猪抗菌肽范文

猪抗菌肽范文（精选7篇）

猪抗菌肽 第1篇

1 蚯蚓抗菌肽的生物活性

蚯蚓不仅具有大分子量的抗菌蛋白, 而且具有抗菌活性的小分子多肽, 且抗菌效果强, 毒副作用小。 郑津辉等研究发现, 蚯蚓抗菌肽的抗菌性受酸碱影响, 但影响不大, 和苯甲酸钠比较, 抗菌性在相同浓度下抗菌肽要高出10~20 倍。刘艳琴等采用硫酸铵沉淀-超滤-离子交换层析-Sephadex凝胶过滤和C18 反相高压液相等步骤从蚯蚓体腔液中分离纯化出多种抗菌肽, 且用细胞病变抑制法测定了蚯蚓寡肽的体外抗伪狂犬病毒 (PRV) 的作用, 结果显示, 蚯蚓寡肽可以抑制PRV感染细胞。 张希春等通过硫酸铵沉淀、超滤和阳离子交换分离从蚯蚓匀浆液中得到了两种新的抗菌肽F-1 和F-2 的精确分子量分别为535.27 Da (道尔顿: 分子量常用单位) 和519.27 Da。 最小抑菌浓度实验表明F-1 数F-2 对鹑鸡肠球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌、土生克雷伯氏菌的最小抑菌浓度分别为11.4 mg·L-1 (物质的密度单位) 和12.85 mg·L-1, 对粪肠球菌的最小抑菌浓度分别为22.8 mg·L-1 和25.68 mg·L-1, 对真菌白色念珠菌没有表现出完全的抑制作数。 王庄等通过电击诱导蚯蚓产生抗菌肽、超滤浓缩脱盐以及截取3~30 kD ( 分子量单位, 1kD=1000Da ) 的抗菌肽、阳离子交换、凝胶过滤层析分离提纯得到3~30 kD的蚯蚓抗菌肽。

2 蚯蚓抗菌肽的作用机理

2.1 抗菌活性及其作用机理

抗菌肽既可杀灭或抑制C+菌, 又可杀灭或抑制C-菌, 其广谱抗菌特性是传统抗生素所无法比拟的。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件, 如使酶失活变性, 来达到杀菌的目的, 细菌只要改变一种基因就足以抵抗此类抗生素的攻击。而抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用, 以此穿透杀死细菌, 极大地减少了细菌产生耐药性的可能。抗菌肽的作用机制不仅仅是脂膜渗透性的崩溃, 还有其他多种方式, 研究发现, 有些抗菌肽通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成, 从而杀死靶细胞;有些抗菌肽可以通过抑制细胞呼吸, 抑制细胞外膜蛋白的合成来杀死细菌。同时还发现有些抗菌肽具有抑制引起机体损伤的酶的作用, 从而在抗菌的同时避免病原菌引起的机体损伤。

2.2 抗病毒活性及其作用机理

研究发现, 抗菌肽中和病毒的程度与其浓度及分子内二硫键的完整性有关, 另外, 还受接种时间、CM、温度以及培养液成分等因素的影响。 目前已证明抗菌肽可以3 种不同的机制起到抗病毒的作用。第一种是通过直接与病毒粒子结合而起作用, 如K防御素等对疱疹病毒的作用;第二种是抑制病毒的繁殖, 如蜂毒素和杀菌肽对人免疫缺陷病毒的作用;第三种是模仿病毒的侵染过程而起作用。

3 蚯蚓抗菌肽在猪生产中的应用

猪抗菌肽 第2篇

青霉素的发现使人们对病原微生物感染而引起的各类疾病不再束手无策, 并由此开发研制了大量的抗生素, 对人类健康和畜牧业发展作出了巨大贡献。但是随着青霉素等“传统抗生素”的广泛应用, 不断产生出诸多新问题, 如耐药菌株不断增多, 且耐药性不断加强, 特别是多重耐药株的出现, 然而要开发出一种新药并非易事, 寻找天然抗菌药物, 比如抗菌肽 (Antimicrobialpeptides, AMPs) , 为解决耐药细菌的威胁这一棘手世界难题提供了新途径。抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类小分子多肽, 具有分子量小、水溶性好、耐热、无免疫原性等特点, 极有可能成为一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒和抗癌新药[1,2,3,4,5]。近年来, 国内外关于抗菌肽的研究越来越多, 已经成为研究的热点。人们期望通过研究, 一方面在分子水平上弄清抗菌肽精细的合成过程及调控机制;另一方面是探讨抗菌肽的药用开发价值, 努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌药物。

小肠既能消化吸收营养, 也是重要的免疫器官, 但关于肠道黏膜免疫的很多机制尚不完全清楚[6,7,8,9,10]。研究外源抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响, 能为进一步探讨肠道黏膜的抗菌机制和开发研制新的抗生素替代品提供一些有益的思路和借鉴。

1材料与方法

1.1主要材料

猪肠道抗菌肽冻干粉为本课题组制备保存。实验动物为1日龄SPF鸡购于北京梅里亚公司, 鼠抗鸡IgA单克隆抗体为SouthernBiotechnology, Inc.产品。

1.2实验方法

1.2.1动物实验及采样

60只1日龄SPF鸡随机分成两组:每组30只, 其中抗菌肽处理组于7、14、21、28、35和42日龄分别通过腿部肌肉注射0.1 mL鸡肠道抗菌肽 (100ug/mL) 。对照组鸡于相同日龄分别注射等体积的无菌生理盐水, 两组鸡隔离饲养。分别于7, 21, 35, 49日龄剖杀实验组和对照组鸡各5只, 分别剪取约2cm长的十二指肠、空肠和回肠, 生理盐水冲洗干净后, 用2.5%的多聚甲醛-戊二醛固定液充分固定以备用。

1.2.2石蜡切片的制作

所有组织经按常规石蜡切片技术脱水、包埋后, 每个组织做5张连续切片 (5μm) , 分别进行H.E染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色和免疫组化染色。

1.2.3 H.E染色法-显示肠黏膜上皮内淋巴细胞

常规H.E染色显示肠黏膜上皮细胞内淋巴细胞, 40倍下取每根肠管横断面, 选5根最长且排列整齐的绒毛计数每100个黏膜上皮细胞间IEL数量。

1.2.4甲苯胺蓝染色法-显示肥大细胞

采用改良甲苯胺蓝染色法 (MTB) [11]:石蜡切片常规脱蜡至水, 0.8%甲苯胺蓝染色10s, 蒸馏水快速洗2次后, 95%酒精分色, 100%酒精脱水, 二甲苯透明封片。Olympus显微镜下观察。镜下MC胞浆呈紫红色或颗粒状红色团块状, 胞核呈浅蓝色。计数每根肠管横断面的肠壁全层 (包括黏膜及黏膜下层、肌层及浆膜层) 的肥大细胞数量, 并观察其分布;

1.2.5 PAS染色法-显示杯状细胞

采用PAS染色显示杯状细胞:石蜡切片脱蜡下行入蒸馏水, 入0.5%～1.0%高碘酸溶液氧化5min, 蒸馏水速洗一次后入Schiff氏溶液, 37℃中反应 (30～60) min后, 以亚硫酸溶液洗2～3次, 再用蒸馏水速洗二次, 苏木素复染, 然后0.5%盐酸酒精溶液分色 (5～10) s, 以镜检为准, 用自来水软化后, 常规脱水、透明、封片。同时设置对照组, (1) 切片出蒸馏水后入醋酸酐与吡啶混合液, 处理 (3～5) min后水洗 (2～3) 次, 再进行PAS染色。染色结果:PAS阳性的杯状细胞有紫红色颗粒。PAS阴性的切片不着色。取每根肠管横切面, 统计观察5根最长且排列整齐的绒毛每100个肠黏膜上皮细胞间杯状细胞数量和分布。

1.2.6肠道分泌型IgA (SecretoryIgA, sIgA) 的免疫组化染色

(1) 石蜡切片脱蜡下行入蒸馏水; (2) 3%H2O2孵育30min, PBS冲洗3次, 每次5min; (3) 山羊血清封闭25min; (4) 滴加小鼠抗鸡sIgA单抗血清 (1∶100倍稀释, 用0.0 1mol/L PBS配制) 溶液, 37℃孵育2h, PBS漂洗3次, 每次5min; (5) 滴加生物素标记的二抗工作液, 37℃孵育30min;PBS漂洗3次, 每次5min; (6) 滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液, 37℃孵育30min, PBS漂洗3次, 每次5min; (7) DAB显色液显色; (8) 用苏木素衬染, 常规方法脱水、透明、封片; (9) 常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗进行孵育做阴性染色对照。

1.2.7数据处理及分析

实验结果用均数±标准差 (X±S) 表示, 应用SPSS11.0统计软件对测定数据进行组间差异性比较。

2结果

2.1猪小肠抗菌肽的活性鉴定

比较了不同温度和pH值处理后对抗菌肽活性的影响, 结果表明该抗菌肽在40℃～80℃处理30min对其抗菌活性基本没有变化, 90℃处理30min抗菌活性略有下降, 100℃处理30min抗菌活性损失约30%左右 (图1 (a) ) 。这说明猪小肠抗菌肽具有良好的热稳定性。在pH (6.5～7.5) 的近中性环境中, 猪小肠抗菌肽的抗菌活性最强, 偏酸性 (pH<6.0) 或偏碱性 (pH>8.0) 的溶剂环境均可导致猪小肠抗菌肽的抗菌活性降低 (图1 (b) ) 。

2.2抗菌肽对鸡生长性能的影响

从7日龄开始, 给鸡肌肉注射猪小肠抗菌肽, 每7d一次。从表1可以看出, 在整个试验周期中, 实验组鸡平均周增重明显高于对照组, 差异显著或极显著 (p<0.05或p<0.01) ;实验组平均每只鸡日增重为13.54±0.20g, 对照组平均每只鸡日增重为11.10±0.19g, 二者差异显著 (p<0.05) 。试验组和对照组全期平均日耗料量基本相同, 没有显著性差异 (P>0.05) ;试验组的料重比 (2.27±0.04) 显著低于对照组 (2.60±0.05) (p<0.05) 。

注:“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) , 下同。

2.3猪小肠抗菌肽对肠道免疫活性细胞的影响

改进的甲苯胺蓝染色结果表明:肥大细胞一般为圆形或梭形, 有紫红色颗粒 (图2A) 。在各段肠管均有分布, 但从计数结果来看, 其数量从前向后逐步减少 (表2) 。检验结果表明, 在应用猪小肠抗菌肽处理之后, 在21日龄时, 从十二指肠开始, 抗菌肽处理组的各段肠道内肥大细胞数量高于对照组, 差异明显 (p<0.05或p<0.01) 。H.E染色结果表明:上皮内淋巴细胞为散在分布于肠绒毛上皮细胞之间的一群特殊淋巴细胞 (图2B) 。不同的肠段, 上皮内淋巴细胞的数量也有所不同。从计数结果来看, 在应用猪小肠抗菌肽处理之后, 其变化趋势与肥大细胞在各段肠道的变化相似 (表2) 。PAS染色结果表明:杯状细胞散在分布于柱状细胞之间, 呈高脚杯状, PAS染色呈红色阳性反应 (图2C) 。从计数结果来看, 杯状细胞的数量从十二指肠到回肠, 呈从前向后逐渐增多趋势 (表2) 。检验结果表明, 在应用猪小肠抗菌肽后, 在21日龄时, 实验组鸡回肠内杯状细胞数量与对照组相比差异显著 (p<0.05) , 在35日龄和49日龄时差异极显著 (p<0.01) , 而在十二指肠和空肠内实验组与对照组相比则是差异显著 (p<0.05) 。

注:肥大细胞、IEL和杯状细胞分别在对照组 (A—C) 和抗菌肽处理组 (D—F) 的分布图。A:少量的肥大细胞呈紫红色形态, 分布在肠绒毛固有层 (toluidinebluestaining, ×20) ;B:IEL主要分布在上皮细胞之间 (H.Estaining, ×40) ;C:杯状细胞呈现典型的“高脚杯状”形态 (PAS staining, ×20) ;D:大量的肥大细胞分布在绒毛固有层 (toluidineblue staining, ×20) ;E:抗菌肽处理组的IEL形态及分布 (H.E staining, ×40) ;F:杯状细胞数量明显增多 (PASstaining, ×20) 。

2.4猪小肠抗菌肽对肠道中sIgA表达的影响

免疫组化染色观察表明sIgA阳性细胞主要分布于肠道的固有层 (图3) 。不同时期实验组和对照组鸡各段肠道的sIgA阳性物统计结果表明, 从21日龄起, 各段肠道的sIgA阳性物水平是逐渐升高的, 并且差异显著或极显著 (p<0.05或p<0.01) (见图4) 。

注:不同日龄各段肠道内IEL、肥大细胞和杯状细胞的数量。“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) 。

注:A:对照组十二指肠内的sIgA阳性信号 (IHCstaining, ×40) ;B:抗菌肽处理组鸡的对照组十二指肠内的sIgA阳性信号 (IHCstaining, ×40)

3讨论

生物有机体进化出很多防御机制对抗病原微生物的感染, 其中最原始的一个机制就是分泌抗菌肽[12,13]。大量的证据提示这些小肽分子在保护机体抵御病原体感染过程中发挥重要作用[1,3]。肠道在营养吸收与宿主防御方面扮演双重角色[3], 但关于外源性抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响方面的研究并不多见。

研究发现肠道在维持机体的衡态方面发挥至关重要的作用[3,14]。通常情况下, 肠道发挥功能是通过其免疫活性细胞的活动来完成, 这些免疫活性细胞主要是指定居在肠道内的上皮内淋巴细胞 (IEL) 、肥大细胞 (MC) 和杯状细胞 (GC) [3,14,15]。

注:“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) 。C:对照组;T:抗菌肽处理组

研究的结果表明, 添加的外源抗菌肽对SPF鸡没有毒性, 并能在一定程度上促进饲料的利用率 (见表1) 。进一步的H.E染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色和免疫组化染色结果的数据分析表明, 抗菌肽能显著提高肠道内IEL、MC、GC及sIgA的含量。已有的研究表明, 作为肠道主要的免疫活性细胞, IEL、MC、GC和sIgA处在肠道与外界病原体斗争的第一线, 这些免疫活性细胞能通过各自独特的分泌方式释放多种细胞因子发挥对病原体的作用[16,21], 如IEL能分泌细胞因子发挥调节效应[16], MC能释放组胺、5-HT和类胰蛋白酶等发挥对肠道的保护作用[18], GC能合成和释放黏液素, 这些黏液素能作为一个动态的防御所来抵抗入侵的病原体[22], sIgA能直接中和毒素或间接阻止外来的有毒物质在肠道的黏附发挥其保护作用[20]。研究表明, 抗菌肽处理后能提高小肠各段的免疫活性细胞的数量, 可以增强肠道的屏障功能, 提高动物的肠道黏膜免疫能力, 对于研究肠黏膜的防御机制提供了新的思路。

当然, 研究只是初步揭示了猪小肠抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响。至于IEL等免疫活性细胞的增多意味着什么尚不能完全定论。一方面可以认为在一定范围内IEL、肥大细胞和杯状细胞的增多可以增强肠道的免疫学屏障和机械屏障功能, 从而增强了肠道的免疫功能, 对肠道黏膜的防御机制起着积极作用。而另一方面, IEL和肥大细胞的增多会不会意味着免疫增强?其中的详细机制还需要进一步的探讨。

鲶鱼部分组织抗菌肽抗菌功效的研究 第3篇

鲶鱼(Parasilurus asotus Linnaeus)属于鱼纲鲤形目鲶科,俗称塘虱,又称黏鱼、胡子鲢、塘虱鱼生仔鱼。鲶鱼对生存环境有非常强的适应能力,相对于其他的鱼类来说,其体内会应激产生一些抵抗恶劣环境的抗菌活性物质,尤其是在体表黏液和内脏中,特别是在受伤之后,这种活性物质将产生更多。基于鲶鱼的这些特性,采用乙酸提取法对鲶鱼的皮肤、肌肉、黏液和内脏进行抗菌物质的粗提,并对其抗菌功效进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验动物:鲶鱼,购于长春市光复路市场。供试菌种:金黄色葡萄球菌(S.aureas)、大肠埃希菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌,由吉林农业大学食品科学与工程学院提供。

1.2 培养基

LB液体培养基:蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化钠1g,加蒸馏水至终体积100 m L,121℃高压灭菌20min。

LB固体培养基:取100m L LB液体培养基加入2g琼脂粉,121℃高压灭菌20min。

1.3 试验药品、仪器与设备

药品:浓氨水、氢氧化钠、Cu SO4·5H2O、乙酸及其他,均为国产分析纯试剂;牛血清蛋白、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉为生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司提供。仪器与设备:高速冷冻离心机(GL-16G-Ⅱ),-86℃超低温冰箱(The rmo Forma,美国),恒温培养箱(PYX-DHS,上海跃华医疗器械厂),电子天平(AUY220岛津制作所),高速组织捣碎机(JJ-2,上海鹰利仪器厂),超净工作台(苏净集团安泰公司),手提式高压灭菌锅(北京永光明医疗仪器厂),智能生化培养箱(SPX,宁波江南仪器厂)。

1.4 鲶鱼的预处理

将鲶鱼置于冰板上,迅速用刀将体表的黏液刮下,备用,冰浴保存。将内脏组织迅速取出,鱼肉和鱼皮分离,用蒸馏水洗去血水,去掉膜组织,脂肪组织,剪碎,称重,备用(以上操作均在冰浴条件下进行)。

1.5 抗菌物质的粗提——乙酸提取法[10,11]

1.5.1 黏液处理。

4℃,10 000 rpm,离心30min;去上清液,上清液与5%乙酸等体积混合,4℃冰箱浸提24h;4℃下,10 000rpm,离心30min,取上清液,调整p H值为7后,冷冻干燥,即为鲶鱼黏液抗菌肽的粗提物质。

1.5.2 内脏的处理。

(1)匀浆:鲶鱼内脏微冻,于高速组织捣碎机内,匀浆20min;(2)浸提:将上述处理好的匀浆液,与5%乙酸等体积混合,4℃冰箱浸提24h。(3)离心:4℃,10 000rpm,离心30min,取上清液。(4)二次离心,隔水加热,将上清液重复上述离心的过程,65℃隔水加热3min,去除大分子物质,重复上述离心过程,取上清液。(5)上清液调整p H值为7后,冷冻干燥,即为鲶鱼内脏抗菌肽的粗提物质。

1.5.3 皮肤、鱼肉。参照内脏的提取方法。

1.6 蛋白质含量测定

采用双缩脲法测定[12],以牛血清白蛋白为标准蛋白。具体步骤如下:(1)将0.175g Cu SO4·5H2O溶于15m L蒸馏水,置于100m L的容量瓶中,加入30m L浓氨水、30m L冰冷的蒸馏水和20m L饱和氢氧化钠溶液,摇匀,室温放置1~2h,再加蒸馏水至刻度,摇匀备用。(2)配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液。(3)以蛋白质浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制的标准曲线如图1所示。(4)取稀释好的样品液3m L于试管中,加入双缩脲试剂2.0m L,充分混匀,测540nm处的吸光值,对照标准曲线求得酶解液的蛋白质浓度。

1.7 抑菌试验

采用滤纸片法[13]。培养平板的制作:将灭菌后约50℃的营养琼脂培养基15m L注入平板,凝固后,在上面均匀的涂200μL的菌液(浓度约106~107cfu/m L)。再把浸泡在样品液中(5 mg/m L)的滤纸片贴在平板上,轻轻按压,做好标记,每个样品做3个平行。倒置恒温培养箱,37℃培养24 h,观察结果,测量抑菌圈直径,直径越大,抑菌效果越大。

2 结果与分析

2.1 黏液、皮肤、鱼肉、内脏蛋白质含量

由表1可知,鲶鱼内脏中抗菌肽的含量最高,表面黏液次之。黏液中的抗菌肽应该是丰富的,但由于试验用的鲶鱼购买于普通的水产市场,是集中养殖的产品,其生存环境相对于野生鲶鱼还是有很大差别,相对环境较好,所以体内所含抗菌物质不如野生鲶鱼的含量高。

(mg/m L)

2.2 提取物抗菌试验

鲶鱼黏液、皮肤、鱼肉、内脏的抗菌肽粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用如表2和图2所示。抑菌圈直径的大小直接反应抑菌活性的大小,抑菌圈越大抑菌活性越强,反之越差。研究结果表明,在抑菌试验中,4个组织均有抑菌活性,以内脏的抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为大肠杆菌10.18mm,金黄色葡萄球菌8.09mm,枯草芽孢杆菌10.73mm,其中对枯草芽孢杆菌抑制效果最佳。

由表2可知,鲶鱼内脏抗菌肽粗提物的抑菌效果最好,抑菌活性最强,鲶鱼肉的抑菌活性最弱。内脏的蛋白质含量虽然不是最多的,但是却含有较高的抗菌物质。在自然条件下,鲶鱼的体表和消化道最易受到外界的侵袭,这类抗菌活性物质在此具有高的含量正是对鲶鱼自身生命和健康的保证。

(mm)

由图2可以看出,鲶鱼不同组织的粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑菌效果,且对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强。初步可以说明鲶鱼体内不同组织中均含有抗菌肽,有广谱抗菌的作用,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。

3 结论

抗菌肽的抗菌活性及免疫调节功能 第4篇

具有抗菌活性的天然物质很多, 但大部分均属于以下3种:1) 消化酶类, 破坏细菌结构 (例如溶菌酶) ;2) 可结合必要元素 (如锌和铁) 的肽类物质 (例如钙卫蛋白、乳铁蛋白) ;3) 可穿透微生物膜的肽类物质 (防御素-抗菌肽) 。目前为止已知的抗菌肽已超过2 000种, 其中真核生物的已超过940种[2]。本文旨在讨论抗菌肽在机体内免疫防御的功能。

1 先天性宿主防御的重要性

宿主防御肽对于侵入的微生物具有固有特异性, 对于多细胞宿主动物的细胞毒性相对较低, 但有的对于真核细胞同样活性较高。这种特异性赋予了动物先天性免疫力, 和先天性免疫力相对的是获得性免疫力, 主要通过B细胞和T细胞的克隆增殖得到, 目前对其研究较为透彻。因为大多数细菌增殖时间为20~30 min/代, 而特异性免疫反应的形成依赖于哺乳动物细胞的生长, 所需时间可能为数天或数周, 所以先天性免疫系统在对抗机体感染中非常重要。

2 抗菌肽的生物活性

抗菌肽是所有生物先天性免疫力的第一道防线, 在循环中性粒细胞内含量丰富, 具有重要作用。所有生物体内均可以产生抗菌肽, 因此各种体液和分泌物中均可以发现多种抗菌肽[3]。近年的研究表明哺乳动物防御肽具有多种功能, 能与宿主细胞受体相互作用, 参与宿主先天性免疫和适应性免疫。某些宿主抗菌肽如同天然抗生素, 拥有非常广的抗菌活性谱, 包括革兰氏阴性菌和阳性菌、真菌和病毒[4]。

抗菌肽作为免疫细胞的趋化因子参与炎症反应, 包括诱导IL-8产生、动员免疫活性T细胞, 还可作为细胞黏附增强剂参与细胞跨上皮迁移[5]。还可调节炎症反应, 通过C1q抑制补体经典途径激活。正常人体血浆α-防御素质量浓度经测定为40 ng/m L, 而感染时质量浓度增加至41 mg/m L, 败血症患者血浆α-防御素质量浓度为170 mg/m L, 囊性纤维变性患者痰中质量浓度为41 600 mg/m L[6]。

体外试验表明α-防御素活性取决于其质量浓度, 一般为10~100 mg/m L, 而高浓度的α-防御素才有助于溶解肿瘤细胞。组织被感染或患病时释放的防御肽浓度可能较高, 但具体局部浓度多少并未研究[6]。防御肽对于败血症患者是种抗炎症物质, 可结合脂多糖和脂磷壁酸, 可以中和内毒素[7]。

某些抗菌肽通过促进血管生成和上皮生长促进伤口愈合, 此外还具有趋化作用, 吸引循环细胞和迁移细胞。抗菌肽对单核细胞具有趋化性, 促肾上腺皮质激素受体可逆结合, 具有皮质醇稳定蛋白的功能[8]。抗菌肽可以有效抑制蛋白激酶C, 改变机体某些信号通路或细胞功能。

3 抗菌肽和机体先天性免疫系统调节

目前发现的抗菌肽有2 000多种, 其中哺乳动物研究比较清楚的是HNP系列和h BD系列。HNP-1, -2, -3是免疫调节剂, 当机体单核细胞被细菌激活时, 可上调肿瘤坏死因子α (TNF-α) 和IL-1的表达[9]。而且HNP-1, -2可直接杀灭革兰氏阴性菌和阳性菌、白色念珠菌以及包膜病毒 (如疱疹病毒) 。HNP-5对大肠杆菌、单核细胞李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌的杀菌活性与其浓度有关[10]。

h BD-1可于不同组织中结构性表达, 主要在消化道和尿道上皮层中表达。不同研究表明当体内脂多糖 (LPS) 、热失活绿脓杆菌和干扰素 (IFN-γ) 含量上升时, 可使h BD-1表达上升[11]。不同于其他皮肤伤口处抗菌肽, h BD-1没有具体的作用方式。而h BD-1对革兰氏阴性菌株 (如大肠杆菌和绿脓杆菌) 有特殊的杀灭作用。

h BD-2最初于银屑病患者皮肤伤口中分离得到。角质细胞、消化道和呼吸道中h BD-2表达较为普遍。h BD-2储存于角质细胞的板层体中[12], 可直接由病原菌或炎性细胞 (如单核细胞源性、巨噬细胞源性或淋巴细胞源性细胞) 上调表达[13]。h BD-2的表达涉及几种机制和信号途径。CD14和TLR-2检测细菌脂多糖, 之后激活NF-κB级联, 诱导h BD-2产生。上调后h BD-2具有免疫刺激性, 趋化未成熟树突状细胞和T细胞, 调节适应性免疫反应[14]。h BD-2是一种可诱导的宿主防御肽, 当皮肤表层损伤或患炎症后机体固有免疫力激活, 参与伤口修复。调节h BD-2在上皮组织中的上调作用的物质为促炎性细胞因子, 如IL-1、IL-2、细菌脂多糖以及细菌与上皮细胞的直接接触[15]。h BD-2激活后可直接杀灭绿脓杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌。h BD-2还可与IL-37协同, 增加对金黄色葡萄球菌的抗菌活性[16]。

同h BD-2类似, h BD-3储存于皮肤角质细胞板层体中。TNF-α、转化生子因子α (TGF-α) 、胰岛素样生长因子1 (IGF-1) 、TLR-5、IL-1α、IFN-γ、TGF-β以及多种细菌均参与激活h BD-3合成并起着重要作用[17]。测试大量细菌后发现, h BD-3对革兰氏阳性菌和阴性菌具有广谱抗菌活性, 包括多种耐药菌株, 如金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌[18]。

4 结论

抗菌肽的研究进展 第5篇

1 抗菌肽的结构

1.1 一级结构

据报道, 已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种, 且一级结构都比较相似, 具有以下典型的特征[2]:由30多个氨基酸残基组成的肽链, 其N端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸, C端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸, 中间部分则富含脯氨酸, 且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基, 这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的, 另外一些天然抗菌肽的C端往往是酰胺化的, 这与抗菌肽的广谱抗菌活性有关。

1.2 二级结构

通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征, 结果表明, 抗菌肽在一定条件下形成α-螺旋和β-折叠结构。α-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构[3], 即圆柱形分子的纵轴一边为带正电荷的亲水区, 而对称面为疏水区。这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键, 改变α-螺旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。抗菌肽有许多保守序列, 在N端易形成α-螺旋, 中间部分易形成β-折叠或铰链。α-螺旋肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽magainin、cathelindia等, β-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等。

2 抗菌肽的生物学特性

2.1 广谱抗微生物

当前畜禽疾病多为混合感染, 传统的抗生素抗菌谱一般都较窄, 且只对细菌有效。而大多数抗菌肽对革兰氏阴阳性菌均有效, 有些还对真菌、病毒、寄生虫、原生动物有抑制或杀灭作用。实验证明, 抗菌肽可以杀死草履虫、变形虫、四膜虫。柞蚕抗菌肽D对阴道毛滴虫有杀伤作用[4]。

很多研究表明, 某些类型的抗菌肽有抗DNA、RNA病毒的作用。Melittins (蜂毒素) 和Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖。Magainin-2及合成肽Modelin-1和Moderln-5对疱疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制效果。Wachinger M等报道天蚕素能抑制艾滋病病毒。华南农业大学研制的蚕抗菌肽AD对鸭乙型肝炎DNA增殖有抑制作用。

2.2 作用快速、安全、无残留

由于分子较小, 在机体受到侵犯时, 几分钟内就能产生, 且扩展扩散速度比体内免疫细胞更快更灵活。抗菌肽独特的抗菌机理更形成了不耐药的特性, 这就超越了抗生素的局限, 是新一代的高效抗菌剂。动物食品安全有赖于生产过程的各个环节, 使用无污染、在动物体内无残留、无毒副作用的添加剂是解决问题的关键。抗菌肽是动物体成分之一, 参与生命过程, 是小分子短肽, 具有安全无毒副作用的生物学特性。

2.3 抗菌肽的结构和生物学活性的关系

抗菌肽生物学活性与空间结构之间存在密切的关系。Jaynes J M等曾利用计算机模拟技术以天蚕素B为蓝本, 在不改变二级结构的前提下合成了1个与一级结构相差60%的shiva-1。结果发现, 与天蚕素B相比, shiva-1的抗菌活力比天蚕素B更强, 作用范围更广, 可抑制原虫的生长而对未受侵染的寄主细胞没有伤害。这一结果预示着天然抗菌肽并非完美无缺, 在某一方面可能存在着很大的被改造的潜力。因此, 设计并改造已存在的天然抗菌肽, 获取具有抗肿瘤和抗病毒作用的新型抗菌肽已成为该领域研究的重要方向。

3 抗菌肽的作用机理

3.1 α-螺旋型抗菌肽

研究表明, α-螺旋肽如昆虫cecropins, 通过其两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上的负电荷之间因静电吸引而结合在细胞膜上, 再借助于其分子中N端和C端间连接结构的柔性, 抗菌肽分子中的疏水端插入到细胞膜中, 然后两亲性的α-螺旋也插入到细胞膜中, 这样就破坏了脂质双层原来的有序结构。由于α-螺旋具有两亲性, 所以抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起, 从而在膜上形成离子通道, 使细菌因不能保持正常的渗透压而死亡[5]。

3.2 β-折叠型抗菌肽

折叠肽如哺乳动物防御素, 其杀菌机理类似于Ceropins在膜上形成离子通道, 即离子通道在抗菌活性中起着重要作用。亦有人提出假设, 认为一些抗菌肽分子作用于细菌细胞膜蛋白引起凝集、失活及离子通道的破坏, 导致膜的通透性改变而使细菌死亡。另有人提出有些抗菌肽分子 (如PR-39) 通过影响细菌细胞膜上的能量转运和代谢, 从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细菌。抗菌肽还可以断裂癌细胞的核DNA, 通过抑制DNA的合成而杀死癌细胞。总而言之, 抗菌肽作用机理的关键在于通过物理方式和细胞膜发生作用, 不同类别的抗菌肽其作用机理可能不同。

3.3 抗菌肽作用机理的特点

3.3.1 作用部位的有效性:

传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能, 如阻挠细菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌目的, 而细菌通过改变一种基因就足以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则作用于细菌细胞膜, 导致膜的通透性增大, 以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改变膜的结构, 即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻, 而这几乎是不可能的。因此, 抗菌肽极大地减少了产生耐药性的可能[6]。

3.3.2 作用对象的选择性:

抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用, 对正常的真核生物细胞不起作用。原因在于原核生物和真核生物的细胞膜结构不同, 真核细胞膜中含有大量的胆固醇, 而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外高等动物存在高度发达的细胞骨架系统, 其存在也抵抗了抗菌肽的作用。癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发达, 这是抗菌肽对其产生抑制作用的原因之一。

4 抗菌肽的作用机制

4.1 胞膜攻击作用

大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构, 引起胞内水溶性物质大量渗出, 从而最终导致肿瘤细胞和细菌死亡。其中抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。昆虫天蚕素抗菌肽分子是通过其两亲性α-螺旋上正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上, 随后抗菌肽分子中的疏水段C端 (酰胺基) 螺旋插入到疏水的细菌细胞膜中央, 双亲的α~螺旋留在质膜表面, 打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序, 使得膜外正电荷增多, 超过阈值时导致膜去极化。由于抗菌肽分子的a-螺旋是亲水、疏水两亲性的, 所以当抗菌肽分子相互聚集在一起时可形成离子通道, 导致阳离子外流, 最后细菌失去保护, 不能保持正常的渗透压而死亡。从猪小肠中分离得到的抗菌肽Cecp与天蚕素的作用机制类似, 也是通过膜攻击来完成对细菌的杀伤, 但其C端为羧基而非酰胺基, 抗菌谱也有所不同, 其作用机制主要是通过碱性氨基酸与细菌外膜表面的磷脂酰头部结合, 由于分子的旋转导致Cecp的疏水残基与膜的疏水区结合, 超过阈值时, 则在质膜上形成瞬时小孔, 导致菌体内容物溢出, 菌体崩解死亡。防御素作用于细胞膜, 可增加生物膜的通透性而发挥作用。人工脂质膜的实验显示防御素作用于膜上形成稳定的通道, 且具依赖电压的传导特性。尽管防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔, 但其分子结构和电生理研究提示, 防御素分子能以多聚体的形式作用于胞膜。有学者基于抗菌肽HNP-2与生物膜疏水区和极性区的作用方式、形成膜孔的大小等, 提出由6个防御素分子的同源二聚体组成1个穿孔环的模型。防御素介导的胞膜损伤与细菌克隆能力的丧失一致, 但现尚不清楚这种胞膜损伤是否能单独导致肿瘤细胞或细菌死亡, 或尚需其他机制如细胞内某些事件的参与。

4.2 诱导细胞凋亡

Mai[7]等以融合抗菌肽DP1局部注射到小鼠实体瘤内, 并研究DP1对肿瘤细胞株MCA20凋亡的影响, 结果发现DP1可迅速诱导凋亡, 并使肿瘤体积缩小。Chen等以抗菌肽RGD-tachyplesin作用于前列腺癌细胞株TSU, 以荧光免疫法和Western印迹杂交法检测, 结果发现凋亡相关蛋白caspase 9、caspase8、caspase3以及Fas配体表达均升高, 提示抗菌肽RGDtachyplesin可以诱导与Fas相关的凋亡。因此诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一。

4.3 线粒体攻击作用

线粒体是细胞能量代谢最重要的细胞器。Bobek等以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌, 发现MUC7 20对真菌和细菌都有很强的杀伤作用。超微结构发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则, 核膜界限不清, 有的核破裂, 内容物溢出。提示抗菌肽MUC7的作用机制可能与抑制肿瘤细胞呼吸有关。Chen[8]等也发现抗菌肽Tachyplesin的作用机制与抑制线粒体相关的caspase 7和caspase 6蛋白有关。Fehlbaum等发现Thanatin在0.3~0.6"mol/L时, 就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高到70"mol/L时, 仍然检测不到细胞内K+的泄漏, 提示Thanatin不是通过形成离子通道来杀灭细菌。当利用40"mol/L的Thanatin处理细菌时, l h后可检测到细胞的呼吸作用变弱, 6 h后完全停止。由此认为Thanatin是通过抑制细胞呼吸作用来杀菌的。

4.4 对细胞核染色体的影响

以往的研究多集中于抗菌肽对细胞膜的破坏作用, 但Hariton等以具有同源性的两种抗菌肽der-maseptin S4, dermaseptin S4 (13) 作用于He La肿瘤细胞株, 荧光免疫染色发现S4不能进入到肿瘤细胞内部, 尽管S4 (13) 分子量较小, 可以进人到细胞内部, 但不能结合到细胞核上, 对其进行氨基酸序列加工改造后获得的新型抗菌肽PV-S4 (13) 和RR-S4 (13) 却具有更强的穿透性, 也可以结合到肿瘤的细胞核上。荧光显微镜观察发现, 经这两种改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞DNA出现断裂, 并导致最终死亡。推测抗菌肽可以通过直接作用于肿瘤细胞的染色质发挥杀伤作用。

4.5 对癌细胞骨架的断裂作用

Chen等研究了天蚕素B、B1、B3的抗肿瘤作用机制。这3种抗菌肽在空间结构和氨基酸序列上存在着一定差异, 但又有一定的同源性。通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现, 3种抗菌肽都可以使细胞的双分子层发生溶解, 微管崩解, 肿瘤细胞皱缩、死亡。并且这种杀伤作用的效率与3种抗菌肽的空间结构和成分密切相关, 证实了抗菌肽不仅可以通过使细胞膜发生穿孔, 而且还可以通过破坏微管的正常功能, 影响细胞骨架的完整性, 阻止纺锤丝形成和有丝分裂, 破坏细胞器, 杀伤肿瘤细胞。虽然抗菌肽对肿瘤细胞和正常人体细胞的细胞骨架均有一定损伤, 但后者骨架系统完整, 修复快, 不会造成不可逆损伤。而肿瘤细胞骨架不完整, 经抗菌肽作用后, 得不到及时修复, 最终导致死亡。

4.6 抑制蛋白质及细胞壁合成

Harder[9]等发现人的抗菌肽B-defensin-3能够抑制细菌细胞壁的形成, 使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻, 并使细胞壁穿孔, 最终导致肿瘤细胞死亡。

目前发现抗菌肽的多种作用机制中, 膜攻击理论被认为是抗菌肽的最主要作用途径。当然同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用, 了解不同抗菌肽的作用机制有助于对抗菌肽的临床应用前景及可能产生的问题有充分的认识, 使研究开发更具有针对性。但是抗菌肽的研究到临床应用还有很多问题需要解决, 如抗菌肽的抗原性、致癌性、进人体内后能否如体外实验一样有效, 特别是天然抗菌肽往往来源困难, 人工合成又价格非常昂贵, 成为抗菌肽研究和应用的瓶颈。相信随着对抗菌肽理论和应用上的深人研究, 抗菌肽必将作为一类新型药物对人类健康产生深远的影响。

5 抗菌肽的应用及前景

鉴于抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、广谱抗菌等特点, 将抗菌肽基因导入植物体内来改造物种, 以获得抗病植株。1991年, 美国路易斯安纳州立大学的Jaynes实验室与国际马铃薯中心 (CIP) 的Dodds合作, 将Shiva-1基因转入烟草和马铃薯, 其中, 转基因烟草青枯病发病明显延迟, 病情指数低下, 植株死亡率降低。我国由863计划立题, 也已将Cecropin B及Shiva基因等转入我国6个马铃薯主栽品种, 温室初步获得与国外同样结果。抗菌肽转基因植物的研究为获得抗病植株提供了广阔前景。

同样, 抗菌肽转基因动物可明显地提高动物的抗病能力。1998年, Reed[10]等将Shiva la基因转入小鼠中, 结果表明, 转基因鼠对布鲁氏杆菌病抵抗力明显增加, 这可能对其它哺乳动物也起作用。昆虫是许多人类疾病的传播媒介。1997年, Durvasula等将Cecropin A转入昆虫红猎蝽 (Rhodnius prolixus) 中, 转基因后的昆虫体内锥虫数量明显减少或消失。这为人类提供了新思路, 即通过转基因构建一个新品系来中断疾病的传播途径。

细菌病的防治是长期以来困扰人类的难题, 特别是随着青霉素等传统抗生素的长期广泛应用, 许多细菌都产生了明显的耐药性。因此, 开发全新的抗菌药物已迫在眉睫。随着新的抗菌肽的不断发现和对抗菌肽作用机制的不断深入了解, 具有广谱抗菌及全新抗菌机制的抗菌肽显然有着明显的优势。

目前, 临床应用的抗真菌药的副作用很大, 且价格很高, 而且大部分的植物病害是由真菌引起的。研究表明, 抗菌肽对某些真菌也有强大杀伤力。这为研制新型的抗真菌药物提供了新的途径。

癌症是人类疾病中的一大难题, 目前使用的化疗药物能杀死癌细胞, 但也同时杀死人体内正常细胞, 副作用极大。抗菌肽能抑制某些肿瘤细胞的生长, 而对人体正常细胞无害, 这给抗癌药物的开发带来了希望。美国费城马盖宁制药公司已于1990年开始对青蛙皮肤抗菌肽 (magainin) 进行结构与分子设计, 筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有杀伤作用的小肽MA1-78, 目前已进入临床Ⅲ期实验。1998年, Wachinger研究得出, 蜂毒素和天蚕素可以在亚致死浓度抑制艾滋病毒HIV-1基因的表达, 表明抗菌肽对艾滋病也有抑制作用。对抗菌肽的抗病毒潜能的研究将对艾滋病药物的开发具有深远意义。

6 结束语

抗菌肽作为动植物免疫防卫系统产生的一类活性小肽, 具有分子量小、耐热和广谱抗菌等特点。最新报道, 中国科学院上海生命科学研究院与细胞生物学研究所分子学国家重点实验室张永莲研究组以及香港中文大学陈小章研究组合作, 在国际上首次报道了从大鼠附睾头部上皮细胞中成功克隆到1个特异表达的新基因, 并观察到该基因所编码的多肽具有抗菌功能, 它可能与生育有关。这是第一个在附睾中发现的天然抗菌肽家庭的新成员, 有望发展为特异的治疗男性附睾炎的新型药物。随着人类对抗菌肽特别是哺乳类动物抗菌肽在理论和应用上全面研究的日益深入发展, 抗菌肽必将对人类产生深远的影响。

摘要：抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。本文介绍了抗菌肽的结构, 抗菌肽的生物学活性, 抗菌肽的作用机理和作用机制, 以及抗菌肽的应用和前景。

关键词：抗菌肽,生物学活性,作用机理

参考文献

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猪抗菌肽 第6篇

1 仪器试剂与方法

1.1 药品与试剂

菌株:白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌, 人工合成抗菌肽:包括Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb, 均购自于上海吉尔生化有限公司;牛肉膏蛋白胨液体培养基、水等。

1.2仪器

标准96孔微量板 (Sigma公司) ;超净工作台SW-CJ-2FD (苏净集团苏州安泰空气技术有限公司) ;台式恒温振荡器THZ-C (海门市麒麟医用仪器厂) ;分析天平CP224S (Olympus) ;显微镜CX21FS1 (Olympus) ;酶标仪 (Thermo) ;数昱立式压力蒸气灭菌锅YXO-LS-30SⅡ (上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ;烘箱WK891 (天津市泰斯特仪器有限公司) 。

1.3 方法

人工合成抗菌肽的筛选原则为100μm人工合成抗菌肽与105 CFU/ml菌液作用, 抑菌率达90%以上, 行最小抑菌浓度检测。操作如下:通过接种环, 将菌株从斜面培养基上取下, 转入10 ml LB液体培养基中, 在恒温振荡培养箱中37℃过夜, 使菌株处于对数生长期。用血球计数板进行计数, 用LB液体培养基稀释至2倍。将人工合成抗菌肽分别用无菌水溶解。实施分组, 实验组为抗菌肽+菌株, 对照组为菌株+水、水+LB培养基、LB培养基+抗菌肽。恒温箱中培养过夜, 600 nm下测量吸光值。抑菌率 (%) =1-[ (抗菌肽+菌株组) 吸光值- (LB培养基+抗菌肽组) 吸光值]/[ (菌株+水组) 吸光值- (水+LB培养基组) 吸光值]×100%。抑菌率达90%以上时, 人工合成抗菌肽的浓度为最小抑菌浓度。

2 结果

2.1 人工合成抗菌肽对口腔细菌抑制情况分析

chen-sinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa对白色念珠菌具有较高抑菌率;Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb对具核梭杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌具有较高抑菌率;Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb对嗜酸乳杆菌具有高抑菌率。见表1。

2.2人工合成抗菌肽对口腔细菌的最小抑菌浓度分析

Brevinin最小抑菌浓度:血液链球菌>具核梭杆菌>唾液链球菌>变异链球菌>嗜酸乳杆菌;chensinin-1最小抑菌浓度:嗜酸乳杆菌;chensinin-1b最小抑菌浓度:嗜酸乳杆菌>唾液链球菌>血液链球菌>具核梭杆菌>白色念珠菌>变异链球菌;L-K5V1最小抑菌浓度:嗜酸乳杆菌>具核梭杆菌>变异链球菌>白色念珠菌>唾液链球菌>血液链球菌;L-K6最小抑菌浓度:唾液链球菌>血液链球菌>白色念珠菌>变异链球菌>具核梭杆菌>嗜酸乳杆菌;L-K6V1最小抑菌浓度:嗜酸乳杆菌>血液链球菌>唾液链球菌>白色念珠菌>具核梭杆菌>变异链球菌;L-K6V2最小抑菌浓度:白色念珠菌>变异链球菌>唾液链球菌>嗜酸乳杆菌>具核梭杆菌>血液链球菌;Temporin-1CEa最小抑菌浓度:白色念珠菌>具核梭杆菌>唾液链球菌>嗜酸乳杆菌>变异链球菌>血液链球菌;Temporin-1CEb最小抑菌浓度:唾液链球菌>具核梭杆菌>变异链球菌>血液链球菌>嗜酸乳杆菌。见表2。

3 讨论

目前, 较为常见的口腔细菌有白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌。白色念珠菌是一种真菌, 通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道, 一般在正常机体中数量少, 不会引起疾病, 当机体免疫功能或一般防御能力下降时, 或正常菌群相互制约作用失调时, 白色念珠菌大量繁殖并改变生长形式 (芽生菌丝相) 侵入细胞引起疾病。具核梭杆菌是一种革兰阴性口腔共生菌, 但它有潜力致病, 有时会引起牙周病, 在口腔乃至全身感染性疾病中检出率极高, 有研究显示[5,6], 大肠癌患者相关组织中存在大量具核梭杆菌, 显示两者之间可能存在某种关联。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属, 不仅存在于口腔中, 还存在于胃及小肠中, 是人体的主要益生菌之一。有研究显示, 嗜酸乳杆菌对口腔白色念珠菌有明显的抑制作用[7]。变异链球菌是主要导致口腔龋齿的细菌之一, 常见于牙菌斑中, 可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。唾液链球菌属于口腔正常菌群, 与健康者相比, 口臭者口腔中唾液链球菌数量较少。有研究表明[8,9], 唾液链球菌可以产生某种细菌素, 对口臭相关细菌有抑制作用。血液链球菌是口腔正常菌群之一, 随着牙齿的萌生早期定植牙面, 通过植物血凝素样附着素, 非植物血凝素样附着素与唾液中受体特异结合, 粘附于获得性膜上, 以疏水作用维持其稳定, 可与多种细菌发生聚集反应, 在龈上, 龈下菌斑形成中起重要作用, 血液链球菌通过产生过氧化氢和血链素拮抗牙周病的可疑致病菌, 是牙周主要有益菌。

诸多研究显示[10,11], 抗菌肽在口腔科中的应用较常见, 在抑制和杀死微生物抗菌活性的同时, 还可以对细菌生物被膜的形成过程有一定作用, 对机体免疫系统有一定调节作用。尤其是炎性反应, 抗菌肽可以对炎性因子的释放实施调控, 进而控制炎性反应。目前, 抗菌肽已成为生物保健、医药卫生、食品化工等多个领域的研究热点。人工合成抗菌肽在临床中的应用具有诸多优势[12,13]。

此次研究选用了Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb, 对口腔细菌抗菌性能进行了分析。本研究结果显示, 9种人工合成抗菌肽对6种口腔细菌的抗菌性能是不同的。由人工合成抗菌肽对口腔细菌的最小抑菌浓度分析, Temporin-1CEa的最小抑菌浓度较小, 且抑菌效果佳, 具有较高临床应用价值。以Temporin-1CEa为例进行分析, 抗菌肽对炎性反应具有明显的抑制作用。炎症是机体对抗外界造成的伤害和感染的第一个步骤, 是一个复杂程序, 生物机体会释放炎性因子和介质, 将其运输到感染部位, 用于消除感染因子, 而过度炎症是有害的。抗菌肽发挥着免疫调节的功能, 免疫在针对感染和炎症的威胁时发挥着重要作用, 而抗菌肽是宿主免疫系统的重要组成部分。抗菌肽还具有趋化活性, 能够充当吞噬细胞及单核细胞的趋化因子, 有效刺激单核细胞与中性粒细胞趋化因子的生成, 在炎性反应的发生部位聚集, 帮助解除炎症威胁。

猪抗菌肽 第7篇

抗菌肽的研究已从分离、提纯深入到分子结构、作用机制等多个方面。随着对抗菌肽结构与功能、与生物膜相互作用机理、基因工程等研究的深入, 抗菌肽在医疗、农业等领域显现出广阔的应用前景。目前, 抗菌肽已经成为研究蛋白质结构与功能的理想材料, 已应用于食品防腐、临床治疗、动植物抗病、饲料添加剂等多个领域。

不同来源的抗菌肽序列具有较强的保守性, 其一级结构具有共同的相似性:N端富含亲水性碱性氨基酸残基加赖氨酸、精氨酸;C端富含疏水性氨基酸, 而且多肽的C端酰胺化会增强杀菌能力[1]。二级结构具有一定的差异, 按分子结构可将其分为4类:1) α-螺旋结构类, 分子质量约为4 ku, 不含半胱氨酸, 不形成分子内二硫键, N端富含亲水性碱性氨基酸残基, C端含较多的疏水性氨基酸残基;2) 伸展性螺旋结构类, 此类抗菌肽不含半胱氨酸, 富含脯氨酸和精氨酸或色氨酸等, 由15~34个氨基酸残基组成, 在两性分子内部形成分子内α-螺旋;3) 环链结构类, 此类抗菌肽在C端有1个分子内二硫键, 形成1个环链结构, 而N端为线状结构;4) β-折叠结构类, 此类抗菌肽分子内有2~6个二硫键, 分子质量为4~6 ku[2]。抗菌肽的二级结构及空间结构不同, 致使其生物学功能和抗菌作用机理不同。近年来, 对抗菌肽的抗菌机理及构效关系的研究越来越多, 本文就此问题作一综述。

1 抗菌作用机理

人们对抗菌肽的作用机理有多种不同的看法。一般认为, 抗菌肽主要是作用于细菌的细胞膜, 通过破坏细胞完整性来发挥抗菌效应。

1.1 细胞膜损伤机理

持细胞膜损伤作用机制观点的学者认为, 抗菌肽首先通过静电作用, 分别作用于革兰阳性细菌表面的脂磷壁酸及革兰阴性细菌表面脂多糖的阴离子磷脂和磷酸基团, 吸附到细菌的表面, 进而穿过细胞壁与细胞膜结合。随后, 疏水端借助分子中连接结构的柔性插到细菌细胞膜中, 并牵引整个分子进入质膜, 扰乱质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序;多个抗菌肽分子间通过相互位移而聚合形成跨膜离子通道。这样, 抗菌肽可以在细菌质膜上形成跨膜离子或溶质通道。细胞膜出现通道, 引发细胞内水溶性物质大量渗出, 胞内三磷酸腺苷含量下降, 细菌不能保持其正常渗透压而死亡[3]。不论是α-螺旋结构、伸展性螺旋结构, 还是β-折叠构型, 膜通道的形成能力与抗菌肽的抗菌活性有着密切的联系。目前, 能较好地解释膜通道形成机制的模式有“木桶板”、“地毯”和“环孔”模式。

木桶板模型是由多个抗菌肽螺旋在膜内形成中空的螺旋束, 从而形成跨膜孔。抗菌肽的疏水残基排列在螺旋束外侧与膜脂相互作用, 而亲水残基排列在螺旋束内侧组成内孔, 形成一种类似离子通道结构, 使内外膜电势失去平衡, 导致细菌细胞死亡。

地毯模型是指抗菌肽通过静电作用与带阴离子的磷脂头部基团互相吸附, 积累在脂质双分子层表面, 平行排列, 像地毯一样覆盖在细菌细胞膜表面。当浓度达到一定阈值时, 膜破裂并产生微团, 形成临时的环形孔道, 扰乱脂质双分子层而导致膜解体。

环孔模型是抗菌肽分子垂直插入膜内引起外层磷脂分子排列方向随之改变, 同时水分子嵌入, 诱发了内层磷脂分子变向, 最后形成跨膜的环孔。该模型与木桶板模型不同, 抗菌肽分子一直与磷脂分子的亲水头部结合, 而且孔径也比前者大。

1.2 胞内损伤机理

持胞内损伤机理的学者认为, 抗菌肽主要作用于胞内, 积聚在膜外的抗菌肽首先必须穿过细胞膜, 因此形成了一种独特的抗菌机制。抗菌肽一旦穿过质膜, 它可能通过结合DNA阻断DNA复制、抑制RNA合成、影响或阻止蛋白质翻译, 抑制正常蛋白质折叠或促使蛋白质错误折叠, 抑制与隔膜形成相关的膜蛋白合成, 从而抑制细菌隔膜形成及细胞壁合成, 以线粒体抑制细胞呼吸等方式影响细胞正常生理活动, 最终导致胞内损伤或死亡。这类抗菌肽通常富含脯氨酸或精氨酸, 可有效穿越细胞膜[4]。

J.Harder等[5]研究发现, 人的抗菌肽β-defensin 3能够抑制细菌细胞壁的形成, 使细菌不能维持正常的细胞形态, 其生长受阻, 细胞壁穿孔, 最终导致细菌死亡。L.A.Bobek等[6]以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌。结果发现, MUC7对真菌和细菌都有很强的杀伤作用。在超微结构中发现:线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和不规则排列;核膜界限不清;有的核破裂, 内容物溢出。说明抗菌肽可以通过抑制细胞呼吸而起到杀菌作用。

2 构效关系

随着科技的进步, 人们对抗菌肽的研究已从分离、提纯发展到对其一级结构、空间结构的研究, 这为人工设计、合成理想抗菌肽的研究提供了科学依据。研究发现, 影响抗菌肽抗菌活性、抗菌谱及细胞毒性的因素主要有电荷数、肽链长度、特殊氨基酸、两亲性、疏水性和螺旋度等, 且各影响因素之间互相制约, 单个因素与抗菌活性之间并不是正相关的关系。

2.1 正电荷

正电荷数不但影响抗菌肽的二级结构和亲水性, 同时还会改变抗菌肽的三级结构及其在水溶液和细胞膜上存在的形态, 电荷对肽单体或多聚体的潜在影响可能包括螺旋结构的稳定化和去稳定化作用[7]。抗菌肽的正电荷有助于其与靶细胞胞膜的接触, 但抗菌肽正电荷数和抗菌活性间并无绝对正相关性。H.S.Ahn等[8]截取不具有抗菌活性的Tenecinl螺旋区域L1 (DAACAAHCLFR) , 用Lys替代其中的Asp和His得衍生肽L4, 正电荷数由2增加到5, L4具有很强的抗菌活性, 且无溶血性。S.T.Yang等[9]报道, Tritrpticin衍生物在正电荷数大于5之后, 抗菌活性不再随正电荷数增加而升高。T.Pal等[10]用Lys替代Pseudin-2的α-螺旋亲水面的中性或酸性氨基酸残基, 结构类似物抗菌活性最高增加16倍, 继续增加Lys替换数目, 抗菌活性不再升高。

2.2 肽链长度

很多学者一直认为, 抗菌肽链的长度是影响其生物学功能的主要因素。起初研究者认为, 跨膜通道的形成, 最少应含20个氨基酸残基, 但后来发现有些仅由12个氨基酸残基组成的抗菌肽也可形成跨膜通道。通过对肽的N端或C端进行酶解发现, 不同肽在不同部位功能不同。可能是由于肽链长度的改变使抗菌肽的疏水性、二级结构及在水溶液和细胞膜上的状态受到了影响, 从而改变了其结合膜的能力。

2.3 特殊氨基酸

抗菌肽分子中的一些氨基酸对其活性有很大的影响, 氨基酸的替换会改变抗菌肽的抗菌活性。有学者用单碱基突变法研究牛乳铁传递蛋白的抗菌肽LFB, 用Ala取代其第6位和第8位的Trp, 发现其中任何一个Trp被取代, 都会造成抗菌肽LFB抗菌活性丧失。K.Lee等[11]将天然抗菌肽Is CT的第6个氨基酸残基Trp替换为Ala, 人工合成抗菌肽Is CT。结果发现, 人工合成的抗菌肽Is CT的抗菌活性大大降低。M.V.Sawai等[12]用Gly取代抗菌肽Ovispifin-1第10位的Lle, 结果抗菌活性得到大大提高。

2.4 两亲性 (疏水力矩)

天然抗菌肽的疏水性和两亲性具有很大的可变性, 但两亲性在其抗微生物活性中起关键作用。N.Pathak等[13]研究发现, 蜂毒素的抗菌活性和溶血性会随着两亲性降低而减弱, 直至消失。也有报道称, 两亲性的变化比疏水性和螺旋度的变化对抗菌活性的影响更大[14]。

2.5 疏水性

疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用:增加分子的疏水性, 抗菌肽的抗菌活性和对哺乳动物细胞的毒性同时增加;减小分子的疏水性, 将导致抗菌肽对膜的插入能力下降, 降低抗菌活性。另外, 由于疏水基团的存在, 肽链在溶液中可以通过疏水作用形成多聚体, 从而增加对真核细胞膜的亲和力, 同时也可增加抗菌肽形成α-螺旋的能力, 而α-螺旋的增加又可提高抗菌肽的稳定性;但疏水程度必须保持在一定范围内。研究表明疏水性和抗菌活性之间并无绝对正相关。

疏水作用对抗菌肽活性的影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val数量进行的。有学者合成C端氨基化的抗菌肽TP (VRRFPWWWPFLRR) , 后分别用Phe、Leu、Lys替换第5位和第9位Pro, 其中TPF和TPL疏水性有所提高, 抗菌活性优良但溶血性随之大增;而TPK疏水性下降, 抗菌活性增强, 溶血性明显下降。这表明, 疏水性变化对抗菌肽溶血性的影响比对抗菌活性影响更大。还有学者研究发现, 疏水性比例存在一个最优范围, 在此范围内抗菌活性最高, 在此之外抗菌活性急剧下降。

抗菌肽在所带净正电荷基本相同的情况下, 疏水性越强对中性细胞膜穿透能力越强, 但穿透电负性膜的能力基本相同。这是因为分子间的静电作用力降低了疏水相互作用, 影响了抗菌肽穿透膜的过程。

2.6 螺旋度

具有较高两亲性和稳定螺旋的区域是抗菌肽的活性中心部位, 螺旋结构是其主要结构。某些氨基酸有利于螺旋结构的形成, 而另一些氨基酸或氨基酸结构类似物会破坏螺旋形成。早期研究通过特定的氨基酸替换以提高抗菌肽的螺旋度, 从而提高抗菌肽对细胞膜的亲和力及抗菌活性。有学者使用甘氨酸类肽化合物Nh-trp替换蜂毒素第19位Trp, 合成了螺旋含量低于蜂毒素的类似物 (ME-W) 。试验显示, ME-W与ME虽然对6种测试细菌和白假丝酵母的抗菌活性基本相同, 但对膜呈电中性的人血红细胞 (h RBC) 、试验用增殖表皮癌细胞 (He La) 和胚胎成纤维细胞 (NIH/3T3) 毒性大大降低。由于抗菌肽活性受多种因素决定, 特殊氨基酸替换不仅可以改变螺旋度, 同时也可以导致其他结构参数的改变。因此到目前为止, 还没有定量描述抗菌肽螺旋度与抗菌活性相关的研究报道。

3 展望

在抗菌谱广、抗菌机理独特等方面, 抗菌肽比抗生素具有明显的优势。据报道:可运用基因工程技术表达抗菌肽基因, 用于临床预防和治疗某些病原微生物引起的疾病;可用抗菌肽作饲料添加剂治疗和预防断奶仔猪呼吸道疾病和腹泻, 效果明显;将抗菌肽基因转入畜禽特定细胞, 可产生抗病新品种或高效抗菌剂, 用于治疗仔猪腹泻、猪瘟、鸡新城疫和乳牛乳腺炎等各种疾病, 抗菌肽的前景十分乐观。

将抗菌肽应用于实际生产中还面临以下问题:天然抗菌肽资源有限, 提取工艺复杂;化学合成方法成本高, 产业化困难;抗菌肽分子质量较小, 容易被蛋白酶水解;抗菌肽分子的人工设计可最大限度提升抗菌肽的抗菌活性, 但重组抗菌肽的生物活性很难保证。