5 解冻及解冻后精子活力检测
在液氮面上静置5 min后, 马上35℃水浴解冻至半融状态, 取少许精液, 滴加氨水激活镜检。
2 结果
2.1 不同稀释液对精子存活率的影响
用水、任氏液、Kurokura-1、D-15、D-20这5种稀释液分别稀释背角无齿蚌精液后, 置室温、低温、超低温下2 h, 镜检精子存活率可见, 低温的保存效果好于常温, 超低温的保存效果好于低温, 其中水和Kurokura-1的常温、低温、超低温保存效果均优于其他稀释液。结果见表2。
2.2 不同精液稀释倍数对保存效果的影响
不同的稀释倍数对背角无齿蚌精子的保存效果不同, 经4 h液氮保存、35℃水浴解冻后镜检发现, 1∶2和1∶5稀释组出现絮状凝结且存活率较低, 而1∶10和1∶20稀释组无絮状凝结, 其中1∶10比例下存活率较高, 达80%左右。结果见表3。
2.3 不同体积分数DMSO、Gly对保护效果的影响
背角无齿蚌精液加入不同体积分数的DMSO、Gly抗冻剂, 经过超低温冷冻保存4 h, 解冻后观察结果表明, DMSO体积分数为10%时, 精子存活率达70%左右, 保护效果最好;而Gly的保护作用较差, 精子存活率较低。结果见表4。
2.4 不同冻前平衡时间对保护效果的影响
选择对精子有较好保护作用的水+10%DMSO组成的抗冻保护剂, 测定4种冻前平衡时间对背角无齿蚌精子存活率的影响, 结果显示, 平衡20~30min时精子存活率最高。结果见表5。
2.5 不同浓度氨水对解冻精子的激活效果
解冻后用不同浓度的氨水进行激活, 当氨水浓度逐渐增大时, 激活率逐渐增大, 当氨水浓度达到0.30‰时, 精子存活率达到70%左右, 超过0.30‰后, 随着浓度增大, 存活率逐步减弱。
3 讨论
3.1 稀释液对保存效果的影响
合适的稀释液, 对精子冷冻保存的效果, 复温后的受精率、孵化率以及胚胎发育等都有很大影响, 其配制和使用应尽量简单。由于尚未见到淡水蚌类精子冷冻保存的相关报道, 而背角无齿蚌的生存和繁殖环境与淡水鱼类相似, 本试验选择了淡水鱼类精子冷冻保存过程中使用的几种效果较好的稀释液 (水、任氏液、Kurokura-1、D-15、D-20) 和抗冻剂 (DMSO、Gly) 。杨爱国[6]、李赟[2]等认为, 海水是双壳类精子冷冻较适宜的稀释液, 本试验将淡水用于背角无齿蚌也有不错的效果, 这可能与背角无齿蚌受精环境是淡水, 淡水对精子的生理活性没有不利影响有关。
3.2 稀释倍数和平衡时间对保存效果的影响
不同的稀释倍数对精子的保存效果不同。较低稀释倍数下, 会出现絮状凝结, 显微观察, 为不活动的精子聚集而成;较高稀释倍数下, 保存效果较好, 但倍数过大会导致精子活力降低。精液和抗冻保护剂混合后在4℃冰箱中平衡的目的是使抗冻保护剂充分渗透。本试验表明, 精子稀释后在4℃平衡20 min和30 min时效果较好, 参考余祥勇等[7]对精子在4℃下平衡时间延长会损害精子受精能力的实验结论, 本试验选择20 min为冻前平衡时间, 达到在抗冻剂充分渗透的同时又降低了温度速降造成精子损伤的目的。
3.3 抗冻剂对保存效果的影响
李纯等[1]认为, 由于DMSO毒性小于Gly, 渗透性又强于Gly, 在相同条件下, Gly的保护效果不如DMSO, 本试验也表明, DMSO对背角无齿蚌精子的超低温保护效果较好。但由于DMSO具有毒性, 因此, 选择一个合适的抗冻剂浓度, 不仅对精子有着良好保护作用, 而且不会因浓度过高导致精子中毒。廖馨等[8]认为10%的DMSO是一个高度有效的浓度, 杨爱国等[6]证实浓度8%~10%的DMSO对扇贝的精子保护最好, 本试验也表明, 10%的DMSO抗冻剂对背角无齿蚌精子有较好的抗冻保护作用。
3.4 不同浓度氨水对解冻精子的激活效果
精子活力对受精孵化意义重大, 人工授精的精子因物种差异激活方法也不尽相同[5]。氨海水在对海洋贝类如马氏珠母贝[3]、香港牡蛎[5]等精子激活中有一定的刺激作用。本试验探索了不同浓度氨淡水对复苏后背角无齿蚌精子的激活情况, 发现用0.30‰的氨淡水对冻精的激活效果较好, 这与王梅芳[3]、丁兆坤等[5]研究结果相似。
4 小结
取性成熟背角无齿蚌精子, 以水为稀释液配置体积分数为10%的DMSO抗冻保护剂, 精液和抗冻保护剂体积比1∶10, 1 m L/管, 置4℃冰箱中平衡20 min, 再于液氮面上方6 cm处平衡10 min, 在液氮面上平衡5 min, 然后投入液氮中保存, 4 h后以0.30‰氨水激活镜检, 精子存活率可达70%左右, 为背角无齿蚌精子的长期超低温保存提供了参考方法。
由于实验条件限制, 氨水激活后的精子的受精能力如何, 有待进一步研究。
参考文献
[1]李纯, 李军, 薛钦昭.栉孔扇贝精子的超低温保存研究[J].海洋水产研究, 2000, 21 (1) :57-62
[2]李赟, 王品虹, 贺桂珍, 等.太平洋牡蛎精液的超低温保存[J].青岛海洋大学学报 (自然科学版) , 2002, 32 (2) :207-211
[3]王梅芳, 余祥勇, 刘永, 等.马氏珠母贝精子的超低温保存[J].水产学报, 2006, 30 (2) :170-174
[4]杨培民, 杨爱国, 刘志鸿, 等.虾夷扇贝精子的冷冻保存及其杂交试验应用研究[J].上海水产大学学报, 2007, 16 (4) :351-356
[5]丁兆坤, 朱豪磊, 杨春玲, 等.不同稀释液对香港牡蛎精子冷冻的保存效果[J].水生态学杂志, 2013, 34 (3) :67-74
[6]杨爱国, 王清印, 孔杰, 等.扇贝精液的超低温保存技术研究[J].海洋与湖沼, 1999, 30 (6) :624-628
[7]余祥勇, 王梅芳, 陈钢荣, 等.马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素的研究[J].华南农业大学学报, 2005, 26 (3) :96-99
低温保存 第9篇
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