根尖乳头干细胞

根尖乳头干细胞（精选4篇）

根尖乳头干细胞 第1篇

目前关于苏丹红Ⅰ遗传毒性的研究主要集中在动物身上,其对植物的遗传毒害还未见报道,蚕豆根尖细胞微核检测能较准确地反映致突变因子对细胞产生遗传毒害的大小和细胞染色体的稳定性。试验利用苏丹红Ⅰ处理蚕豆根尖,研究了不同浓度的苏丹红对蚕豆根尖细胞的遗传毒性,现报道如下。

1 材料与方法

1. 1 种子与试剂

蚕豆干种子,购自信阳新华市场,为当年新生种子,挑选大小匀称的用于试验。

苏丹红Ⅰ,购自上海谱振生物科技有限公司; 二甲基亚砜( DMSO) ,购自上海抚生实业有限公司; 环磷酰胺,购自安徽省沃土化工有限公司; 卡诺固定液( 无水乙醇、冰醋酸之比为3︰1) ,改良品红染液,市购。

1. 2 试验设计

将5 g苏丹红Ⅰ用5 mL二甲基亚砜溶解,定容至500 mL ,制成10 g /L处理母液,再依次加纯化水稀释至浓度分别为5 g /L( 1) 、2 g /L( 2) 、1 g /L( 3) 、0. 5 g / L( 4) ; 配制体积分数为0. 5% 的DMSO为对照处理液; 将环磷酰胺配制成2 mg /L溶液,现配现用。将蚕豆干种子按照常规方法浸种和催芽,待根长至1 ~ 2 cm时剔除没发芽或主根过短的蚕豆,然后随机将蚕豆分成7组,每组12粒蚕豆。然后将根尖浸于4个浓度的苏丹红Ⅰ处理液、0. 5% DMSO、2 mg / L环磷酰胺( 阳性对照,CP) 中24 h,并以纯化水培养为阴性对照( CK) 。恢复培养24 h后剪取根尖,在卡诺固定液中固定24 h,70% 酒精中4℃保存。用1 mol/LHCl在60℃水浴中解离6 ~ 7 min,纯化水清洗,用镊子夹取根尖细胞组织置于载玻片上,加入1滴改良品红染液染色10 min,盖上盖玻片,进行镜检。每个处理随机观察2 ~ 4个根尖,每个根尖观察1 000个细胞。

1. 3 数据的统计分析

计算蚕豆根尖细胞微核率 ( MNR) 、有丝分裂指数( MI) 和染色体畸变率( CAR) 。观察各种染色体畸变类型,如染色体断片、落后染色体、染色体环、染色体桥和微核,统计染色体畸变率。

MNR( ‰)= 微核细胞 数 / 观察细胞 总数×1000‰。MI( % ) = 分裂期细胞数 / 观察细胞总数×100% 。CAR( % ) = 染色体畸变细胞数 / 有丝分裂细胞数×100% 。

2 结果

2. 1 苏丹红Ⅰ对蚕豆根尖形态的影响

蚕豆在不同浓度的苏丹红Ⅰ处理液中培养时根尖受到了不同程度的损伤,外形出现如发黄、发黑、变短,甚至腐烂死亡等现象( 见表1) 。

由表1可见,苏丹红Ⅰ的浓度越高对根尖造成的损伤越重,在形态上呈萎缩变短、颜色变黄,甚至变黑等现象。

2. 2 苏丹红Ⅰ对蚕豆根尖细胞微核率和有丝分裂指数的影响( 见图 1)

对处理后的蚕豆根尖细胞进行了镜检观察。微核率随苏丹红Ⅰ处理液浓度的降低而降低,分别为( 26. 71±2. 86) ‰、( 21. 44±2. 12) ‰、( 12. 57±1. 23) ‰、( 6. 95±0. 45) ‰。与CK相比,处理1微核率升高最多,达22. 93‰; 处理4微核率升高最少,仅为3. 17‰。微核的畸变有单微核、双微核和三微核,其中单微核最多。同时,微核在细胞周期的不同时期都有出现,随着苏丹红Ⅰ处理液浓度的增加,双微核和三微核增加。由此可见,微核率与苏丹红Ⅰ处理液浓度之间呈正相关。

有丝分裂指数随苏丹红Ⅰ处理液浓度的降低而升高,分别为( 1. 23±0. 06) % 、( 2. 52±0. 11) % 、( 3. 21±0. 17) % 、( 3. 69±0. 25) % 。与CK相比,处理1有丝分裂指数降低最多,达4. 66% ; 处理4有丝分裂指数降低最少,为2. 20% 。由此可见,有丝分裂指数与苏丹红Ⅰ处理液浓度之间呈负相关。

综上所述,随着随苏丹红Ⅰ处理液浓度的降低,微核率降低,有丝分裂指数升高,可见苏丹红Ⅰ严重影响了有丝分裂的正常发生,诱发DNA分子断裂,游离在细胞中而形成微核; 而且高浓度的苏丹红Ⅰ处理液对微核的诱发率和有丝分裂指数的抑制率均高于CP。助溶剂DMSO虽然提高了微核率,降低了有丝分裂指数,但是与CK相比,差异未达极显著水平。2. 3苏丹红Ⅰ对蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响( 见表2)

%

对不同浓度苏丹红Ⅰ溶液处理后的蚕豆根尖细胞的有丝分裂进行观察,其间出现了丰富的染色体畸变类型。对各种类型的畸变率进行统计后,得到染色体畸变率。由表2可见, CK的染色体畸变率最低( 0. 28% ) ,处理1的染色体畸变率最高( 13. 52% ) 。CK和DMSO的畸变类型最少,仅微核和染色体断片2种; 处理1,2,3都出现了5种畸变类型,分别是微核、染色体断片、染色体桥、染色体环和落后染色体,而且均以微核畸变率最高,染色体环畸变率最低。由此可见,高浓度的苏丹红Ⅰ溶液处理后染色体畸变率升高,染色体畸变类型增多。

3 讨论

关于苏丹红Ⅰ的遗传毒性,前人已经做过相关的试验,观察其对细胞微核的诱导。B. M. Elliott等[3]通过口饲法分别给予大鼠和小鼠苏丹红Ⅰ,进行体内骨髓微核遗传毒性试验和大鼠肝非程序性DNA合成试验。结果表明,苏丹红Ⅰ对大鼠和小鼠骨髓都具有遗传毒性,但前者较明显,后者较弱。苏丹红Ⅰ还可导致F344大鼠多染性红细胞微核率的增加[4]。杜启艳等[5]报道,经苏丹红Ⅰ染毒的红细胞微核率远高于未染毒对照组,并且具有一定的剂量效应。本试验通过蚕豆根尖细胞微核检测,笔者认为苏丹红Ⅰ对植物有与对动物相似的遗传毒性,也能诱导微核的产生,造成染色体畸变; 而且遗传毒性的毒害程度和苏丹红Ⅰ处理液的浓度直接相关,随着浓度的增加根尖萎缩变短,颜色变深,有丝分裂减少,微核率增加,染色体畸变率增加,畸变类型增多。

从本试验结果可以看出,低浓度的苏丹红Ⅰ产生的遗传毒性小。在日常生活中,人们能吃到含有苏丹红Ⅰ的鸭蛋、辣椒酱和其他食品的概率很小,如果只是偶尔不小心吃了少量的此类食品也不必过度恐慌;但是如果经常大量食用此类受污染食品,定会对身体各组织造成损伤,增加患癌的风险。关于食品安全,除了相关的食品药品监督部门做好质量检测外,也要提高自我防范意识,去正规的厂家购买食品,不要被苏丹红那美丽的外表蒙蔽了双眼。

参考文献

[1]刘芳,秦秀蓉.苏丹红及其加入食品中的危害[J].时代教育:教育科学版,2008(3):226-227.

[2]安玉.苏丹红I号对Hep G2细胞的遗传毒性及氧化性DNA损伤[D].大连:大连医科大学,2007.

[3]ELLIOTT B M,GRIFFITHS K,MACKAY J M,et al.CI solvent yellow 14 shows activity in the bone marrow micronucleus assay in both the rat and mouse[J].Mutagenesis,1997,12(4):255-258.

[4]WAKATA A,MIYAMAE Y,SATO S,et al.Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood:summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS[J].Environ Mol Mutagen,1998,32(1):84-100.

根尖乳头干细胞 第2篇

1. 取材

取洋葱数个, 放在广口瓶上, 装满清水, 让洋葱的底部接触瓶内的水面。把广口瓶放在温暖的地方培养。培养温度较为重要, 通常认为在20多度时细胞分裂比较旺盛。待根长约2～3 mm时, 切取根尖约5mm用流水洗涤, 要想获得较多分裂期的细胞, 取材的时间十分重要。经过长期观察和实验, 我们发现洋葱根分裂旺盛的两个时间段, 一个是在上午10点至下午1点, 另一个是在夜间11点左右。须注意的问题是:应选择底盘大的洋葱做生根材料;培养时每天勤换水1～2次, 防止烂根。

2. 固定与洗涤

常用卡诺氏固定液 (无水乙醇:冰醋酸=3:1) 。由于这种固定液的穿透力较强, 通常固定不超过24小时。我们实验时固定时间为5小时, 效果较好。固定后用蒸馏水洗涤两次, 移至70%或80%酒精中保存。若由于时间关系, 实验无法继续进行, 可以放在此浓度的酒精中长期保存, 但原则上最好不超过一个月。

3. 脱水

酒精是常用的脱水剂, 也可使用正丁醇脱水与透明同时进行, 但后者的脱水能力较弱, 需要适当延长脱水时间。脱水要注意的两个问题是脱水不尽和过度硬化。脱水不彻底切片将难以透明, 过度硬化会导致切片困难。要把握好脱水剂的时间和浓度, 从低浓度到高浓度递增的顺序进行。酒精常用浓度为:70%、80%、90%、95%、100%, 在95%和100%酒精中通常不过夜。

4. 透明

使用正丁醇作为透明剂, 这样一方面可以避免使用二甲苯透明导致组织变硬变脆的危险, 另一方面也可防止实验者吸入大量二甲苯和其对环境的污染。使用酒精作为脱水剂, 透明时先将材料放入纯酒精和透明剂各半的混合液中, 然后转入纯透明剂中透明, 通常的做法是:100%酒精:正丁醇=1:1中30分钟, 纯正丁醇两次, 每次30分钟。

5. 浸蜡与包埋

此过程在恒温箱中进行, 温度设置为高于石蜡熔点2℃～3℃。总的浸蜡时间约3小时。先把材料放入熔化的石蜡和正丁醇的等量混合液中浸渍30分钟, 然后依次转入纯软蜡 (熔点:52℃～54℃) 1小时, 纯硬蜡 (58℃～60℃) 两次, 每次1小时。包埋蜡为最后一杯硬蜡。由于洋葱尖细而长, 在包埋框中难以立稳, 可采用以下办法。包埋时, 先向包埋框内倒入约1mm厚的熔蜡, 待熔蜡稍凝固后, 再向其内倒满熔蜡, 随即用加过温的镊子从温箱内的浸蜡杯中取出渗好蜡的材料, 迅速将材料直立地放入包埋熔蜡中。放置时注意切面方向。此步骤要求动作迅速, 否则蜡液凝固后不能渗进材料中, 难以切片。

6. 切片、贴片与烤片

在切片前将蜡块放在冰箱中冷藏一下, 取出后将蜡块用刀片修成规整的方形, 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上, 夹在切片机上, 使蜡块切面与切片机刀刃平行, 固定。调节切片厚度为4～7微米, 切出成片的蜡带, 用毛笔轻托轻放在纸上。用刀片断开蜡带成单个蜡片于温水45℃中充分展平后, 捞至洁净的玻片上, 注意将有材料的部分放正, 然后将载玻片放入65℃温箱中干燥。注意的问题:1) 切片厚度不能过厚, 否则蜡片易脱落;2) 附贴时将蜡片充分展平, 不能发皱, 避免气泡遗留在蜡片和载玻片之间;3) 附贴蜡片后立即放入烤箱内, 在室温不要放置过久;烤片温度65℃左右, 时间约20～30分钟。

7. 脱蜡与水化

用二甲苯脱蜡, 若室温过低, 需将二甲苯进行加热。脱蜡时间宁长勿短。脱蜡不彻底将直接影响染色的效果。如何判断脱蜡是否彻底, 目前没有定论, 一般认为切片从二甲苯中取出用无水酒精涮洗后, 若切片上有材料的部分呈云雾状, 说明脱蜡不彻底, 需把切片重新放回二甲苯中继续脱蜡。在把切片从二甲苯中取出转入其它液体时要快, 否则在空气中停留时间长了, 切片会发白。再逐级经梯度酒精直至蒸馏水水化。水化时间一般各为数分钟。

8. 染色

用苏木精染液染色。苏木精染液配方繁多, 通过比较, 采用Harris苏木精液、Mayer苏木精液、Gill半氧化苏木精液、碘化钠氧化苏木精液效果均较好, 而且从染液配制到染色的时间较快。染色后镜检观察染色的深浅, 如果颜色过深, 可以在后面的脱水透明中适当延长时间, 若是颜色浅, 可以放回染液中重新染色。

9. 脱水透明

脱水剂使用酒精, 按照由低到高的梯度进行。透明剂使用二甲苯, 可缩短透明时间。注意这一步在操作时时间不能太长, 以免脱色。时间一般均不超过20分钟。可以边操作边镜检效果。

1 0. 封片

透明后封片要求迅速, 否则切片会发白。封片剂可用中性树胶, 也可用调制好的甘油蛋白。在有材料的部位蘸一滴封片剂, 再盖上洁净的盖玻片。

以上是对洋葱根尖细胞有丝分裂石蜡制片过程的一些总结, 要制作高质量的切片必须把握好每一个操作步骤。在实践中还需要不断摸索, 目的是在保证质量的前提下, 节省制片时间, 接触最少的化学物品与试剂。

摘要：我们通过反复实验, 对洋葱根尖细胞有丝分裂石蜡切片制作过程, 进行了一些经验总结, 以供同仁参考。

关键词：洋葱,有丝分裂,石蜡,切片

参考文献

[1]郑兴峰.石蜡切片法中细长或薄片状材料的包埋[J].生物学杂志, 2003, 20 (4) .

根尖乳头干细胞 第3篇

一、根尖培养的注意事项

1.广口瓶内装满清水, 让洋葱的底部接触到瓶内的水面———保证充足的水分;

2.把整个装置放在温暖的地方———保证适宜的温度;

3.在培养过程中要注意经常换水———保证氧气和矿物质元素的供应。

二、装片制作过程的注意事项

1.选取实验材料, 应剪取生长旺盛、带有分生区的根尖, 同时注意一般在上午10时至下午2时左右 (此时洋葱根尖细胞有丝分裂旺盛) 剪取或在剪取根尖以前用35℃的温水浸泡1小时左右。

2.解离时间要严格控制。解离时间不能太短, 否则细胞果胶未溶解, 压片时细胞不易分散, 达不到效果;时间过长则细胞分离过度、过于酥软, 无法取出根尖进行染色和制片。

3.漂洗时间要充分, 否则影响染色体着色。

4.控制染色时间, 染色时间不能太短, 否则染色体或染色质不能完全着色, 时间过长则使细胞核等其他部分充满染色剂, 无法分辨染色体。

5.压片时用力必须恰当, 过重时会将组织压烂, 过轻则细胞未分散, 二者都影响观察效果。

6.对细胞有丝分裂的过程观察不可能看到连续的分裂过程, 因为在解离过程中细胞已经死亡, 我们观察到的只是一个固定的时期, 要不断地移动装片, 在不同的视野中找到各个时期的分裂图像, 所以在制作装片时要让细胞分散成一层细胞, 这样才能找到细胞和各个分裂时间。

根尖乳头干细胞 第4篇

微核是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变,在间期细胞中的一种变现形式。微核是常用的遗传毒理指标之一,指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会与细胞受到的外界因子的剂量呈正比,因此可用微核出现的频率来评价环境诱发因子[1]。

蚕豆根尖细胞微核试验(MCNT)技术是以染色体断裂及纺锤体损伤为测试终点的植物微核监测方法。它灵敏度高、操作技术简单,用于监测环境致突变的诱变活性对人体和其他生物体遗传物质产生危害的技术。本试验以蚕豆作试验材料,采用MCNT技术,来检测洗衣粉。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蚕豆(根尖细胞的染色体大,DNA含量高,对诱变因子反应敏感)、奇强洗衣粉。95%乙醇、盐酸、吉姆萨染液。显微镜、试管、蚕豆培养盆、纱布、烧杯、培养皿、载玻片、凹面载玻片、小刀、恒温水浴锅、镊子、血细胞计数板。

1.2 试验方法

1.2.1 浸种胚芽。

将试验用蚕豆按需要放入盛水烧杯中,在25℃下浸泡24 h。在此期间至少换2次水,所换水应25℃预温。种子吸胀后用毛巾松散包裹置洗脸盆中,保持温度,催芽12~24 h,待初生根长2~3 mm,再取发芽良好的种子,放入铺满滤纸的洗脸盆中,25℃继续催芽,经36~48 h,大部分初生根长至1~2 cm,根发育良好,此时可用来进行试验[2]。

1.2.2检测因子处理根尖。选取初生根生长良好、根长一致的种子,放入盛有被测液的培养皿中,被测液浸没根尖即可。

1.2.3根尖细胞恢复培养。处理后的种子用自来水浸洗3次,每次2~3 min。洗净后再置入有湿润滤纸的瓷盘中,25℃下再恢复培养24 h。

1.2.4 制片。

从根尖顶端切下1 cm长的幼根,用卡诺固定液固定24 h,用蒸馏水浸洗固定好的幼根,60℃水浴盐酸酸解15 min。取适量根尖用吉姆萨染液染色15 min,压片。

1.2.5 镜检。细胞核呈紫红色,背景基本为无色,然后在视野内统计微核数目。

2 结果与分析

根据《全国生物技术监测规范—蚕豆根尖微核技术》规定的污染指数划分标准,参考陈光荣等的试验方法,利用污染指数(PI)值来划分污染程度。洗衣粉对蚕豆根尖微核率百分比和污染指数的统计结果见表1。可以看出,3个试验组的微核率分别为4.62%、5.37%、5.06%,远远超过了对照组的1.94%的微核率。由此表明,各试验组的洗衣粉均具有一定的污染性,且污染程度随着微核率的上升而加重。污染指数(PI)为试验组的微核百分率与对照组的微核百分率的比值,PI≤1.5时,洗衣粉几乎没有污染;1.5<PI≤2.0时,洗衣粉为轻度污染;2.0<PI≤3.5时,洗衣粉为中度污染;PI>3.5时,洗衣粉为重度污染。由表1可知,试验组的PI值都在2.0~3.5的范围内。由此表明,洗衣粉的污染指数为中度污染,表明洗衣粉具有一定的毒性[3,4]。

3 结论与讨论

前人研究结果表明,不同长度的蚕豆根尖对于微核率有较大的影响,虽然在选材时选用了颗粒饱满、体积重量相近的蚕豆,但在同样时间的成长中却不可避免地造成根尖生长程度不可能绝对相同,因此对于微核率有相对的影响。

由不同的洗衣粉的微核率可得,不同洗衣粉的浓度对人们的伤害是不同的,因此应该减少洗衣粉的用量。洗衣粉是人们生活中洗衣服的必需品,它的作用就是帮助人们花更少的精力洗净衣服上的污渍。但洗衣服使用过多对人体是有损伤的,人们选择洗衣粉的时候应根据自身的实际情况选择低浓度的洗衣粉。

该试验结果表明,日常洗漱用品可能具有一定的毒性,作用于蚕豆根尖后引起染色体畸变,由此可推断对人体也有可能致癌、致畸、致突变,提醒人们选择安全的洗漱用品,减少使用含有害化学物质的日常用品。

参考文献

[1]蚕豆根尖微核试验的应用与发展[J].癌变·畸变·突变,1999,11(3):337.

[2]王玉鹏.微核试验方法及在环境监测中应用的发展趋势[J].环境与健康杂志1999,16(6):378-379.

[3]胡振东,蚕豆微核测定技术及其应用[J].淮北煤师院学报,2000,21(4):65-67.