蛋白类多肽范文

蛋白类多肽范文（精选7篇）

蛋白类多肽 第1篇

1 蛋白质及多肽类的结构

现有文献表明, 蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。与以往小分子药物相比, 蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。

蛋白质和多肽药物及单克隆抗体的研究, 进展迅速。目前经批准的生物技术药物主要为重组蛋白质药物与单克隆抗体, 按照生物技术药物的结构分类可分为三种类型: (1) 与人多肽和蛋白质相同的自然存在的多肽和蛋白质。 (2) 密切相关但不同的多肽和蛋白质, 这一类与人多肽和蛋白质紧密相关, 但在氨基酸序列或翻译后修饰上有已知的差异, 可能会影响生物活性或免疫活性。 (3) 相关较远或无关的多肽和蛋白质, 如具有调节活性, 但和已知的人多肽和蛋白质不具有什么同源性的多肽和蛋白质、鼠源单克隆抗体、双功能的融合蛋白、经蛋白工程改造和模拟的活性蛋白。不同类型药物对安全性实验、药物的验证和评价的要求及策略有所不同[1]。在医药领域, 有许多疗效很好的蛋白质和多肽药物, 目前常见的主要有人胰岛素、人生长激素、干扰素 (INF-α、β、γ) 、组织纤溶酶原激活物 (t-PA) 、促红细胞生成素 (EPO) 、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和白介素-2 (IL-2) 等, 此类药物在临床上主要应用于抗肿瘤, 刺激造血, 如:EPO、G-CSF、GM-CSF;补充和替代治疗如:人胰岛素、生长激素[1]。

2 蛋白质的提取[2]

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质有稳定性好、溶解度大的特点, 是提取蛋白质最常用的溶剂。

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶, 不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中, 可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂作为提取液, 但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越, 且该法的pH值及温度选择范围较广。

3 蛋白质的分离纯化[3]

3.1 反相高效液相色谱

被广泛应用于分子量不大的蛋白质分离、纯化和鉴定上, 所使用的反相液相色谱法 (RPLC) 大约有95%是C18反相硅胶柱色谱法[4]。

3.2 根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同, 可将其分开。其中最常用的是电泳法:各种蛋白质在同一pH值条件下, 因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳, 此法可用于分析和制备各种蛋白质。比较常用的是SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳, 毛细管电泳在纯化蛋白的方面也得到了很好的应用[5]。

3.3 置换层析

置换层析一种非线性层析技术, 与传统的洗脱层析技术相比有着明显优点, 即高上样量、高产率、高分辨率, 以及被分离样品在分离过程中的浓缩效应, 这一技术已越来越引起人们的关注[6]。

3.4 大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂法是一类新型非离子型具有大孔结构的高分子化合物, 具有吸附和筛选性能, 易再生, 在分离纯化蛋白质时具有条件温和、设备简单和操作方便的特点[7]。

4 多肽和蛋白质药物的分析方法

4.1 生物检定法

多肽和蛋白质多肽为有活性的物质, 故首先建立了生物检定法。生物检定法通常是动物在体或利用组织 (细胞) 进行分析, 在体需要动物模型和外科手术, 耗时, 观察结果有主观性, 因而变异性大, 而且灵敏度低。用细胞测定的方法花费少、省时, 特别是随着分子生物技术的发展, 有许多特异性强、稳定性好、电子灵敏度高的方法依赖株被建立, 如IL-6的依赖株TTDI、BDF-2, EPO依赖株UT-7/EPO等, 使生物检定法更可靠, 灵敏度更高, 可测到1 pg下, 其最大优点是能反映生物活性。多肽类尤其是蛋白质须有一定的空间结构才能发挥其活性, 如其二、三级或四级结构被破坏, 虽一级结构完整, 也无生物活性, 此时, 它与一般的营养蛋白质并无本质的区别, 因而其他分析方法代替不了生物检定法。

4.2 放射性同位素标记法

放射性同位素标记技术一直是研究多肽和蛋白质药物的一种主要工具, 通常有两种操作方法, 一种是内标记, 即把含有同位素如3H、C或S的氨基酸, 加入生产细胞或合成同位素, 该步骤比较复杂因而限制了其广泛应用。另一种是外标法, 常用化学法将125I琏接于多肽或蛋白质上, 因相对简单而被运用。牛惠生等利用乳过氧化物酶 (IPO) , 放射性碘标物的放射性高、定位性好, 能最大限度地保持标记物的生物学和治疗活性的特点, 将其应用于蛋白质和多肽的标记技术中, 概括起来主要有三个方面: (1) 在放射免疫分析技术 (RIA) 和免疫放射分析 (IRMA) 中; (2) 在受体放射分析和细胞学研究中的应用; (3) 在临床上的应用, 主要用来确认肿瘤的存在、部位和大小[8]。

4.3 免疫学方法

蛋白质药物是一种抗原或是配体 (或受体) , 均有相应的抗体或受体 (或配体) , 可运用免疫学方法及受体配体结合方法定量测定其免疫活性或结合活性。目前常用的免疫学方法有放射免疫测定法 (RIA) 和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。

RIA历史悠久, 由于其成熟及灵敏度高, 目前仍在使用, 张颖沙等采用双抗放射免疫法 (RIA) 测定了大鼠垂体和血浆中生长激素 (GH) 和催乳素 (PRL) 含量, 结果显示该方法特异性强, 灵敏度高, 简易易行。但该方法目前已逐渐被ELISA所取代, RIA与其相比较, ELISA的优点是试剂寿命长, 重复性好, 自动化程度高, 测定的灵敏度可达到ng甚至pg水平, 无放射性危害等, 而且在有的实验研究中它与生物检定法有相似的量效曲线, 说明它能部分地反映生物活性, 现在被广泛应用于药物动力学研究。张红雨等采用酶联免疫吸附测定法测定人血浆纤维蛋白肽A (FPA) 水平, 从而探讨了冠心病的发生及发展与血栓形成关系[9]。汪家敏等用ELISA法检测实体肿瘤患者血清胸腺肽α1 (Tα1) , 这对于患者病情监测和疗效判断有较高的临床价值[10]。

4.4 色谱-光谱联用技术

由于生物样品中所含代谢物浓度很低, 过去的分离鉴定方法不仅繁琐, 而且费时。近年来不断发展成熟的色谱-光谱联用技术使色谱分离与光谱鉴定成为一个连续的过程, 它集色谱的高分离效能与光谱的强鉴定能力于一体, 分析快速且方便, 具有其他药物代谢物所不能比拟的优点。这些联用技术主要包括: (1) LC/DAD联用, 反向HPLC结合二极管阵列检测器DAD即LC/DAD联用可在生物样品众多的色谱峰中搜寻可能的代谢产物峰。 (2) GC/MS联用。 (3) LC/MS联用, 它集HPLC的高分离能力和MS的高灵敏度、强定性专属性于一体, 可获得复杂混合物中单一成分的质谱图[11], 现已用于多肽的分析[12]。 (4) LC/NMR联用, 近年来, LC/NMR联用技术在研究代谢产物, 特别是相代谢产物方面表现出了非常诱人的前景, 有关研究相继发表[13]。 (5) LC/NMR/MS联用, 这种联机系统实际上是两种检测手段 (NMR和MS) 的相互补充, 从该系统的色谱流出液中可直接得到UV、NMR和MS的信息, 为解析复杂的药物结构提供了全面信息[14]。

4.5 核磁共振法

核磁共振法 (NMR) 广泛应用于解析化学物质结构和反应性能, 并已发展为生物学和分子生物学的重要实验技术, 它主要应用于: (1) 核定蛋白质的微观物理化学性质; (2) 研究多肽和蛋白质溶液构成; (3) 研究蛋白质与辅基、酶与底物、抗体和抗原、受体和配基以及蛋白质与蛋白质或多肽、核酸及生物膜的识别和作用, 自旋回波法、磁化量转移法、NOE谱 (IDNOE差谱, NODSY和2D TENOE) 均已得到应用。滕荣伟等通过技术将植物环肽结构中每个氨基酸残基的NMR信号相互区分开, 从而准确归属每个氨基酸的氢和碳的化学位移[15]。

此外, NMR法还可研究金属蛋白质的结构和金属与蛋白质的相互作用, 并有助于药物分子设计等。 (1) NMR法不但可以提供蛋白质三维结构信息, 而且还能探讨蛋白质折叠过程中构象的动态变化及天然态蛋白质局部区域的运动。 (2) 蛋白质及其复合物的固态NMR主要研究其分子结构和分子内部的运动性。 (3) 蛋白质的生物功能特别是酶促反应动力学过程可以从NMR谱的线宽、弛豫时间和磁化转移等复数反映出来。总之, NMR已成为研究蛋白质和多肽结构和功能较成熟的实验技术。多维NMR谱已可以准确地测定由150个左右残基所组成的蛋白。随着超导技术、计算机和NMR之理论与实验的发展, NMR将成为生化和分子生物领域中重要的应用技术[16]。

5 展望

蛋白水解液中多肽含量的测定方法 第2篇

蛋白水解液中多肽含量的测定方法

用10%(W/V)的`三氯乙酸沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白质,经离心过滤后,在上清液中加入双缩脲试剂,于540nm下测定其OD值,继而在Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量.

作 者：鲁伟 任国谱 宋俊梅 LU Wei Ren Guo-pu SONG Jun-mei  作者单位：鲁伟,宋俊梅,LU Wei,SONG Jun-mei(山东轻工业学院,食品与生物工程学院,山东,济南,250100)

任国谱,Ren Guo-pu(湖南亚华乳业博士后工作站,湖南,长沙,410006)

刊 名：食品科学  ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE 年，卷(期)： 26(7) 分类号：Q51 关键词：双缩脲反应   三氯乙酸   多肽含量  

无苦卵清白蛋白多肽制备工艺研究 第3篇

鸡蛋是人类蛋白摄入的主要来源之一。一般鸡蛋中含有蛋清和蛋黄,其中,蛋清约占60%～63%,而卵清白蛋白占蛋清的54%。研究表明,卵清白蛋白与人血清白蛋白的各种氨基酸的组成和比例十分接近,因此两者所提供的营养价值和功能是相似的[1]。

卵清白蛋白肽是由卵清白蛋白经复合酶解及超滤、喷雾干燥等工序后所得到的肽类物质,分子量大多分布在1000D以内,可作为人体内源性肽类物质合成的物质基础和外源性高营养蛋白质的良好补充剂。现已证明,卵清白蛋白肽除具有补充必需氨基酸、维持血浆胶体渗透压及各种医疗作用外,对人体还具有如免疫调节、增强肠道有益菌群的繁殖、促进食物中核酸在肠道的吸收及在胸腺、肝脏等重要器官的分布等多种调节功能[2,3,4]。

作为肽类物质,卵清白蛋白多肽更易于被肠道吸收,并具有低过敏性的特点。所以,其对于婴幼儿、老年人、病后恢复期及胃肠道功能障碍患者等人群更具有显著的应用价值。

然而,由于卵清白蛋白多肽具有较大的苦味,易于发臭,口感差,很大程度上限制了它在普通食品中的应用。为了更好地利用卵清白蛋白多肽,本研究试图优化蛋白酶酶解工艺,再辅以一定的后处理方法进行口感修饰,制备出了无苦卵清白蛋白多肽,从而扩大了其在普通食品领域的应用范围。

2 材料与方法

2.1 原料、试剂、仪器

鸡蛋:市售鲜鸡蛋。

蛋白水解酶系列(诺维信(中国)生物技术有限公司);β-环糊精(食品级)。

电子天平;pH试纸;SHH-W21-600恒温水浴锅;LPG-5离心喷雾干燥塔(江苏常熟机械制造厂);其他辅助仪器等。

2.2 实验方法

2.2.1 苦味评价

选有经验的5人进行评判。苦味评分标准分为5个等级:以奎宁溶液做对比,无苦味其评分为1分;苦味弱其评分为2分;苦味中等评分为3分;苦味强评分为4分;苦味很强评分为5分。每份品尝样品为20mL,取卵清白蛋白多肽溶液,将溶液调pH6.5(用1 mol/LHCl或NaOH调节),并加热至60℃[5]。

2.2.2 蛋白质含量测定方法

按照GB5009.5-85微量凯氏定氮法。

蛋白回收率(%)=酶解上清液中蛋白质含量/总蛋白质含量×100%

2.2.3 多肽含量测定方法

三氯乙酸法测出酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。

2.2.4 卵清蛋白前处理

将鲜鸡蛋煮沸约20分钟,除去蛋黄、蛋壳,取卵清备用。

2.2.5 水解蛋白酶的选择

根据回收率和感官评价为指标,分别选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、蛋白水解专用酶1、蛋白水解专用酶2,判断其水解情况和口感。实验发现,蛋白水解专用酶1效果最为理想,苦味轻,无异味,结果见表1。

2.2.6 后处理工艺的选择

由于鸡蛋卵清蛋白含量低,相应的水解产率也低,在既保证收率,又不影响风味的情况下,本研究选用了β-环糊精对卵清白蛋白多肽进行包合处理[6]。

2.2.7 蛋白水解专用酶1的水解条件优化

为了确定蛋白水解专用酶1水解的最佳条件,得到较高的蛋白回收率,根据预备实验结果设计L16(43),实验因素水平见表2。

3 实验结果

3.1 水解工艺正交实验

经过预备实验,本研究得到各因素的最佳值。根据最佳因素值来确定它的使用区域,进行正交实验。正交实验分析结果如表3所示。

3.2 包合工艺的优化实验

确定了卵清白蛋白多肽制备的最适水解条件,本研究再以感官评价为指标,在预备实验的基础上优化其包合工艺(脱苦脱味),根据生产设备的实际情况(搅拌速度恒定)和保持产品质量的稳定,以包合温度、β-环糊精的添加量、包合温度三个因素,设计了L9(33)正交实验见表4,具体实验结果见表5。

3.3 实验结果分析

3.3.1 从表3中可以看出,

以蛋白回收率为指标时,各因素影响顺序为酶量>酶解时间>固液比>温度>pH;以多肽含量为指标时,各因素的影响顺序为温度>酶量>pH>固液比>酶解时间。综上两项指标和成本综合考虑,最适宜的工艺参数为A3B2C3D3E2,即料液比1:4,温度60℃,初始pH7.5,酶添加量E/S=0.75%,水解4小时。

3.3.2 通过对表5的直观分析,

对口感因素影响顺序为B>A>C。环糊精添加量和包合温度对产品苦味影响较大,其次是包合时间。该实验表明最适包合工艺参数为A3B2C1,即包合温度70℃,环糊精添加量为1.5%,包合1小时。

3.3.3 通过以上实验,

找出蛋白水解专用酶1对卵清蛋白的最适水解工艺条件:料液比1:4,温度60℃,初始pH 7.5,酶添加量E/S=0.75%,水解4小时。取第一步的水解液,通过正交实验找出了包合的最佳条件:包合温度70℃,环糊精添加量(以蛋清质量计)为1.5%,连续搅拌包合1小时,浓缩至一定体积,喷雾干燥得白色无苦味粉末。

4 讨论

随着人们认识的深入,卵清白蛋白多肽逐渐从功能食品中的应用,扩展到普通食品领域,而此处对卵清白蛋白多肽的口感和风味提出了更高的要求。一般地,直接用蛋白酶水解制备卵清白蛋白多肽容易产生苦味和臭味,所以一定要严格控制水解工艺过程。本研究主要通过对蛋白酶的选用和后处理方法的选择来有效提取卵清白蛋白多肽,达到了良好的提取率和口感效果,为无苦卵清白蛋白多肽的工业化生产奠定了基础。

参考文献

[1] 陈栋梁.多肽营养学[M].武汉:湖北科学技术出版社,2005

[2] 陈栋梁,王阿敬.白蛋白多肽对核苷的促吸收及增强小鼠细胞免疫功能的作用[J].食品科学,2004,25(1) :163-166

[3] Schanbacher F L. Biology and origin of bioactive Peptides in albumin[J]. Livestoke Production Science, 1997, 50(2) :105-123

[4] Dziuba J, Minkiewicz P. Chicken egg albumin as potential precursors of bioactive peptides[J].Polish J Food Sci, 1996,5:85-96

[5] 陶红,梁歧,赵谋明,等.双酶法水解对大豆寡肽苦味的影响[J].华南理工大学学报,2006,34(8) :121-124

蛋白类多肽 第4篇

关键词：铬鞣污泥,胶原蛋白多肽,纸张增强剂

我国已逐渐成为制革大国,在我国传统的制革工业中,1t盐湿皮仅能生产120kg成品革,却产生110kg左右的铬鞣污泥。铬鞣污泥是进行含铬废水处理过程中产生的固体废弃物[1,2,3]。其中含有大量的有用资源铬和胶原蛋白多肽类有机物。胶原蛋白多肽类有机物是宝贵的生物质资源和丰富的多肽类营养源,在医药、食品、化妆品、化工等领域有广泛的用途[4]。

目前铬鞣污泥的回收利用主要体现在回收铬资源上,对于其中所含的胶原蛋白多肽类物质并没有引起足够的重视。现在大多数胶原蛋白多肽的提取主要集中在废皮屑、皮革边角料、下脚料等其它皮革类固体废弃物上,但只要综合运用物理、化学、生物技术,铬鞣污泥中的胶原蛋白多肽一样能变废为宝[5]。

胶原蛋白多肽具有很强的生物相容性,开发以胶原蛋白多肽作为基质的新型高分子材料倍受关注。综合利用化学、生物的方法对多肽类物质改性,可应用于蛋白膜、包装纸、保鲜膜等可降解的生物功能材料。虽然胶原蛋白多肽能够与纸张纤维素产生氢键,但由于多肽之间的相互作用,使纸张易发生卷曲,对纸张强度的增大存在干扰,所以有必要在多肽链上接入其他活性基团,提高与纤维素的共价键强度。故该试验在对胶原蛋白多肽提取并提纯的基础上,以阳离子型聚丙烯酰胺对胶原蛋白多肽进行有效改性,使其具有增强纸张强度的实际应用效果[6,7]。

1 试验部分

1.1 主要试验材料和仪器

铬鞣污泥,山东省滨州市华升化工科技有限公司;

硫酸,化学纯,天津市光复科技发展有限公司;

氢氧化钠,化学纯,天津市福晨化学试剂厂;

氧化钙,化学纯,天津市致远化学试剂有限公司;

甲苯,化学纯,天津市红岩化学试剂厂;

过氧化环己酮、阳离子型聚丙烯酰胺,化学纯,西安福晨化学试剂有限公司;

聚乙烯醇,工业纯,西安化学试剂厂;

纸浆,苏州产杨木硫酸盐浆。

立式真空干燥箱,上海永冠电子科技有限公司;

超声波清洗机,深圳市科美达超声波设备有限公司;

VETER70型傅里叶红外光谱仪,德国PE公司;

pHs-3C精密pH计,上海精科仪器厂;

电泳分析仪,西安进度实业有限公司;

HPR60分子束取样质谱仪,英格海德分析技术有限公司;

DLS-Z型纸张抗张强度试验机,济南恒准试验设备有限公司;

HTS-NPYS100B型耐破强度测定仪,东莞市中野精科仪器有限公司。

1.2 胶原蛋白多肽提取的试验流程(见图1)

铬鞣污泥于真空干燥箱中干燥后放入粉碎机中粉碎,污泥粉末以能通过100目筛为基准。称取20.00g污泥粉末加入0.01mol.L-1H2SO4(固液比1:7),80℃恒温条件下搅拌2h后放入超声波清洗机中,超声作用(28kHz) 1h。铬鞣污泥中的铬在pH<2.5的条件下会以阳铬配合物的形式析出到酸性溶液中,但是析出过程是比较缓慢的,当溶液中的H+浓度达到3mol·L-1时,析出过程才会明显加快,所以需要利用超声空化作用来协助析出过程加速进行。析出过程结束后,放入离心机中将铬液与污泥分离。再将污泥加入固液比1:4的0.05 mol·L-1 NaOH(6%CaO),50℃恒温条件下搅拌1h后超声协助(28kHz) 2h。冷却至室温后,将胶原蛋白多肽原液与污泥残渣进行离心分离。由于分离后的胶原蛋白多肽原液中含有大量的无机盐成分(如钠盐、钾盐、微量铬盐等),所以在萃取胶原蛋白多肽前,需对原液进行提纯。在原液中加入5%的NH4CI(以质量分数计),金属阳离子与NH4+形成弱配位键,溶液通过207大孔型阳离子交换树脂时,原液中的金属配合物被吸附在树脂上,完成对胶原蛋白多肽原液的纯化(吸附在离子交换树脂上的金属配合物可通过2mol·L-1HCl淋洗回收)。最后用甲苯萃取出纯化溶液中的胶原蛋白多肽。

1.3 阳离子型聚丙烯酰胺对胶原蛋白多肽进行改性

三口圆底烧瓶中加入150mL去离子水,恒温60℃下加入干燥过后的胶原蛋白多肽粉末10.0g,用配比1:1的甲酸(10%)和稀硫酸(0.01mol·L-1)调节溶液pH≈4.5,缓慢加入聚乙烯醇搅拌1h。待溶液不再浑浊后,向胶原蛋白多肽液中加入3.00g阳离子型聚丙烯酰胺,加入引发剂(过氧化环己酮)恒温70℃下搅拌2h后冷却至室温。分离沉淀和杂质后干燥至胶状后取出,加入250mL去离子水稀释搅拌0.5h,加入少量丙酮溶解杂质,分离后干燥至40.00mL形成改性胶原蛋白多肽液。

1.4 主要分析及检测方法

1.4.1 铬鞣污泥与胶原蛋白多肽的分析与检测

(1)胶原蛋白多肽液的Cr2O3含量采用碘量法测定,胶原蛋白多肽在高温下分解为CO2和H2O,所以胶原蛋白多肽液的灰分含量采用高温灼烧减量法测定。

(2)胶原蛋白多肽提取率的计算:试验中的氮含量全部来源于胶原蛋白多肽,故可分别测定铬鞣污泥粉末中的氮含量和萃取出的胶原蛋白多肽液的氮含量,进行对比后确定提取率。

氮含量的测定参照GB5009.5-85 (凯式定氮法)。

(3)胶原蛋白多肽结构使用VET-ER70型傅里叶红外光谱仪进行检测;分子质量的分布使用HPR60分子束取样,质谱仪进行检测。

(4)铬鞣污泥中的铬含量采用浓H2SO4-H2O2法[8]进行测定;盐的固含量=灰分含量+铬鞣污泥中的铬含量,灰分含量采用GB/T11409(高温灼烧减量法)进行测定。

1.4.2 纸张的抄造及性能测试

苏州产杨木浆中加入一定量去离子水,打浆1～2h,在纤维标准解离器中疏解成0.3%～0.4%的浆液,以绝干浆质量分数为1.5%的比例加入改性胶原蛋白多肽液,搅拌10min后定量抄纸,熟化平衡水分24h(烘缸温度105℃,纸张定量60g/m2)。

参照国标GB5032-85,利用纸张强度测定仪,测定纸张抗张指数;参照国标GB454-2002,利用耐破强度测试仪测定耐破指数。

2 结果与讨论

2.1 提取胶原蛋白多肽的影响因素

2.1.1 NaOH的浓度和CaO在NaOH中的含量对提取胶原蛋白多肽的影响

考察不同的NaOH浓度对胶原蛋白多肽提取率的影响,如图2所示,以胶原蛋白多肽的提取率对NaOH浓度作图。当NaOH的浓度为0.05mol.L-1时,胶原蛋白多肽的提取率达到最大,继续增大NaOH浓度,提取率下降。这是因为胶原蛋白多肽易溶于碱性溶液环境中,但是当溶液中的OH-浓度过大时会对多肽中的肽键产生破坏作用,根据胶原蛋白多肽随着NaOH浓度变化的一系列红外光谱图可知,1550cm-1处的强吸收峰(表示一CONH中—NH的变形吸收峰)在NaOH浓度为0.04mol·L-1时的峰强度最大,NaOH浓度为0.10mol·L-1时的峰强度为NaOH浓度为0.04mol·L-1时的78%,继续增大NaOH浓度,峰强度进一步减小,当NaOH浓度为0.60mol·L-1时,1 550cm-1处的强吸收峰消失。所以胶原蛋白多肽的提取率先随着NaOH浓度的增大而增大,当大于某一临界点时,提取率随着NaOH浓度的增大而减小。

CaO在NaOH溶液中的作用有2个:一是防止局部OH-浓度过大对胶原蛋白多肽产生破坏;二是起到促进胶原蛋白多肽平稳快速地被提取出来。如图3所示,考察了CaO在NaOH溶液中的不同含量对提取率的影响,以胶原蛋白多肽的提取率对CaO在NaOH溶液中的含量作图。当CaO在NaOH溶液中的含量为6%时,胶原蛋白多肽的提取率达到最大。

2.1.2 萃取剂对提取胶原蛋白多肽的影响

胶原蛋白多肽在有机溶剂中的溶解度大于碱性水溶液中的溶解度,根据胶原蛋白多肽的这一理化特性,以胶原蛋白多肽的提取率为评价指标,采用电泳法先后分析比较氯仿、丙酮、甲苯3种有机溶剂液相萃取胶原蛋白多肽时的提取效果。如图4所示,甲苯萃取胶原蛋白多肽的电泳图谱(图4a)在3～5min处有杂质峰,但未对萃取分离造成干扰;丙酮萃取时的提取率较低(图4b);氯仿作萃取剂时的电泳图谱杂质较多(图4c)。故试验选用甲苯作为萃取剂萃取出胶原蛋白多肽。

2.2 胶原蛋白多肽的检测与分析

图5为提取出的胶原蛋白多肽的红外光谱图,曲线在1 380cm-1处的吸收峰属于C—O伸缩振动,1 201～1 103cm-1范围内吸收峰为碳骨架的伸缩振动。1 550cm-1处的强吸收峰,可能是一CONH中—NH的变形吸收峰。而在1 610cm-1处的强吸收峰,则归属于C=O伸缩振动。在687-1 103cm-1,3 000～3 600cm-1处较弱的吸收峰,分别代表C—O和一OH的振动以及NH2和一OH的振动,这2部分的振动说明羰基和羧基的含量较多[9]。

图6为提取出的胶原蛋白多肽的质谱图,从图6中可以看出:胶原蛋白多肽的分子质量分布在300～1 600Da之间。而三肽的分子质量约为900Da,图中927Da处的检测强度最大,说明三肽在胶原蛋白多肽中含量最多。氨基酸的分子质量普遍小于400 Da,质谱图中没有标识出小于400Da的强度值,说明氨基酸在溶液中的含量相对较小。最大分子质量的强度值标识在1 393Da处,推测为六肽结构的分子质量。在317～1 560Da之间,还有其他强度值标识,说明还有n≤6的其他多肽成分存在。

结合上述2图以及此铬鞣污泥中的胶原蛋白多肽主要是由鞣制牛皮处理过程后所产生,而牛皮的胶原结构主要是由羟脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸这3种氨基酸所构成,故可推测出试验提取出的胶原蛋白多肽液是一种以三肽(如图7所示)为主要成分、3种游离氨基酸、以及其他肽键数n≤6的多肽所组成的混合多肽液。

2.3 胶原蛋白多肽提取前后铬鞣污泥的理化指标

从表1中可以看出:经过提取胶原蛋白多肽的试验,铬鞣污泥中盐的固含量由34.6%降至6.1%,胶原蛋白多肽的含量由11.2%降至3.7%(在提取过程中胶原蛋白多肽含量会有损失),Cr2O3的含量由23%降至1.8%。提取出胶原蛋白多肽的同时,大大降低了污泥中Cr2O3的含量。若与适宜的提取铬工艺相联用,则可以达到铬资源与胶原蛋白多肽两者的充分利用,提高经济效益的同时有效降低对环境的污染。

2.4 阳离子型聚丙烯酰胺对胶原蛋白多肽液改性的反应机理

对胶原蛋白多肽液中的主要成分(三肽)与聚丙烯酰胺的接枝反应机理进行探讨。三肽是通过3个肽键连接的小分子多肽,具有一定的流动性,分子结构具有一定的扭转性。聚丙烯酰胺在过氧化环己酮的引发下形成活性中间体(如图8所示),此活性中间体与三肽中端肽上的羟基进一步反应生成终产物前驱体。终产物前驱体在弱酸性条件下脱去活化过氧化环己酮基团,生成聚丙烯酰胺接枝的改性胶原蛋白多肽液。

2.5 合成改性胶原蛋白多肽液的影响因素及其对纸张强度性能的影响

2.5.1 反应温度的影响

考察了不同反应温度下阳离子型聚丙烯酰胺对胶原蛋白多肽改性后对纸张强度的影响,如图9所示,以耐破指数和抗张指数对反应温度作图。从图9可以看出:反应温度为70℃时,抗张指数提高24.2%,耐破指数提高44.7%。当温度高于70℃时,改性胶原蛋白多肽液的反应活性受到影响,因而对纸张强度性能的增强呈下降趋势。

2.5.2聚乙烯醇用量的影响

聚乙烯醇作为分散剂,在弱酸性条件下增强了改性胶原蛋白多肽共聚物溶液在纸张纤维中的分散性,从而种具备应用前景的纸张增强剂

能更加明显地提高纸张强度。试验考察了聚乙烯醇在不同加入量的条件下对纸张强度的影响,如图10所示,以耐破指数和抗张指数对聚乙烯醇的用量作图。从图10中可以看出,当聚乙烯醇的用量为3mL时,纸张强度的性能指标达到最大值,故试验选取3mL为聚乙烯醇的最佳用量。

3 结论

(1)提取胶原蛋白多肽时的最佳NaOH浓度为0.05mol.L-1,CaO在NaOH溶液中的含量为6%,萃取剂采用甲苯。提取出的胶原蛋白多肽液是一种以三肽为主要成分、3种游离氨基酸、以及其他肽键数n≤6的多肽所组成的混合多肽液。

(2)利用阳离子型聚丙烯酰胺对胶原蛋白多肽进行有效改性,可以显著增大纸张强度,其最佳反应条件为:反应温度为70℃,聚乙烯醇加入量为3mL。经过改性后的胶原蛋白多肽液用于纸张抄造后,纸张抗张指数提高26.7%,耐破指数提高47.2%。研究结果表明,改性后的胶原蛋白多肽液能够大幅度提高纸张强度的性能指标,是一

参考文献

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蛋白类多肽 第5篇

亚油酸体系和Fe2+螯合体系都是常用的体外抗氧化方法。可以很好的筛选抗氧化物质。为了更准确的研究肽类物质体外抗氧化的方法,测定其抗氧化能力,本文以白蛋白多肽为例,对肽类物质体外抑制亚油酸过氧化、螯合Fe2+的方法进行了探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白蛋白多肽(武汉天天好生物制品有限公司),菲咯嗪(Ferrozine)(Sigma公司),氯化亚铁(FeCl2)(分析纯),硫氰酸铵(分析纯),无水乙醇(分析纯),盐酸(优级纯),磷酸二氢钠(分析纯),磷酸氢二钠(分析纯),亚油酸(色谱纯)(Fluka公司),BHT(Sigma公司)

1.2 实验仪器

PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂),722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),PW2003台式培养箱(重庆思达仪器厂),AR2140电子天平(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 螯合Fe2+能力的测定

在Decker和Welch (1990)[6]的测定方法的基础上,研究了反应时间及白蛋白多肽浓度对螯合Fe2+能力的影响。样品管的吸光度为A,对照管的吸光度为A0。

螯合率(%)=[(A0-A)/A0]×100

1.3.2 抑制亚油酸过氧化测定

采用FTC[7]法对亚油酸过氧化进行测定,探究了缓冲体系及白蛋白多肽浓度对亚油酸自氧化体系的影响。

1.4 统计学方法

数据统计采用SPSS12.0统计软件完成。

2 结果与分析

2.1 白蛋白多肽螯合Fe2+能力的测定

2.1.1 白蛋白多肽螯合Fe2+反应动力学

依照方法1.3.1,测定对照组及含有20mg/mL白蛋白多肽组其吸光度随时间变化的趋势,结果如图1所示。在10～60min内对照组及20mg/mL组的吸光值均无明显变化,表明反应体系自身并不会因为时间的推移而产生变化,即试剂在60min内处于稳定状态,且反应时间的延长并不会对实验造成影响,即整个反应体系是稳定的。

2.1.2 不同浓度白蛋白多肽螯合Fe2能力的测定

注:以上数据均与空白组对照进行统计分析,*代表p<0.05,差异显著:**代表p<0.01,差异极显著。

分别配制浓度为1、5、10、15、20、25mg/mL白蛋白多肽溶液,依照方法1.3.1进行测定。以蒸馏水作为空白对照,每组设有6个平行样。由图2可知白蛋白多肽浓度范围在1 mg/mL～25mg/mL时均具有螯合Fe2+的能力,当浓度范围在5mg/mL～25 mg/mL时螯合能力与空白组比较差异极显著。且当浓度为5mg/mL～20mg/mL时螯合能力与剂量成正比。以EDTA作为阳性对照,配制浓度范围在2μg/mL～200μg/mL EDTA溶液其螯合能力如图3所示。图2、图3对比可知浓度为10mg/mL白蛋白多肽螯合Fe2+的能力与浓度为10μg/mLEDTA溶液的螯合能力相近。

2.2 白蛋白多肽抑制亚油酸过氧化能力测定

2.2.1 缓冲体系对亚油酸自氧化体系的影响

依照方法1.3.2,测定不同pH值的缓冲体系对亚油酸体系自氧化的影响。

由图4可知,不同的缓冲体系对亚油酸自氧化的影响不一样,24h时缓冲体系对亚油酸自氧化的影响差异不明显,随着时间推移至168h,缓冲体系为0.1M,pH7.0亚油酸自氧化程度最低。故选择0.1M,pH7.0为检测白蛋白多肽抑制亚油酸自氧化能力的缓冲体系。

2.2.2不同浓度白蛋白多肽抑制亚油酸自氧化能力检测

依照方法1.3.2,以0.1M,pH7.0磷酸缓冲液为缓冲体系,分别配置浓度为0.11、10、20、30mg/mL白蛋白多肽溶液,以4×10-4M BHT为阳性对照。每组设有6个平行样。如图5所示,白蛋白多肽浓度为20mg/mL、30mg/mL时与空白对照组的抑制能力比较具有显著性差异,阳性对照与空白对照相比较也具有显著性的差异。白蛋白多肽抑制亚油酸自氧化的能力与浓度呈正比,即浓度越高其抑制亚油酸自氧化的能力越强。将吸光值到达0.3的反应时间定义为诱导期,将检测样品的诱导期与空白对照诱导期的比值定义为相对抗氧化活性[8]。白蛋白多肽与BHT相对抗氧化活性的强弱顺序为:4×10-4M BHT>30mg/mL白蛋白多肽>20mg/mL白蛋白多肽>10mg/mL白蛋白多肽>1mg/mL白蛋白多肽>0.1mg/mL白蛋白多肽>空白对照。白蛋白多肽溶液在浓度范围为0.1ng/mL～30mg/mL时,30mg/mL白蛋白多肽溶液具有最强的抗氧化活性。

注:以上数据均与空白组对照进行统计分析,*代表p<0.05,差异显著;**代表p<0.01,差异极显著。

3讨论

脂质过氧化物和过渡金属的相互作用可产生大量的自由基促进脂质氧化,同时过渡金属如铁和铜存在时,可通过HaberWeiss或Fenton反应产生高活性的羟自由基,所以一些具有螯合金属离子能力的物质可作为间接的抗氧化剂。Ferrozine能够与Fe2+形成紫红的络合物,白蛋白多肽能与Ferrozine竞争Fe2+导致紫红色变浅。这可能与白蛋白多肽中含有组氨酸有关。

很多研究中显示的抗氧化剂就是破坏自由基介导的脂质过氧化的链式反应。脂质过氧化是一个复杂的过程,涉及氧存在条件下的主要产物脂质自由基和脂质过氧化物的产生和传播。抑制过氧化能力是借助亚油酸反应体系来测定其抗氧化活力,其反应机制是延缓氧化链中主要氧化产物的形成。本研究发现,pH和缓冲液浓度对亚油酸自氧化有影响。pH越低其自氧化速度越快。磷酸盐本身具有螯合金属离子的能力[9],从而抑制亚油酸的自氧化,同时高浓度的缓冲液能够降低氧化率,从而延长自氧化的诱导期[10]。白蛋白多肽抑制亚油酸过氧化的能力随着浓度的增加而增加。当浓度为30mg/mL时其抑制率与阳性对照4×10-4M BHT相当。说明白蛋白多肽具有抑制亚油酸脂质过氧化的能力。其原因为白蛋白多肽含有丰富的疏水性氨基酸(33.23%),此类氨基酸对亚油酸具有很高的亲和性。脂溶性自由基产生于氧化剂直接攻击亚油酸,因此推测,疏水性的肽段能够通过给予羟自由基电子以保护亚油酸。

本文研究结果显示,Fe2+螯合体系体在60min内处于稳定状态,且在白蛋白多肽浓度小于20mg/mL时其量效关系成正比;缓冲体系pH对亚油酸体系氧化有影响,浓度为30mg/mmL白蛋白多肽对亚油酸的抑制作用与4×10-4M BHT相近。

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蛋白类多肽 第6篇

1 杆菌肽

杆菌肽又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素, 主要由地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生。杆菌肽具有抑制病原微生物增殖, 调节肠道菌群, 使动物肠壁变薄、增强通透性, 促进养分消化吸收等作用, 还具有内服不易吸收, 不易出现药物残留的特点, 早在1960年即被美国批准作为饲料添加剂使用, 是国内外应用最广泛的药物添加剂之一。由于杆菌肽各组分易吸潮和分解, 在生产中通常加入锌或亚甲基水杨酸络合, 形成性质稳定、应用效果好、可长时间保存的杆菌肽络合物产品, 即杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽。

1.1 杆菌肽锌

杆菌肽锌属于《饲料药物添加剂使用规范》中允许使用的药物饲料添加剂, 药品名为杆菌肽锌预混剂, 用于猪、牛、禽的促生长, 含量规格为每1 000 g中含杆菌肽100 g或150 g, 用法为混饲, 休药期为0 d。目前, 已有大量的研究报道证明杆菌肽锌具有较好的促进畜禽生长的作用, 且不易出现药物残留。如曹福池等 (1993) 、周国泉 (1994) 、陆伟等 (1995) 、吴建敏 (1998) 的研究表明, 在断奶仔猪和生长猪日粮中添加杆菌肽锌可提高日增重和饲料转化率, 预防腹泻、促进猪的生长;黄启贤等 (1993) 、骆先虎等 (1996) 、侯水生等 (1998) 的研究表明, 在肉鸡日粮中添加杆菌肽锌可提高肉鸡成活率、日增重和饲料利用率。杆菌肽锌进入肠道后, 分解为杆菌肽和锌离子, 锌离子作为营养素被吸收利用, 杆菌肽则留在肠道内发挥作用, 不被胃肠道吸收, 大部分随粪便排出体外, 少量由尿液排出, 不易出现残留, 适量添加不会对肾功能造成影响。美国食品与药品管理局 (FDA) 规定其休药期为0 d。

1.2 亚甲基水杨酸杆菌肽

亚甲基水杨酸杆菌肽于2012年获得新兽药证书, 2013年5月获得药物添加剂批准文号, 允许作为药物饲料添加剂使用, 这是自2001年《饲料药物添加剂使用规范》颁布实施后我国批准的第二个药物饲料添加剂。批文中通用名为亚甲基水杨酸杆菌肽预混剂, 商品名为必恩迪, 用于促肉鸡生长, 含量规格为每1 g中含亚甲基水杨酸杆菌肽100 mg, 用法为混饲。亚甲基水杨酸杆菌肽在国外作为饲料添加剂使用已有近60年的历史, 有大量研究证明其对动物生长具有促进作用, 单独或与其他药物配合使用能控制动物疾病, 且对生产者和使用者安全。沈建忠等 (1998) 研究表明, 亚甲基水杨酸杆菌肽能有效治疗由魏氏梭菌引起的鸡坏死性肠炎, 明显降低魏氏梭菌感染鸡群的死亡率;张华 (2009) 研究表明, 在生长猪日粮中添加亚甲基水杨酸杆菌肽能提高生长猪的平均日增重、平均日采食量、饲料报酬和增重率, 降低腹泻率, 提高成活率, 且增强机体抗氧化的能力优于杆菌肽锌;在药物残留方面, FDA (1999) 资料显示, 用亚甲基水杨酸杆菌肽饲喂肉鸡8周、产蛋鸡5个月, 在鸡的组织、蛋清、蛋黄中均未检出杆菌肽残留, 故FDA规定其休药期为0d。

2 维吉尼亚霉素

维吉尼亚霉素又名纯霉素、维及霉素、威里霉素、抗金葡霉素, 是从维吉尼亚链霉菌的发酵产物中分离而得。维吉尼亚霉素可选择性地抑制革兰氏阳性菌的活动, 因其可促进动物生长、提高饲料转化率, 美国、日本和欧洲都曾批准维吉尼亚霉素作为饲料添加剂。维吉尼亚霉素主要有以下作用:抑制革兰氏阳性菌活动, 减少葡萄糖的分解浪费, 减少有害代谢物的产生;使肠壁变薄, 增加肠壁通透性, 促进氨基酸、钙、磷、色素等营养物质吸收;减少肠管蠕动, 延长饲料在肠道内的停留时间。

维吉尼亚霉素在《规范》中的药品名为维吉尼亚霉素预混剂, 商品名为速大肥, 用于猪、鸡的促生长, 含量规格为每1 000 g中含维吉尼亚霉素500 g, 用法为混饲, 休药期为1 d。目前, 已有大量的研究报道证明维吉尼亚霉素具有较好的促进畜禽生长的作用。如冯光德等 (1998) 、范国刚等 (1998) 、韩金良等 (1999) 、姜礼胜等 (1999) 、吴东等 (2000) 研究报道, 在断奶仔猪和生长猪日粮中添加维吉尼亚霉素可促进猪生长、提高饲料转化率、降低单位增重饲料成本;邹文锦等 (1991) 、梁琳等 (1990) 、孙万岭等 (1996) 研究表明, 在肉鸡日粮中添加维吉尼亚霉素可促进肉鸡生长、提高饲料转化率、预防疾病;在药物残留方面, 王振来等 (1998) 研究表明, 维吉尼亚霉素主要作用于肠道, 但几乎不被肠管吸收, 在肝脏、肾脏、血液、肌肉等组织中的残留量均在法定容许限度之内。

3 那西肽

那西肽又名诺西肽、诺肽菌素、诺肽霉素, 主要由活跃链霉菌、抗生素链霉菌和青灰色链霉菌产生, 也可用化学方法人工合成。那西肽具有抑制病原微生物增殖, 调节肠道菌群, 恢复肠道管壁吸收机能, 增加消化吸收面积, 提高饲料利用效率等作用;还具有在肠道中不易被吸收, 在畜禽体内残留较低的特点。那西肽在《规范》中的药品名为那西肽预混剂, 用于鸡的促生长, 含量规格为每1 000 g中含那西肽2.5 g, 用法为混饲, 休药期为3 d。自20世纪70年代以来, 国内外学者对那西肽用作畜禽促生长剂进行了广泛研究, 证明那西肽对动物生长有促进作用, 不易残留、不易产生耐药性, 对环境污染小。

4 硫酸粘杆菌素

粘杆菌素又名粘菌素、克利斯汀、多粘菌素E等, 1952年由日本科学家首次发现, 在临床上常用其硫酸盐———硫酸粘杆菌素。粘杆菌素对大部分革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用, 但对革兰氏阳性菌及真菌几乎无效, 可用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。硫酸粘杆菌素在《规范》中的药品名为硫酸粘杆菌素预混剂, 商品名为抗敌素, 适用于革兰氏阴性杆菌引起的牛、猪、鸡肠道感染, 并有一定的促生长作用, 含量规格为每1 000 g中含粘杆菌素20 g (或40 g, 或100 g) , 用法为混饲, 休药期为7 d, 蛋鸡产蛋期内禁用。

杆菌肽、维吉尼亚霉素、那西肽、硫酸粘杆菌素这四种多肽类抗生素, 均具有促进畜禽生长、在畜禽体内残留量较小、不易产生耐药性等优点, 在畜禽养殖和饲料生产中被广泛应用, 正确合理使用该类药物对促进畜禽生产、保障畜产品质量安全具有重要意义。

摘要：杆菌肽、维吉尼亚霉素等四种多肽类抗生素因具有促进畜禽生长、在畜禽体内残留量较小、不易产生耐药性等特点, 被批准为可以在饲料中长时间添加使用的饲料药物添加剂。本文就多肽类抗生素在畜禽生产中的应用研究在《饲料药物添加剂使用规范》中的用法用量作一综述, 为正确合理使用该类药物, 保障畜产品质量提供参考。

关键词：多肽类添加剂,促生长,畜禽,饲料

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蛋白类多肽 第7篇

血小板黏附于内皮下基质是血管损伤处血栓形成的关键环节, 其中整和素家族的糖蛋白GPⅡ/Ⅲa发挥了重要作用, 它是血小板表面含量最多的膜糖蛋白, 另有相当部分存在于血小板内。当血小板被激活时, 这些胞内受体能在血小板表面表达, 发生构象改变, 暴露其识别纤维蛋白原的位点, 与纤维蛋白原结合后的GⅡb/Ⅲa受体进一步改变构象;而纤维蛋白原的构象也发生改变, 使两者亲和力加强[3], 互相桥连成网, 形成牢固的血栓。此外, 它还能和纤维粘连蛋白、血管性假性血友病因子 (v WF) 、玻璃体结合蛋白等配体结合, 进一步介导血小板的黏附、聚集、释放这一系列活化过程, 引起、促进了血栓的形成、发展。另外, 活化血小板表面促进凝血过程和产生凝血酶, 在动脉粥样硬化斑块破裂的血栓反应中也起了重要作用[4]。GⅡb/Ⅲa是近来研究的热点, 因为它与纤维蛋白原的结合是引起血小板聚集的最后通路, 理论上讲其受体拮抗剂可阻断或减少血小板介导的血栓形成。

GⅡb/Ⅲa受体拮抗剂主要用于急性冠脉综合征患者, 也可用于介入性心脏病领域。目前基本有两种治疗方案:联合治疗 (合并低剂量溶栓药) 和冠脉介入治疗时静脉应用, 口服制剂经循证医学证实疗效欠佳, 已极少使用。主要分为:单克隆抗体类、RGD多肽类、非肽类。本文就非肽类拮抗剂 (Tirofiban) 的临床应用进展作一综述。

Tirofiban, 化学名N-丁磺酰基-4-O-【4- (-哌啶) 丁基】-L-酪氨酸盐酸盐, 分子式:

其是一种非多肽类GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂, 分子量为495 Da, 半衰期 (T2/1) 为1 h~2 h, 39%~69%由肾脏排泄。对其抗血小板机制的研究远较阿昔单抗少, 认为通过与静息血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受体结合起到抗血小板作用;在体外, 其可以减少凝血酶的生成, 有促进血小板-白细胞聚集体形成的作用。其拮抗受体的特点为: (1) 特异性强:能特异性地和GPⅡb/Ⅲa受体的相应位点结合, 从而阻断GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原、v WF等配体的结合, 进而起到抗血栓形成的作用。 (2) 拮抗能力强:以推荐的剂量静滴, 与受体的结合率大于80%, 30 min后的抑制率可达90%, 抑制ADP (5~20μmol/L) 引起的血小板聚集大于80%。 (3) 剂量依赖性。 (4) 可逆性较强, 可以防止后期的出血倾向。 (5) 非肽类:对细胞内蛋白质参与的生物化学过程不造成直接干扰。

Tirofiban的副作用主要有: (1) 血小板减少。发病率为1.1%~5.6%, 机制不明, 治疗后定期血小板计数可帮助早期诊断血小板减少症。停药、输注血小板为主要治疗方法, 一般5 d~7 d后可缓解。 (2) 出血。多因合并标准剂量肝素所致。合用小剂量肝素组 (70 IU/kg) , 最大单剂量为7 000 IU以维持活化凝血时间>200 s的出血并发症与对照组无明显差异。 (3) 紧急冠状动脉旁路手术。 (4) 免疫反应及药物再投入。

GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂临床应用的研究众多, 但多限于单克隆抗体、RGD多肽, 对于非肽类, 尤其对Tirofiban的研究较少, 主要如下:

1 在经皮冠状动脉介入治疗 (Percutaneous coronary intervention, PCI) 中的应用

RESTORE试验观察了Tirofiban对高危冠脉介入患者的预后和再狭窄的疗效。试验入选2 141例在发病72 h内接受PTCA或定向旋切的高危患者, 常规抗凝、抗血小板处理后随机分成2组:观察组 (1 071例) 予Tirofiban 10μg/kg在3 min内静脉推注, 继之以0.15μg/ (kg·min) 连续静滴36 h, 安慰剂组 (1 070例) 用法同观察组。研究结果显示: (1) 观察组48 h后临床复合终点 (死亡、心肌梗死和血管重建术) 下降38%, 7 d下降27%, 但至30 d仅下降16% (无显著意义) [5], 若以紧急血运重建为事件终点, 则Tirofiban可降低事件发生率24% (P=0.052) 。 (2) 复合终点中需再次PCI或紧急CABG者:30 d内安慰剂组为10.5%, 观察组为8%, 相对下降24% (P=0.52) 。 (3) 30 d发生MI的比例:安慰剂组为5.7%, 观察组为4.2%, 下降26% (P=0.113) 。

Tirofiban的疗效尤其近期疗效得到了RESTORE试验的证实, 但与其他受体拮抗剂相比其有效性如何一直为世人瞩目, 晚近提交的一个试验结果回答了这一问题。

2004年完成的“直接冠状动脉介入术 (PCI) 术中应用阿昔单抗和Tirofiban对左室功能恢复的对比研究”[6]比较了Tirofiban和Abciximab在直接PCI术中的作用。评判以30 d后心超室壁运动积分变化为主要指标, 结合PCI前后心肌梗死溶栓治疗 (TIMI) 血流分级变化、TIMI心肌灌注分级变化、TIMI帧计数分级变化。结果:30 d时2组EF值和室壁运动积分改善程度相似。造影显示:PCI术后Tirofiban组有76%、Abciximab组有70%的患者在TIMI心肌灌注分级达到了3级。可见在直接PCI术患者中, 阿昔单抗和Tirofiban在即刻造影效果和30 d时左室功能恢复上作用相似。

限制GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂临床运用的主要副作用是出血。既往的临床研究发现:PCI予常规剂量普通肝素抗凝时, 阿昔单抗增加出血事件发生率。2001年美国心脏病学会/美国心脏协会 (ACC/AHA) “有关PCI指南中肝素运用的建议”把合用阿昔单抗时肝素的剂量调低为50~70 IU/kg[7], 而与其他受体拮抗剂合用时的合适剂量尚不清楚, 因此Tirofiban的安全性备受关注。

新近的一个报告探讨了高负荷量Tirofiban在支架置入术中的安全性问题[8]。该研究回顾性分析了2组分别使用Tirofiban (274例) 和阿昔单抗 (280例) 后的差异, 结果证实Tirofiban是安全的, 增加剂量, 出血发生率并未增加 (Tirofiban vs Abciximab为0%vs 1.4%, P=0.12) ;30 d后主要不良事件发生率 (main adverse cardiac event, MACE) 亦无统计学差异 (5.8%vs 7.1%, P=0.65) 。

另一个Tirofiban的安全性研究是The ADVANCE Trial[9]。试验将202例经标准剂量阿司匹林和氯吡格雷预处理的高危患者随机分为高剂量负荷Tirofiban组 (25μg/kg弹丸式注射, 继之以0.15μg/ (kg·min) 持续静滴24 h~48 h) 和安慰剂组, 随后行PCI术, 观察6个月内MACE的发生率。结果再次支持Tirofiban的安全性, 且能显著降低高危患者PCI时缺血/血栓并发症的发生率。

2 在急性冠脉综合征 (ACS) 中的应用

阿司匹林和肝素在ACS药物治疗中的作用举世公认, 尤其阿司匹林更是ACS的基础用药。GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂是否较之更为有效是研究者最为关心的课题。

早期的PRISM试验比较了Tirofiban和普通肝素的差异, 结果Tirofiban组48小时的复合终点事件较肝素组降低了37%, 30 d时无显著区别, 但病死率降低了39%[10]。

PRISM-PLUS试验研究了在Asprin基础上静滴Tirofiban的疗效, 结果显示: (1) 静脉应用Tirofiban可明显降低死亡或心肌梗死联合终点达66% (P<0.05) , 且此有益作用维持至6个月[11]。 (2) 7 d和30 d心脏事件分别下降43%和27% (P<0.05) 。 (3) 对糖尿病患者的近、远期预后均有明显改善。 (4) 出血事件无明显增加。

2005年欧洲心脏病学会年会报告的ELISAⅡ[12]研究结果显示, 对于非ST段抬高型ACS患者, 在氯吡格雷和阿司匹林治疗的基础上加用GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂, 虽可改善初次血管造影时病变血管的再灌注 (67%vs 47%、P=0.001) , 无事件生存率也有改善的趋势, 但不能进一步减少梗死心肌的面积。

中、低危组非ST段抬高的ACS患者因联合用药后出血危险显著增加, 由此, 通常认为高危组患者运用Tirofiban时获益最大。然而《美国心脏杂志》近期发表的一篇文章却提出了不同的观点, 2组 (接受和未接受Tirofiban治疗) 患者无论是临床结果、血管造影结果、入院后心肌肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 的变化还是大出血发生率、30 d复合终点 (死亡、心肌梗死或因ACS再入院) 发生率都没有差异。由此认为:对于进行早期PCI的非ST段抬高型ACS患者, 给予Tirofiban治疗并不比应用阿司匹林、肝素、氯吡格雷预处理获得更多的益处。

Tirofiban的使用时机尚无定论, TACTICS-TIMI 18 Trials[13]揭示:早期介入治疗并应用GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂可明显改善UA/NSTEMI的预后。

3 存在的问题及展望