诱导表达范文（精选10篇）
诱导表达 第1篇
1 材料与方法
1.1 材料
猪型布鲁氏菌(Brucella suis)S2型减毒活菌疫苗:包头市防疫站购买并由实验室低温保存,其他常规基因克隆和表达菌株由作者实验室低温保存。
1.2 方法
1.2.1 菌株活化
在无菌条件下,按照1:100的比例,将低温保存的S2减毒活菌疫苗转接于牛肉汤液体培养基中,37 ℃条件下170 r/min摇床中震荡培养72 h;之后,离心分离菌液获得菌体,用于基因组DNA的提取[2]。
1.2.2 引物设计与目的片段的PCR扩增
根据NCBI网络数据库提供的关于猪型布鲁氏菌的bls全基因序列,我们设计了一对用于bls基因表达片段扩增的引物(F:CCG GAA TTC ATG AAC CAA AGC TGT CCG AAC,R:CCG CTC GAG TCA GAC AAG CGC GGC GAT GC,酶切位点分别为EcoRⅠ和XhoⅠ),以事先提取的基因组DNA作为模板进行目的片段的扩增。
1.2.3 大肠杆菌pET-28a(+)质粒载体的获得
将含有pET-28a(+)空质粒的大肠杆菌接种在LB液体培养基中,过夜37 ℃条件下震荡培养;次日,离心分离菌体并用于质粒提取[3]。
1.2.4 重组表达载体的构建
将目的基因DNA片段和pET-28a(+)质粒分别经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后,在16℃条件下过夜连接;次日,采用“热激法”转化克隆菌株DH5α。经菌落PCR鉴定后,选择阳性克隆菌进行液体培养;次日,提取DNA质粒进行验证[4]。
1.2.5 诱导表达与电泳检测
利用“热激法”,将pET-28a-bls重组子转化TL129表达性宿主菌株。次日,菌落PCR鉴定后,挑取阳性克隆菌落进行液体培养。之后,筛选到的含有pET-28a-bls重组子的TL129表达性宿主菌株就可以进行IPTG诱导表达,具体表达结果利用SDS-PAGE电泳检测[5]。
2 结果与分析
2.1 目的基因PCR扩增结果
以布鲁氏菌基因组DNA作为模板,利用设计的目的基因表达片段扩增引物F和R进行PCR扩增,得到了目的基因bls的表达片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示:PCR扩增得到的目的片段长度与实际长度一致,为477 bp。
M:DNA标准分子量;1,2,3,4:分别为PCR扩增的4个重复样品。
M:DNA standard molecular weight;1,2,3,4:four repeated amplification samples of the PCR reaction.
2.2 转化DH5α后阳性重组子的菌落PCR鉴定
目的基因bls的表达片段与pET-28a(+)质粒载体经过双酶切、过夜连接后,转化克隆菌株DH5α。通过菌落PCR筛选阳性克隆子,电泳结果显示:筛选到3个含有pET-28a-bls阳性重组子的克隆子,而且,目的条带的大小与实际长度477 bp相符合。
2.3 转化TL129后阳性重组子的菌落PCR鉴定
将筛选得到的阳性重组子pET-28a-bls转化表达性宿主菌TL129之后,经过菌落PCR反应筛选含有pET-28a-bls的TL129阳性克隆菌株,电泳结果显示:筛选到2个阳性克隆子,而且,条带大小与bls基因的表达片段的实际477 bp的长度相一致。
2.4 重组蛋白质的诱导表达
将筛选得到的表达性宿主菌利用IPTG进行诱导表达,表达结果利用SDS-PAGE检测。电泳结果显示:经过0.1 mmol的IPTG的诱导,猪型布鲁氏菌的rBLS重组蛋白能够被大肠杆菌正确表达,加上表达载体上需要额外表达的组氨酸标签的大小为5.6 kDa,重组rBLS蛋白的实际大小约为21 kDa;同时,蛋白质凝胶电泳结果与rBLS蛋白的理论预测的分子大小相符。
M:DNA标准分子量;1,2,3,4:分别为菌落PCR反应扩增的4个重复样品。
M: DNA standard molecular weight. 1,2,3,4: four repeated amplification samples of the colony PCR reaction.
M:DNA标准分子量;1,2:分别为菌落PCR反应扩增的2个重复样品。
M:DNA standard molecular weight;1,2:two repeated amplification samples for colony PCR reactions.
M:蛋白质标准分子量;1:IPTG诱导前的菌体蛋白;2:IPTG诱导后的菌体蛋白。
M:protein standard molecular weight;1:total bacterial proteins without IPTG induction;2:total bacterial proteins after IPTG induction.
3 讨论
布鲁氏菌病是一种世界范围内常见的、可以在人畜之间传播的疾病;这种疾病的直接病原细菌就是布鲁氏菌,目前发现,布鲁氏菌存在6个种、20个生物型。不同种的布鲁氏菌的基因型十分保守,部分基因的序列几乎完全一致,这也为研制具有广泛作用的疫苗奠定了基础。目前,从免疫学的抗原决定簇观点出发,针对布鲁氏菌病的相关疫苗研究较多的是布鲁氏菌的外膜蛋白,研究者主要是想通过寻找布鲁氏菌的主要外膜蛋白分子,来揭示布鲁氏菌的主要抗原决定簇的构成,并且,进一步通过构建外膜蛋白缺失菌株或者制备外膜蛋白亚单位疫苗来彻底解决布鲁氏菌病的严重危害[6]。通过研究发现,不同种属的布鲁氏菌的外膜蛋白质分子十分保守,目前发现的这类分子包括Omp10、Omp16、Omp19、Omp25、Omp31等,虽然相关研究结果都证实这类分子是布鲁氏菌的抗原决定簇的主要构成部分,而且,Pasquevich KA等人通过分别构建布鲁氏菌Omp19与Omp10抗原分子的亚单位疫苗进行家畜免疫注射之后,发现布鲁氏菌的Omp19与Omp10分子都能在动物体内引起一定的免疫反应,因此,推测二者应该都是布鲁氏菌的抗原决定簇的主要构成部分,因为二者都具有较好的免疫保护作用,所以在疫苗开发方面具有一定的优势[7]。Jubier-Maurin V等人通过研究Omp25和Omp31分子的免疫学性质之后,发现Omp25和Omp31分子的存在直接影响着布鲁氏菌的毒力,缺少Omp25和Omp31抗原表位分子的基因突变菌株的侵染动物的能力会受较大的影响,从而证明了Omp25和Omp31分子属于布鲁氏菌重要的抗原表位分子[8]。此外,Cassataro J发现Omp31重组分子免疫小鼠之后,可以在小鼠体内激发长期的免疫应答记忆,刺激产生的抗体水平较高,而且,免疫保护效果较好[9]。这些结果都说明了外膜蛋白质分子在布鲁氏菌毒性方面的影响作用,然而,这些分子构建成的亚单位疫苗的免疫刺激强度并不理想,因此,没有在更广阔的范围使用。所以,如何解决外膜蛋白质分子免疫刺激强度低的问题就成为了研究的焦点。
此外,相关研究结果表明:布鲁氏菌内源性的BLS分子在细菌体内并不是单个分子来行驶酶分子的功能,事实上BLS分子合成之后首先会以“五聚体”的聚合形式出现在细胞中,之后又会以“十聚体”的形式聚合在一起来发挥酶分子的功能。这样,在构建蛋白质亚单位疫苗方面,如果能够将布鲁氏菌的抗原表位分子与BLS分子进行融合表达,从而形成融合肽,这样获得的蛋白质亚单位疫苗就非常有可能在免疫家畜之后,在动物体内发挥出更强的免疫刺激能力,产生出水平更高、持续时间更长的抗体。而且,这方面相关的研究工作已经证实:BLS分子与Omp分子融合后能够有效激发并且产生单克隆抗体[10]。因此,本文选择了布鲁氏菌的BLS分子进行研究,通过构建重组表达载体以及诱导表达,我们获得了rBLS重组蛋白,并且,进行了初步的纯化实验,这些实验结果为进一步研究rBLS分子的聚合功能提供了基础。
参考文献
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诱导表达 第2篇
基因表达谱差异显示技术是最近兴起的研究同种细胞在不同状态下基因表达差异的一种有效手段.目前已成功地应用于植物对害虫取食诱导防御的分子机制和发掘植物内源抗虫基因的研究领域,并显示出独特的`优势.本文仅就植物被害虫取食前后基因表达谱差异研究中所涉及的技术、原理、问题和取得的进展进行综述和展望.
作 者：韦朝领 高香凤 江昌俊 叶爱华 WEI Chao-ling GAO Xiang-feng JIANG Chang-jun YE Ai-hua 作者单位：韦朝领,WEI Chao-ling(安徽农业大学资源与环境学院,合肥,230036)
高香凤,江昌俊,叶爱华,GAO Xiang-feng,JIANG Chang-jun,YE Ai-hua(安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放实验室,合肥,230036)
诱导表达 第3篇
【摘要】目的:观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在卵泡不同发育期中的表达，初步探讨其与卵泡发育的关系。方法:选择不同周龄的C57BL/6J小鼠卵巢，用免疫组化法检测卵泡不同发育期中HIF-1α蛋白。结果:HIF-1α蛋白在不同发育期卵泡卵母细胞及颗粒细胞中均有表达，表达随卵泡发育而增强。且不同发育阶段卵泡中卵母细胞及颗粒细胞中HIF-1α蛋白表达差异具有统计学意义( P < 0. 05)。结论:卵泡发育不同阶段HIF-1α均有表达，在卵泡发育后期强表达。提示HIF-1α在卵泡的生长发育可能起重要调控作用。
【关键词】HIF-1α；卵泡发育；免疫组织化学；小鼠
【中图分类号】R339.2【文献标志码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0029-02
【Abstract】Objective:To explore the protein expression of HIF-1α in different developmental stages of the mice follicles. Methods Mice ovaries of different developmental stages were collected. The expression of HIF-1α protein was detected and evaluated by immunohistochemistry. Results HIF-1α proteins were expressed in the oocyte and granulosa cells of all different developmental stages. The expression of HIF-1α increased with the follicle development. HIF-1α protein levels in oocyte and granulosa cells of all different developmental stages were significantly lower
compared with each other stages(P < 0. 05). Conclusion The expression of HIF-1α protein especially at the late stage of the follicle development, suggests that the HIF-1α protein may play important roles in the follicle development.
【Key words】HIF-1α; follicle development; Immunohistochemistry; Mice
女性成年后卵巢即出現周期规律性排卵直至绝经时终止。经过多年研究表明：这是一个多因素相互作用的复杂的生物过程：伴随着下丘脑-垂体-卵巢轴（Hypothalamus-Pituitary-Ovary Axis，H-P-O轴）中相关激素如：卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH），黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH）等精确调控下卵巢中卵泡发育及其微环境改变，如卵泡液雌孕激素浓度上升及卵泡周围出现较多新生血管［1］。缺氧诱导因子1 (Hypoxia-Inducible Factor，HIF 1) 即，是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，其中HIF-1α是主要的氧调节亚基，可以调节多种靶基因如萄葡糖转运因子、血管内皮生长因子 (Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)［2］，对细胞适应缺氧状态至关重要。本研究从蛋白水平检测了小鼠卵巢中不同发育期卵泡HIF-1α的表达，旨在探讨HIF-1α在不同发育期卵泡的作用，并为今后进一步研究奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 实验动物:C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。由于昆C57BL/6J小鼠生后3周断奶，5～7周为性成熟期，9～12周为繁殖适龄期，为使处于不同时期的卵泡分布均匀，选取3周、6周、11周、15周各10只小鼠。苯巴比妥(15mg.kg -1) 腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定。卵巢取出后脱水透明、包埋、制4μm厚的石蜡切片。
1. 2 免疫组织化学法检测HIF-1α蛋白表达: 行超敏二步法免疫组化检测。HIF-1α一抗为羊抗小鼠单克隆抗体，购自武汉博士德公司；超敏二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。石蜡切片脱蜡至水。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，抗原修复15分钟，室温冷却。3%过氧化氢室温孵育10分钟，PBS冲洗，2分钟×3次。滴加1: 500一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加试剂1，37℃孵育20分钟，PBS冲洗，5分钟×3次。滴加试剂2，37℃孵育20分钟，PBS冲洗5分钟×3次。DAB显色剂显色。自来水冲洗，苏木素复染，酒精逆浓度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。
1. 3 结果判读:参照张爱群等［3］的标准，根据着色强度及范围分为： 阴性（-）， 无阳性染色细胞或细胞着色数 <5%； 弱阳性（+）， 阳性细胞数 5%- 25%；阳性（++），阳性细胞数（26%-50%） ； 强阳性（+++）， 阳性细胞数 >50%，
卵泡发育可分为5期：始基卵泡，由一个初级卵母细胞和一层梭形的前颗粒细胞组成。初级卵泡，颗粒细胞形成单层立方形并且在卵母细胞外形成透明带。次级卵泡，卵泡继续增大出现双层或多层颗粒细胞,此时尚无卵泡腔形成。窦状卵泡，颗粒细胞间聚集的卵泡液增加最后融合形成卵泡腔［4］。
1.4统计学处理 :采用SPSS13. 0 软件对数据进行分析。对数据行双向有序资料的χ2检验。
2 结果
2. 1 HIF-1α蛋白免疫组化结果：①着色部位: HIF-1α蛋白主要分布于细胞质,少量分布于细胞核。见图1，2，3。②HIF-1α蛋白表达于各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，且表达水平随卵泡发育逐渐增强。始基卵泡与次级、窦状卵泡相比，卵母细胞和颗粒细胞中HIF-1α蛋白表达明显较低，差异有统计学意义( P < 0. 05)。其在初级卵泡卵母细胞与颗粒细胞中表达均显著低于次级、窦状卵泡，差异有统计学意义( P < 0. 05)。次级卵泡与窦状卵泡相比，卵母细胞和颗粒细胞HIF-1α蛋白表达明显降低，差异有统计学意义( P < 0. 05)。见表1，表2。
3 讨论
HIF是作为促红细胞生成素基因表达的转录因子被首先确定的 ,后来发现 ,大多数低氧诱导基因的低氧诱导途径是通过 HIF 实现的。因此 , HIF 被称为低氧适应调节的管家转录因子［5］。其表达主要受缺氧及P53等转录因子的调控。HIF-1是氧气敏感的二聚体，由HIF-1 α和芳香烃受体核转位（芳香烃受体核转位，Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator, HIF-1 β/ARNT）亚基组成。在常氧状态下，HIF-1β位于细胞核中，而HIF-1α则在细胞质中，并被泛素-蛋白酶体系统快速降解；当氧气含量低于5%时会令HIF-1 α蛋白在细胞质中积聚，随后HIF-1α转位到细胞核中，结合HIF-1β形成HIF-1复合物,才能激活促红细胞生成素，VEGF等基因的转录进而发挥调节红细胞生成，血管形成等作用［6］。
卵泡发育是一个受到多种因素精细调控的复杂过程，其中氧气含量也是调控卵泡生理功能的重要因素之一［7,8］。有文献表明：一方面由于卵巢内氧气浓度较低，其范围在1.3%-5.5%左右［9］；另一方面随着卵泡卵母细胞的生长发育以及颗粒细胞的增殖分裂，颗粒细胞需氧量逐渐上升，使卵泡处于缺氧状态。在本实验中观察到，作为缺氧状态主要感受器的HIF-1 α表达于卵泡的整个生长阶段，且其强度随着卵泡发育逐渐增强，证实了随着卵泡发育卵泡内氧需求量逐渐上升并且在始终处于相对缺氧状态。Alam［10］等研究表明：HIF-1α在体外培养颗粒细胞中通过 磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K）途径参与到FSH诱导的卵泡血管生成，本研究中观察到HIF-1α在窦状卵泡中强烈表达，为此实验提供了直接的体内实验证据，同时亦提示HIF-1α可能参与到GnRH，FSH，LH等调控卵泡发育的过程。说明HIF-1 α参与了卵泡发育整个过程，并可能在此过程中通过上调VEGF等基因表达进而促进卵泡中新生血管形成，从而对卵泡的生长发育发挥重要调控的作用。
综上，卵泡生长发育的过程受到众多因素的调节，对其中卵泡局部氧气浓度对于调节其生长发育至关重要。本试验提出卵泡中HIF-1 α表达在调控生长卵泡中新生血管发挥一定作用。实验结果为探索局部氧气浓度在调控卵泡生长发育中具体作用提供了新的思路，并为日后的进一步研究奠定基础。
参考文献
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诱导表达 第4篇
1材料与方法
1.1患者标本
所有组织来源于2013年12月-2015年3月期间来西藏军区总医院行胃癌手术的84例藏族患者的肿瘤组织标本,同时取癌旁组织(距离癌组织大约5 cm)。其中男49例,女35例,年龄45~78岁, 平均(62.11±9.97)岁,术前未做过任何放疗及化疗。
1.2实验材料与试剂
不完全DMEM低糖培养基以及胎牛血清(FBS) 购自Gibco公司(美国),Trizol试剂盒购自英骏公司(上海),c DNA逆转录试剂盒购于Femantes公司(美国),PCR试剂盒、DNA Marker、DEPC、青霉素与链霉素(PS双抗)均购于南京生兴生化科技有限公司。
1.3细胞转染
采用脂质体LipofectamineTM2000对胃癌细胞SGC7901转染si RNA-HIF-1a、si RNA-HIF-2a以及HIF-1a、HIF-2a过表达质粒(上海吉玛公司)。分为3组:空位组、对照组(加入乱序序列)、实验组(分别加入HIF-1a或者HIF-2a的si RNA靶向序列)。HIF- 1a的si RNA靶向序列为5'-TACGTTGTGAGTGGTAT TATT;HIF-2a的si RNA靶向序列为5'-CCCGGATA GACTTATTGCCAA[5];对照序列为5'-AATTCTCCGA ACGTGTCACGT。用RT-PCR技术验证转染效率。
1.4细胞总RNA提取及逆转录反应
细胞转染48 h后,收集胃癌细胞,加入1 ml Trizol后,按照说明书的要求抽提总RNA,所得RNA溶于30 ml DEPC处理水。提取的总RNA经紫外分光光度计(Nano Drop ND-1000)进行定量及检测纯度。对所得RNA进一步采用Thermo逆转录试剂盒逆转录成c DNA。本实验使用美国ABI公司的7300型号Real-time PCR仪器进行扩增,PCR反应条件: 95℃变性20 s,然后60℃ 20 s和70℃ 1 s进行40个循环,使用2-ΔΔCt法进行相对定量分析结果。
1.5 CCK-8法检测细胞增殖水平
待SGC7901细胞汇合度达到50%~60%左右, 加入转染control和HIF-1a或HIF-2a si RNA,并分别于培养后0、24、48和72 h每孔按1∶10体积比混合完全DMEM和cell counting Kit-8(CCK-8,cell signling,USA),采用分光光度计测定450 nm波长OD值,并制作细胞生长曲线。
1.6统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较用两独立样本t检验,相关分析用Spearman法,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1高原藏族胃癌患者组织中HIF-1a、HIF-2a的m RNA表达水平
与癌旁组织比较,高原藏族胃癌患者组织中HIF-1a与HIF-2a的m RNA水平均显著增加(P < 0.05),提示缺氧诱导因子的表达异常可能是参与高原低氧环境下藏族胃癌患者致病的重要因子。
2.2高原藏族胃癌患者组织中HIF-1a、HIF-2a的m RNA表达水平与胃癌TNM分期的关系
Spearman相关分析结果显示,胃癌组织中HIF- 1a的m RNA表达水平与胃癌的TNM分期显著正相关(r =0.657,P <0.05)(见表1),而胃癌组织中HIF- 2a的m RNA表达水平与胃癌的TNM分期无显著相关(r =0.312,P >0.05)(见表2),说明HIF-2a与胃癌的临床分期等级无显著相关,而HIF-1a表达越高, 胃癌的临床分级越高(见表2)。
2.3低表达HIF-1a对胃癌细胞增殖水平的影响
与对照组比较,胃癌细胞转染HIF-1a si RNA后,HIF-1a m RNA水平显著降低(见图1A),与对照组比较,干扰HIF-1a后的胃癌细胞的增殖水平显著降低(见图1B),差异有统计学意义(P <0.05)。此外, 与对照组比较,干扰HIF-1a后的胃癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的m RNA水平显著降低(见图1C),差异有统计学意义(P <0.05)。
2.4低表达HIF-2a对胃癌细胞增殖水平的影响
与对照组比较,胃癌细胞转染HIF-1a si RNA后,HIF-1a m RNA水平显著降低(见图2A),提示干扰效果成功。与对照组比较,干扰HIF-1a后的胃癌细胞的增殖水平无显著变化(见图2B)(P >0.05),干扰HIF-1a的胃癌细胞中VEGF的m RNA水平亦无显著变化(见图2C)(P >0.05)。
注:1) 与癌旁组织比较,t =6.74,P <0.05;2) 与癌旁组织比较,t = 9.17,P <0.05
注:1)与胃癌的TNM分期比较,r =0.657,P <0.05;2)r =0.312,P > 0.05
3讨论
缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一,同时也是肿瘤发生恶性转化甚至转移的启动因子。高原地区也是我国胃癌高发地区之一,其胃癌死亡率居全国之首。我国藏族是在高原生活的特有少数民族,其机体在高原环境适应过程中形成特有的免疫体系。高原环境下,低氧是一种环境因子,也是一种主要的刺激原,机体对低氧的应激反应异常是导致各种高原适应不全和高原疾病的重要原因。大量的临床研究均表明,高原环境肿瘤组织中存在的缺氧状态是肿瘤预后不良的重要指标[6]。缺氧首先是通过一种名为缺氧诱导因子的蛋白物质来发挥作用,缺氧诱导因子是可以受缺氧诱导的,并且在缺氧状态下稳定存在[7,8,9]。研究认为,缺氧诱导因子在肿瘤的发生、发展以及肿瘤的转移中起着核心功能,并在评价肿瘤治疗及预后中发挥重要的作用。
缺氧诱导因子家族中,HIF-1a和HIF-2a是近年来新发现的能结合DNA的蛋白质分子,在多种肿瘤细胞中表达,是缺氧条件下肿瘤细胞产生的核转录因子,并在肿瘤血管生成中起着核心调控作用[10]。 研究认为,HIF-1a与以胃癌的浸润程度、淋巴结以及远处转移为依据的临床TNM分期呈正相关,同时与平均生存时间及5年生存率也存在密切相关。其原因主要是由于肿瘤组织的快速生长导致血管紊乱、肿瘤的血液供应能力下降、氧气消耗增加,由于患者处于贫血状态,血红蛋白下降使得血液携氧能力下降,最终导致胃癌的低氧环境[10,11]。然而至今, HIF-1a、HIF-2a在藏族高原胃癌患者这一类低氧环境中特殊人群的潜在作用及其机制尚少了解。
本研究观察我国藏族高原的胃癌患者体内HIF-1a、HIF-2a基因的表达情况,并通过低表达胃癌细胞系中HIF-1a、HIF-2a基因水平后,探讨两者基因修饰对胃癌的发生、发展的影响。结果发现,藏族高原胃癌的患者组织中HIF-1a、HIF-2a基因的表达显著高于癌旁组织,从而初步提示HIF-1a、HIF- 2a在高原藏族胃癌患者的发病中可能发挥着重要的作用。原因可能是,在胃癌肿瘤的发生、发展的进程中,造成局部组织缺氧,显著促进HIF-1a、HIF-2a的表达[11,12],而处在缺氧、严寒等环境下的高原,低氧血症是最主要的病生变化,造成机体高表达HIF-1a、 HIF-2a[13,14]。但它作为一种原发打击因素或急性持续性地刺激因素成为一种非特异性刺激原,并且用以激活机体内的炎症细胞因子、介质、基因等极端复杂的网络系统,使全身多器官、组织、细胞处于预激状态,而高原胃癌肿瘤在这个特殊环境中,其造成局部组织缺氧可能更加严重,从而可能更加显著地促进HIF-1a、HIF-2a的表达。笔者进一步分析胃癌组织中HIF-1a、HIF-2a的m RNA表达水平与胃癌的TNM分期的关系,结果发现,HIF-1a与胃癌分期显著正相关,而胃癌组织中HIF-2a的m RNA表达水平与胃癌的TNM分期程度无相关,提示了高原胃癌组织中HIF-1a表达越高,胃癌的分期越高,也就说明HIF-1a的高表达与高原胃癌肿瘤的恶性行为及不良的预后有着密切的关系。而高原胃癌组织中HIF- 2a与胃癌的分期无显著相关,同时CHEN等人[15]发现胃癌患者发生肝转移的组织中HIF-1a的表达水平显著增加,也从侧面支持本研究的结论。
进一步采用小RNA干扰技术干扰胃癌细胞系中HIF-1a、HIF-2a后发现,低表达HIF-1a的胃癌细胞的增殖水平显著降低,而低表达HIF-2a的胃癌细胞的增殖水平无显著变化,提示HIF-1a可能影响着胃癌细胞的增殖能力,从而提示胃癌细胞中HIF-1a表达水平在胃癌诊断及预后评价中可能有着一定的作用。研究认为,HIF-1a被激活后可以调节多种肿瘤相关的基因,尤其是VEGF等[16,17,18,19],从而使细胞对缺氧环境产生应激反应、更好地适应缺氧环境。本研究结果亦发现,低表达HIF-1a的胃癌细胞的VEGF表达水平显著降低,而低表达HIF-2a的胃癌细胞的VEGF表达水平无显著变化,提示HIF-1a可能通过调节VEGF基因参与胃癌的发生、发展。
诱导表达 第5篇
【摘要】 目的：观察乌司他丁对控制性降压诱导的缺血缺氧脑损伤Caspase-3表达及凋亡程度。方法：60只新西兰大白兔随机分成5组，每组12只：正常组（Ⅰ组），控制性降压组（Ⅱ组，平均动脉压降至基础值的45%组），乌司他丁降压前给药组（Ⅲ组，控制性降压前30min静注乌司他丁10*104IU/kg），乌司他丁降压后给药组（Ⅳ组，控制性降压开始后30min静注乌司他丁10*104IU/kg），乌司他丁降压前+降压后给药组（Ⅴ组，控制性降压开始前30min和开始后30min均静注乌司他丁10*104IU/kg）。各组在硝普钠降压一个小时后，停止降压2小时后处死，取出海马组织。TUNEL检测海马凋亡细胞，用Western-blot检测海马组织casspase-3。结果：1、Western-blot检测：与II组比较，三组用药组（III、IV、V组）Caspase-3表达显著减少（P<0.01）；与III、IV组比较， V组Caspase-3表达减少（P<0.05）。与II组比较，用药三组调亡指数减少（P<0.01）。2、TUNEL检测：与II组、III组、IV组、V组比较，显示I组调亡指数最少的（P<0.01）。与III组、V组比较，显示IV组的调亡指数有所增加（P<0.05）。结论：1、乌司他丁对控制性降压引起脑缺血缺氧脑损伤是有保护作用，其可能抑制Caspase-3的表达，减少神经细胞凋亡有关；2、在三组给药的不同时段比较中，降压前+降压后给药组（V组）Caspase-3的表达最少；由此说明，推荐的给药方法是降压前和降压后同时给药。
【关键词】乌司他丁；控制性降压； 缺血缺氧脑损伤； casspase-3
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）02-0014-02
控制性降压是在手术中常用的技术。同时控制性降压也会带来风险，有学者报导在控制性降压出现脑损伤等[1-2]。关于不同的控制性降压水平对兔海马CA1神经元影响的研究[3]结果显示MAP降至基础值的45%，兔海马CA1神经元凋亡程度最严重，因此本研究以MAP降至基础值45%，以观察乌司他丁对控制性降压诱导的缺血缺氧脑损伤Caspase-3表达及凋亡程度以指导临床应用。
1 资料与方法
1.1 实验材料
实验动物 清洁级新西兰雄性大白兔，体重1.8-2.2kg。
实验药物及试剂 乌司他丁、TUNEL试剂盒、Caspase-3。
1.2 实验方法
分组及给药方法 健康新西兰白兔60只，雄性，体重1.8-2.2Kg，由南方医科大学实验动物中心提供。60只健康新西兰白兔，随机分成5组，每组12只：正常组（I组），控制性降压组（II组，平均动脉压[MAP]降至基础值的45%组），乌司他丁降压前用药组（III组，控制性降压前30min静脉注射乌司他丁10*104U/kg），乌司他丁降压后用药组（IV组，控制性降压开始后30min静脉注射乌司他丁10*104U/kg），乌司他丁降压前+降压后用药组（V组，控制性降压开始前30min和开始后30min均给予静脉注射乌司他丁10*104U/kg）。
动物模型 氯胺酮50 mg/kg复合1mg/kg力月西肌注麻醉（术中肌注氯胺酮20 mg/kg/30min）。沿颈中正切开，分离气管，插入气管导管，接呼吸机机械通气（潮气量21ml，呼吸51bpm，FiO21.0）。分离颈内静脉、穿刺置管，接延长管输液通路并输液（8ml/kg）。在兔腹股沟下缘分离股动脉并穿刺置管，接测压转换器并开始动脉测压。正常组采用5%葡萄糖注射液4ml/ （kg*h） 连续泵注；降压组及治疗组均采用5%葡萄糖液配制的硝普钠（400ug/ml）开始泵注，10-15分钟内降至目标血压，维持目标血压l h。根据上述分组方案，给予乌司他丁。降压完毕后，实验动物复压2 h后处死。
1.3 标本采集与处理 每组动物中的一半用于灌注固定：降压停止后2h，打开胸腔暴露心脏，由心尖进针插入升主动脉（同时钳夹腹主动脉，剪开右心耳），快速滴注37℃生理盐水500ml，无血污后改为滴注4%多聚甲醛固定液500mL，先在5min内灌入约100ml，余液在25分钟内灌完。开颅取出1mm及4mm海马组织，切取右边1mm3置于4%多聚甲醛液中后固定，剩余组织放置于中性甲醛溶液中固定、梯度乙醇脱水、包埋、切片、捞片、烤片。每组中另外一半动物在复压2h后处死，迅速取出海马组织，在-80℃冻存，用于Western Blot检测。
1.4 标本检测方法
1.4.1 Western-blot检测Caspase-3的表达
剪碎组织，与裂解液1：5混合，取上均浆。离心，取上清液；使用Bradford法进行蛋白质定量，然后12%SDS-PAGE电泳分离，依marker指示，将测蛋白转PVDF膜上；封闭液4℃过夜，抗Caspase-3抗体1：1500稀释与PVDF膜温2H，加入二抗，ECL反应2min，将蛋白印迹曝光在X光胶片上。结果使用Gel-Pro Analyzet4.0进行分析。以GAPDH为内参。
1.4.2 TUNEL检测凋亡细胞
将冰冻组织切片固定10min，PBS 漂洗10*2min。再置乙醇：乙酸（2：1）溶液-20℃处理5min。PBS 漂洗10*2min。2% H2O2浸泡5min。PBS洗涤10*2min。滴加TdT酶反应液，37℃孵育1h（阴性染色对照，加不含TdT酶的缓冲液替代）。滴加两滴过氧化物酶标记的地高辛抗体，室温孵育30min。PBS洗涤10*2min。DAB显色3～6min。蒸馏水洗5*3min。甲基绿复染10min。蒸馏水洗5*3min，再用100%正丁醇5*3min。常规脱水、透明和封片。在400倍光镜下观察海马组织病理学改变。随机选取6个视野，按照（TUNEL阳性神经细胞/神经细胞总数）×100%计算海马神经细胞的凋亡指数。
1.5 统计学处理
各组数据应用SPSS13.0进行分析。所有计量资料进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05，认为有差异统计学意义。
2 结果
2.1 Western-blot检测Caspase-3的表达
与控制性降压组（II组）比较，三组用药组（III、IV、V组）Caspase-3含量显著减少（P<0.01）；V组与III、IV比较，显示V组Caspase-3含量减少（P<0.05）。结果如下图：
2.2 TUNEL检测凋亡细胞
与II组比较，III、IV、V组三组调亡指数减少（P<0.01）。II、III、IV、V组与I组比较，P<0.01，显示正常组调亡指数最少的。IV组与III、V组比较，P<0.05，显示IV组，调亡指数有所增加。
3 讨论
脑血流有自动调节功能，但是这种自我调控功能和耐受性的平均动脉压的安全低限存在明显的个体差异。同时脑的生理特性也是脑缺血缺氧易损伤的原因之一。当控制性降压引脑灌注压明显下降时，极易使脑缺血缺氧而受到损害[4-5]。
脑缺血缺氧会引起促进细胞凋亡[6]。参与凋亡过程相关的基因有几十种，其研究较多的如Bcl-2家族[7]、即早基因[8]、caspase家族[9]等。其中，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。在凋亡级联反应中，Caspase-3是最为主要的，在神经元细胞凋亡过程中起着决定性作用[10]。
本实验中，Western blot检测Caspase-3显示给药三组（III组、IV组及V组）与控制性降压组比较，三组用药组Caspase-3的含量显著减少，说明用药后，Caspase-3的表达是减少的，减轻了神经细胞凋亡反应。乌司他丁降压前+降压后用药组Caspase-3的表达，明显少量其它用药二组，说明V组乌司他丁的用药方法更好的抑制Caspase-3的表达，减轻了神经细胞凋亡。同时在凋亡指数中正常组的神经海马细胞的凋亡指数是最少的，而控制性降压组的凋亡指数是最严重的。同时，与控制性降压组比较，用药三组凋亡指数降压，说明乌司他丁有效减轻控制性降压引起的脑缺血缺氧脑损伤的细胞凋亡。而用药三组之间比较显示，降压后给药组细胞凋亡更严重。说明在用药三组比较，降压后给药，神经细胞凋亡比较多。
综上所述，乌司他丁对控制性降压引起脑缺血缺氧脑损伤是有保护作用，其可能抑制Caspase-3的表达，减少神经细胞凋亡有关；在三组给药的不同时段比较中，降压前+降压后给药组Caspase-3的表达最少；由此说明，推荐的给药方法是降压前和降压后同时给药。
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诱导表达 第6篇
1 材料和方法
1.1 药物及试剂
Apigenin、LY294002为美国Sigmma公司出品;DNA Ladder检测凋亡试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限公司。PTEN、Akt、p-Akt、p-Bad和β-actin抗体购自Santa Cruz公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗均购自武汉博士德公司。
1.2 细胞培养
人肝癌Hep G2细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,在37℃、5%二氧化碳混合气体、95%饱和湿度的培养箱内培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.3 实验方法
1.3.1 PI染色FCM分析
细胞用含0.1%的小牛血清的培养基培养24 h,分别换含不同浓度API的完全培养基,使其终浓度分别为20、40和80μmol/L,溶媒对照组加入相同体积的含0.1%DMSO的完全培养基分别处理48 h,收集细胞,冷PBS洗2遍,用4℃的75%乙醇固定24 h后,经碘化丙啶(PI)染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3.2 DN A凝胶电泳
用北京博大泰克生物基因技术有限公司凋亡细胞DNA ladder检测试剂盒按说明书步骤分别提取经40μmol/L的API、10μmol/L的LY294002处理细胞的DNA,取DNA试样10μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,DBT-08凝胶图像分析系统观察并摄影。
1.3.3 Western blot
API(40μmol/L)和溶媒对照组(加入相同体积含终浓度0.1%DMSO)的完全培养基分别处理Hep G2细胞12 h和24 h后,收集细胞,用PBS洗3次,用细胞裂解液[0.1M氯化钠,0.01M Tris-cl(p H7.6),0.001M EDTA(p H8.0),1μg/m L Aprotinin,100μg/m L PMSF]裂解后,4℃,13 000×g离心10 min,用酶联免疫检测仪进行蛋白定量。取蛋白试样(25μg总蛋白/泳道)加入等体积上样缓冲液,100℃煮10 min,10%或6%SDS-PAGE电泳后转移(100 m A,3 h)至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h,按照抗体说明书要求分别加入适当浓度的PTEN、Akt、p-Akt、p-Bad和β-actin抗体,4℃过夜;TBST洗涤30 min,每10 min换液1次,加入相应的二抗室温孵育1 h后,用TBST洗膜3次,每次15 min。然后在含化学发光剂A、B的溶液中激发荧光,于暗室中压片、显影、定影。结果扫描及用图像分析仪分析,以处理组灰度面积的乘积/内参灰度面积的乘积反映蛋白的表达丰度变化。
1.4 统计学分析
各组实验数据均用表示,采用SPSS windows 13.0软件One Way ANOVA方式行方差分析,两两比较采用Students’t检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 API对人肝癌HepG2细胞凋亡率的影响
PI染色FCM分析发现API以浓度依赖方式诱导HepG2细胞株sub-G1期细胞累积,见图1。说明API具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用。
2.2 API和LY294002对HepG2细胞DNA非随机性剪切的影响
DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示:40μmol/L的API和10μmol/L的LY294002作用24 h,HepG2细胞发生非随机性DNA剪切,呈现典型的DNA梯形条带,见图2。证实:API与PI3K特异性阻断剂LY294002一样能促进HepG2细胞凋亡。
2.3 API对HepG2细胞PTEN蛋白表达的影响
Western blot分析表明40μmol/L的API处理HepG2细胞12 h和24 h,PTEN蛋白表达分别上调达132.6%和158.9%,见图3。说明API具有上调HepG2细胞PTEN蛋白表达作用。
2.4 API对HepG2细胞磷酸化Akt水平的影响
Western blot结果显示40μmol/L的API处理HepG2细胞12 h和24 h,磷酸化Akt蛋白水平下降至86.3%和75.6%,见图4。推测API可能通过增强PTEN蛋白功能抑制PI3K活性,进而抑制Akt磷酸化。
2.5 API对HepG2细胞磷酸化Bad水平的影响
Western blot分析结果表明40μmol/L的API处理HepG2细胞12 h和24 h,磷酸化Bad蛋白水平降低到73.4%和69.3%,见图5。提示API抑制Akt蛋白磷酸化,进而下调Bad蛋白磷酸化。
3 讨论
最近,众多文献报道第10号染色体同源性丢失性张力蛋白-磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)缺失或功能低下,导致其下游的丝苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)信号途经持续激活,Akt信号途径的激活在肝癌发生和发展中发挥重要作用[4~6]。有研究提示:API通过与噻唑烷酮类化合物不同的方式激活PPARγ抑制COX-2和i NOS活性[7],而PPARγ配体罗格列酮能通过上调PTEN,抑制Akt磷酸化诱导人肝癌细胞凋亡[8]。据此,推测API具有诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的作用,其诱导凋亡作用机制涉及上调PTEN蛋白表达。
本文的细胞DNA含量测定结果发现API浓度依赖性诱导HepG2细胞亚G1期细胞累积;DNA断片法进一步证实API与PI3K特异性阻断剂LY294002均具有诱导Hep G2细胞凋亡效应。Western blot分析证实API有效下调PTEN蛋白表达,降低Akt蛋白和Bad蛋白的磷酸化水平。有文献指出:PTEN是一种脂质磷酸酶,可以催化PIP2与PIP3脱磷酸,拮抗PI3 K的活性,抑制AKT的激活[9],而活化的AKT是很强的细胞存活因子,能降低凋亡因子与增加抗凋亡蛋白的活性[10];AKT能够磷酸化Bad,后者释放被其抑制的抗凋亡蛋白Bcl-xL;磷酸化的Bad还通过阻断细胞色素C的释放参与抗凋亡[11]。因此,API诱导人肝癌HepG2细胞PTEN蛋白表达,进而抑制PI3k/Akt信号传导,降低磷酸化Bad蛋白水平是其诱导细胞凋亡的分子作用机制之一。
参考文献
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诱导表达 第7篇
1 资料与方法
1.1 病例资料
选取我院2003年12月—2009年5月住院的膀胱癌患者, 共选取50例。其中男28例, 女22例;年龄32~62岁, 平均52.8岁。移行细胞癌30例, 鳞状细胞癌15例, 腺癌3例, 乳头状瘤2例。另选距肿瘤基底3 cm以外的癌旁正常组织标本15例作为对照[2]。临床表现:间歇性无痛性肉眼血尿或显微镜下血尿;尿频、尿急、尿痛等膀胱刺激症状, 肿瘤较大或发生在膀胱颈部, 可造成尿流阻塞, 排尿困难, 甚至出现尿潴留;引起肾积水, 出现腰酸、腰疼、发烧等。
1.2 主要试剂
兔抗人多克隆抗体HIF-1α (武汉博士德公司) , VEGF定量检测试剂盒 (北京晶美公司) , DAB显色剂和ELISA通用型试剂盒 (北京中山生物公司) [3]。
1.3 染色方法
采用免疫组化法。免抗人多克隆抗体HIF-1α的工作浓度为1∶50, 具体操作过程均按试剂盒说明书进行。
1.4 检查
1.4.1 尿细胞学检查
应作为首选的检查方法, 若能发现癌细胞或可能存在尿路上皮癌, 可说服患者接受膀胱镜等检查。假阴性病例多数为分化良好的乳头状瘤, 假阳性常为结石、感染、损伤、尿潴留等所致。其阳性率为70%~80%, 故细胞学检查可以作为职业性膀胱癌的筛选。
1.4.2 膀胱镜检查
在膀胱肿瘤诊断中占有极重要位置, 可以直接看到膀胱癌的形态是乳头状还是实性、团块状, 有血管蒂存在还是广基;其它如肿瘤所在部位、数目、大小等皆可观察, 并可取活体组织检查明确诊断。粘膜病变与预后关系最密切的是轻度或重度的异常增生以及原位癌, 其次是多发性;肿瘤的大小、细胞级, 粘膜固有层有无浸润不是主要因素。
1.5 统计学分析
应用SPSS统计软件处理, 计量资料以表示, 同期组间比较采用t检验, P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
30例移行细胞癌, 阳性例数21例, 阳性表达率70%;15例鳞状细胞癌, 阳性例数10例, 阳性表达率66.67%;3例腺癌, 阳性例数2例, 阳性表达率66.67%;2例乳头状瘤, 阳性例数2例, 阳性表达率100%;15例癌旁正常组织标本, 阳性例数2例, 阳性表达率13.3%, 见表1。
3 讨论
(1) 本组50例膀胱癌细胞中的阳性表达率为72.0% (36/50) , 在正常对照组中的阳性表达率为13.3% (2/15) , 两组间比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。HIF-1α在缺氧条件下能激活多种缺氧反应性基因的表达, 通过了解HIF-1α在膀胱癌中的作用, 可以更加有效地治疗膀胱癌, 从而有望为膀胱癌的早期诊断及治疗提供一条新的途径[4]。
(2) 膀胱癌治疗方式包括: (1) 膀胱癌外科手术治疗。具体手术范围和方法应严格根据肿瘤的不同分期、恶性程度和病理类型以及肿瘤的大小、部位、有无累及邻近器官等情况综合分析确定; (2) 膀胱癌放射治疗。放射治疗多是配合手术前、手术后进行。对于病期较晚, 失去手术时机或拒绝手术以及术后复发的病例行姑息性放疗也能获得一定疗效; (3) 膀胱癌介入放射治疗。介入放射学治疗是指利用放射学技术, 经导管将药物直接注入肿瘤的供养血管, 从而杀灭肿瘤细胞。对于II-IV期膀胱癌病人, 也可利用此方法, 使肿瘤病灶缩小, 提高手术切除率, 减少复发率; (4) 膀胱癌化疗。膀胱癌的化学药物治疗包括膀胱内灌注化疗对浅表有病灶者仍有治疗作用。全身化疗、动脉灌注化疗全身联合化疗可以提高手术切除率, 提高膀胱癌的综合治疗效果; (5) 膀胱癌免疫治疗。研究表明, 膀胱移行细胞癌具有抗原性, 患者免疫力受损的情况与肿瘤分期、分级和血管淋巴扩散有很大关系。因此, 该病适合应用免疫治疗; (6) 中医中药治疗。可以用于膀胱癌的任何时期, 性质温和疗效显著, 可以单独使用也可与其它治疗方式配合使用, 可以起到增效减毒的作用[5]。
(3) 膀胱癌的预防措施。膀胱癌多发于50岁以上的中老年人, 随着年龄的增大发病率也相应增长。膀胱癌的发生与饮食、吸烟和饮水三个因素密切相关, 因此, 预防膀胱癌也应从源头抓起。
首先, 应该坚持科学的饮食习惯, 多吃新鲜蔬菜、水果。其次, 有吸烟习惯者, 要尽快戒烟。如果每天吸烟指数达到600 (每日吸烟支数×吸烟年数) , 就达到了患膀胱癌的危险地步。再次, 增加饮水量, 因为饮水量的多少, 直接影响膀胱内尿液的浓度, 对膀胱癌的发生有重要影响。饮水量少者膀胱中的尿液必然减少, 而致癌物质从肾脏排泄到膀胱后, 在尿液中的浓度也相应提高, 这些高浓度的致癌物质会对膀胱粘膜造成强烈的刺激。同时, 饮水量少者, 排尿间隔时间必然延长, 这就给细菌 (如大肠杆菌) 在膀胱内的繁殖创造了有利条件, 经常发生膀胱癌者, 多数是平时不喜欢饮水、饮茶的人。
因此, 要想预防膀胱癌的发生, 就应该充分饮水, 使尿液稀释后及时排出, 这样, 尿液中细菌和致癌物质就相对降低, 可以减少对膀胱粘膜的刺激和损害, 起到预防膀胱癌的作用。
参考文献
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诱导表达 第8篇
目前,人TRAIL在多种表达系统中获得表达,如大肠杆菌[4,5,6,7,8]、毕赤酵母[9]、昆虫细胞[2]和哺乳动物细胞[1]等,其中大肠杆菌表达系统具有遗传背景简单、技术成熟和周期短等优点,是研究最多的系统,但目前大肠杆菌表达的TRAIL多以包涵体或融合蛋白形式表达,包涵体和融合蛋白均需前处理过程而影响蛋白的最终产率和成本,而蛋白可溶形式则克服这些问题,更有利于进一步的产业化。
本研究通过对大肠杆菌宿主和诱导温度进行优化,最终获得TRAIL高表达的可溶形式蛋白,体外活性检测结果表明,获得的蛋白质具有良好的抑制多种癌细胞增殖的能力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株和细胞株
大肠杆菌DH5α为作者实验室保存,表达质粒pET43.1a及表达菌株均购自Promega公司。测活所用各种癌细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.1.2 试剂
所有工具酶购自Promega公司;胶回收试剂盒GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit购自GE Healthcare公司;缓冲液A:50 mmol/L PB、0.15 mol/L NaCl,pH 8.0;缓冲液B:50 mmol/L PB,pH 8.0;缓冲液C:20 mmol/L PB,pH 7.0,LB培养基购自Oxoid公司。
1.2 方法
1.2.1 TRAIL基因合成和重组质粒构建
根据GenBank(登录号:HSU37518)合成TRAIL(编码114-281aa)序列,分别在5′端和3′端引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
利用NdeⅠ、SalⅠ双酶切合成的TRAIL基因,与同样酶处理的pET43.1a载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行测序鉴定。
1.2.2 TRAIL蛋白表达
1.2.2.1 TRAIL在JM109(DE3)中表达
将构建重组质粒转化大肠杆菌JM109(DE3),挑取阳性转化子,转接于含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中,37℃、220 r/min振荡培养至OD600=0.6,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导5h,SDS-PAGE检测蛋白表达。
1.2.2.2 宿主筛选
将重组质粒分别转化BL21(DE3)、BL21pLysS(DE3)和Rosetta(DE3),SDS-PAGE检测表达,并与JM109(DE3)中蛋白表达量进行比较。将表达量较高的菌株在1mmol/L IPTG、28℃条件下诱导表达9h,收集诱导后菌体,超声波裂解后,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。
1.2.2.3 诱导温度优化
确定宿主筛选后,对可溶形式表达最优的菌株进一步进行诱导温度优化(37℃、30℃、25℃和20℃),选择最适可溶表达形式的温度。
1.2.3 TRAIL纯化
收集菌体,超声破碎后离心除去沉淀。上清中加入终浓度65%(m/V)硫酸铵,4℃放置4h后,离心收集沉淀,用缓冲液A溶解,补加Tween80使其终浓度为0.2%(V/V)。用缓冲液A平衡Ni Sepharose 4B层析柱,上样,用含300 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱,收集洗脱峰。利用缓冲液B平衡的Sephadex G25对洗脱产物进行脱盐,脱盐产物再经用缓冲液B平衡的Q sepharose FF层析柱,收集穿出部分,用0.2 mmol/L NaH2PO4调节pH值至6.5,上样于缓冲液C平衡的Source 30 S柱,用含0.6 mmol/L NaCl的缓冲液C洗脱,收集目标产物。
1.2.4 体外活性检测
将人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人结肠癌细胞COLO205和HCT116、人胰腺癌细胞SW1990和人乳腺癌MDA-MB-231培养至对数生长期,分别消化后用培养基悬浮细胞,使其终浓度为3～5×104个/mL,每孔100μL加入96孔细胞培养板中,37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后弃去培养上清,每孔加入200μL培养基稀释的TRAIL,终浓度分别为1 000、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL,同时以培养基稀释的PBS作为空白对照,培养48 h后,磺酰罗丹明B染色15 min,酶标仪检测各孔的OD490值。 按公式(OD490对照孔- OD490给药孔)/ OD490对照孔×100%计算抑制率,用GraphPad Prism 4软件四参数法计算IC50值。
2 结果与分析
2.1 TRAIL表达载体构建
构建TRAIL表达载体pET43.1a-TRAIL后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子进行测序验证,结果表明基因片段与设计的TRAIL基因序列完全一致,并且阅读框正确。
2.2 TRAIL蛋白表达
2.2.1 TRAIL在JM109(DE3)中表达
阳性转化子经IPTG诱导后收集菌体,SDS-PAGE检测蛋白质表达,结果显示,与未诱导菌株相比,诱导后菌株总蛋白中出现分子量约为19 kDa的蛋白条带(图1),与TRAIL蛋白大小相符,表明TRAIL获得表达,利用ImageMaster VDS软件(Pharmacia Biotech)分析表明TRAIL表达量约占全菌总蛋白的30%。
1:蛋白分子量标准;2～5:阳性转化子诱导后菌体总蛋白;6:未诱导菌体总蛋白。
2.2.2 宿主筛选
将pET43.1a-TRAIL转化BL21(DE3)、BL21pLysS(DE3)、Rosetta(DE3)和JM109(DE3)宿主中,经过IPTG诱导,对全菌蛋白进行SDS-PAGE检测(图2 A、B)。经过软件分析,目的蛋白在JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中表达量相当,高于在BL21(DE3)和BL21pLysS(DE3)中的表达量。
进一步分析JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中蛋白的表达形式(图3),JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中可溶形式蛋白含量分别约为70%和50%,而JM109(DE3)和Rosetta(DE3)菌体密度OD600分别为2.07和5,导致Rosetta(DE3)中可溶形式表达蛋白表达量为JM109(DE3)的2倍,最终选择Rosetta(DE3)作为TRAIL表达宿主。
A.1: 蛋白分子量标准; 2～4: BL21(DE3)菌株; 5～7: BL21pLysS(DE3)菌株; 8～11: JM109(DE3)菌株。B.1: 蛋白分子量标准; 2～6: Rosetta(DE3)菌株; 7: JM109(DE3)菌株。
A.1: Protein marker; 2-4: BL21 (DE3) strain; 5-7: BL21pLysS (DE3) strain; 8-11: JM109 (DE3) strain.B.1: Protein marker; 2-6: Rosetta (DE3) strain; 7: JM109 (DE3) strain.
1:JM109(DE3)未诱导菌体总蛋白;2:蛋白分子量标准;3～5:JM109(DE3)诱导;6～8:Rosetta(DE3)诱导;3,6:菌体总蛋白;4,7:裂解液沉淀;5,8:裂解液上清。
2.2.3 诱导温度优化
在37℃、30℃、25℃和20℃温度条件下,诱导Rosetta(DE3)中TRAIL表达,利用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式(图4 A、B)。
软件分析表明:诱导温度为37℃、30℃、25℃和20℃时,TRAIL可溶形式蛋白所占比例分别为33%、47%、55%和55%;结合蛋白质表达量和细胞密度,30℃和25℃条件下可溶形式蛋白表达量相当,高于37℃和20℃表达量,最终选择25℃为诱导温度。
经过优化,最终选择Rosetta(DE3)为宿主、诱导温度为25℃,TRAIL可溶形式蛋白含量为55%。
2.3 TRAIL纯化及体外活性检测
经过多步纯化后,获得纯度高于95%的TRAIL蛋白质样品。
体外活性检测结果表明,制备的TRAIL蛋白质样品对5种不同来源的癌细胞株增殖均具有显著的抑制作用,抑制率达到70%～92%,并且具有明显的量效关系(图5),对HCT 116、MDA-MB-231、COLO 205和NCI-H460的IC50分别为2.57、7.01、10.20和12.56 ng/mL。
A.1: 蛋白分子量标准; 2～4: 37℃诱导; 2: 全菌总蛋白; 3: 裂解液上清; 4: 裂解液沉淀。B.1: 蛋白分子量标准; 2: 诱导前全菌总蛋白; 3～5: 30℃诱导; 6～8: 25℃诱导; 9～11: 20℃诱导; 3, 6, 9: 全菌总蛋白; 4, 7, 10: 裂解液沉淀; 5, 8, 11: 裂解液上清。
A.1: Protein marker; 2-4: Product induced at 37℃; 2: Total protein; 3: Supernatant of lysate; 4: Pellet of lysate.B.1: Protein marker; 2: Uninduced product of Rosetta (DE3); 3-5: Product induced at 30℃; 6-8: Product induced at 25℃; 9-11: Product induced at 20℃; 3, 6, 9: Total protein; 4, 7, 10: Pellet of lysate; 5, 8, 11: Supernatant of lysate.
3 讨论
在我国,恶性肿瘤死亡率位居所有疾病之首,且近几年人口老年化加剧、生活节奏加快和环境污染等因素,导致癌症发病率快速增加。而TRAIL前期研究结果表明[10,11],有望提供一种新的癌症治疗方式,开发成新型癌症治疗药物。
目前,多家国内、外制药企业进行TRAIL开发,但重组表达TRAIL形式多为包涵体或融合[4,6,7,8],所以存在着收率低、成本高等诸多问题,不利于大规模工业生产。本研究成功将TRAIL在大肠杆菌中表达,进一步对宿主和诱导温度优化,使最终可溶形式表达的TRAIL达到总表达量的55%,整体工艺比文献报道简单[12]。经过较简单的纯化后,获得纯度大于95%的蛋白质纯品,体外细胞活性检测结果表明,获得TRAIL样品对5种不同来源的癌细胞增殖均具有显著的抑制作用,抑制率达到72～90%,与国外报道一致[13,14],证明获得的TRAIL样品具有良好的抑制多种肿瘤细胞增殖活性。
总之,利用本研究策略,TRAIL在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,简化了发酵和纯化工艺,且纯化获得的样品具有良好的生物学活性,为其开发为抗肿瘤药物奠定了良好的基础。
摘要：目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)高表达工程菌株,以获得具有生物学活性的重组TRAIL蛋白。方法:合成TRAIL基因,转到大肠杆菌中,IPTG诱导获得成功表达;进一步优化,增加可溶形式的蛋白质。利用硫酸铵对发酵液进行沉淀,经Ni柱、阴离子和阳离子交换柱层析,最终获得蛋白质纯品,对其进行体外活性检测。结果:经过IPTG诱导后,TRAIL达到菌体总蛋白的30%;经过优化,可溶形式蛋白达到55%。纯化获得纯度高于95%的TRAIL样品,体外测活结果表明:TRAIL蛋白能有效抑制多种肿瘤细胞增殖,抑制率达到70%～92%。结论:重组TRAIL以可溶形式得到高效表达,且具有较好的生物学活性,为其开发成药用蛋白奠定基础。
诱导表达 第9篇
近年来, 随着养猪业的发展, PRRSV给世界各国养猪业造成了重大的经济损失。有文献报道, 在1991年, 荷兰中央兽医研究所首次用猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 分离培养获得病原猪繁殖与呼吸综合征病毒, 并定名为Lelysted病毒 (LV) [2]。随后美国研究者利用他们已建立的细胞系分离到的病毒取得了类似的结果, 他们称该病毒为VR-2332。将各种不同病毒株统称为猪繁殖与呼吸综合征病毒, 根据感染时引起猪的严重程度, 国际兽疫局OIE将该病定为乙类传染病。因此对猪繁殖与呼吸综合征病的研究具有重要的意义, 目前, 已引起世界各国的广泛关注。
我国正处于养猪业蓬勃发展的时代, 猪繁殖与呼吸综合征流行面积逐步扩大和蔓延使我国养猪业处于非常严峻的形势。如何使用有效、实用的手段对本病进行及时检测, 进而采取相应措施进行防制是本病研究的重点之一。因此, 本研究通过对PRRSV的N蛋白进行重组表达载体的构建研究, 为进一步建立分子生物学诊断方法奠定基础。
1材料与方法
1.1主要试验材料及仪器设备
胶回收试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限公司;Axyprep质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术 (杭州) 有限公司;琼脂糖凝胶;0.5μg/m L EB;TGL-16M台式高速冷冻离心机;DYY-12型电泳仪;紫外凝胶成像系统;凝胶加样缓冲液 (6×) 、琼脂糖1.5 mol/L, Tris HCl, p H8.8、20.5mol/L Tris-HCl, p H6.8、10%SDS、30%Acrylamide (30%) 、PRRSV orf7基因片段、感受态细胞trans5α、大肠杆菌BL21 (DE3) 等均由中国农业科学院兰州兽研所提供。
1.2试验方法
1.2.1构建重组表达载体
1.2.2摇菌 用接种环蘸取含有目的基因的细菌穿刺液, 在LB培养基中37℃, 摇床220 rpm/min摇菌12 h取菌液备用。
1.2.3质粒p UC-57-PRRSV N gene的提取 按照Axyprep质粒DNA小量试剂盒操作步骤进行操作。
1.2.4酶切 (Nco I HindⅢ) 构建100μL酶切体系, 按如下剂量加样, 体系如下:
将整个体系置于水浴中37℃, 4 h, 酶切完成后酶切产物进行琼脂糖电泳检测。电泳完毕, 取出凝胶模具, 于紫外灯下观察酶切结果, 照相。电泳鉴定结果见图1。
(注:1、2、3样品为酶切后的PRRSV N基因片段, M:DN A Maker2000)
1.2.5目的片段回收 目的片段回收按照胶回收试剂盒说明书步骤要求进行。纯化完成后, 取3 u L进行电泳鉴定, 拍照。 (纯化结果见图2)
(注:M:DN A Maker2000, 样品1为纯化后的PR R SV N基因片段)
1.2.6酶切目的载体p ET-28a 用双酶切体系, 酶切目的载体, 之后将回收的目的片段与载体p ET-28a置于16℃水浴中过夜。
2结果
通过电泳检测成功得到目的基因片段长度约400 bp左右, 大小与预期相符。目的片段经纯化后成功获得大小约为400 bp的片段。酶切后对载体进行电泳鉴定, 为所需载体 (见图3) 。通过重组质粒, 最终成功构建了猪蓝耳病N蛋白重组表达载体 (见图4) 。
(注:1、2、3为酶切后载体电泳鉴定结果, 4:阴性对照, M:DN A Maker12 000)
3讨论
近几年来由猪繁殖与呼吸综合征引起的猪的传染病给我国养殖业造成了巨大的经济损失。N蛋白分子量大小为15KD, 为非糖基化蛋白, 保守性好在病毒中的含量较高, 经过多年研究发现该蛋白有极高的免疫原性。PRRSV具有不同的致病力、抗原性及相关生物学特性, 变异性较高, 本实验选用载体PET-28a和表达大肠杆菌实现N蛋白的高效可溶性表达, 为今后在此基础上进行的ELISA实验、动物实验以及血清学诊断方法的研究提供了前提条件。
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诱导表达 第10篇
1 材料与方法
1.1 实验动物:
WISTAR大鼠24只, (由鲁抗动物中心提供) , 雌雄不拘, 体质量200 g左右。模型组和对照组:每只大鼠L2~3、L3~4、L4~5椎间盘为模型组, L1~2和L5~6椎间盘作为对照组。试剂:HIF-1α兔抗鼠单克隆抗体 (北京中杉生物技术有限公司) , SABC免疫组化染色试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法:
从大鼠的前外侧入路开始, 手术分离肌肉筋膜等, 露出椎间盘视野, 将16号针头刺破椎间盘纤维环, 针头穿刺的深度为5 mm, 针头停留的时间在5 s左右, 使椎间盘纤维环受到损伤而不使髓核损伤, 让损伤随着时间进行缓慢的退行性变化。第12周时, 分别处死各组大鼠, 制备椎间盘切片, 免疫组织化学法测定HIF-1α的表达。病理彩色图像分析软件测量HIF-1α平均光密度值 (平均光密度及阳性细胞比例) , 进行统计学分析。
1.3 统计学处理:
采用SPSS18.0进行统计分析, 实验数据以均数±标准差表示, 两组间比较用t检验, 以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 普通光学显微镜观察。
对照组:软骨表面光滑, 软骨细胞排列规则, 层次清楚, 潮线完整;基质染色均匀。模型组:软骨表面裂隙明显, 局部有缺损, 软骨细胞排列紊乱, 软骨细胞减少, 并见有灶性溶解、坏死, 潮线多数消失, 血管自软骨下骨长入软骨钙化层。
2.2 HIF-1α表达结果:
椎间盘标本HIF-1α免疫组化的表达结果显示, HIF-1α分子主要分布在细胞膜和胞质, 血管内皮细胞和周围的区域HIF-1α表达增加。病理学和统计学结果见表1。模型组表达高于对照组, 差异具有显著性 (P<0.05) 。
3 讨论
人类最早退变的组织是椎间盘组织, 正常的椎间盘是无血管组织, 养分供应主要是通过两个途径:第一个是终板途径, 即营养血管经椎体骨髓血窦腔软骨终板界面扩散到椎间盘髓核与椎间盘纤维环, 是主要的营养途径;第二个是纤维环途径, 纤维环外表面滋养血管纤维[2]。在身体的生长发育和衰老过程中, 椎间盘细胞和基质改变, 中央部分主要是椎间盘髓核细胞的营养成分供应下降, 由于髓核细胞的营养供应不足而导致的营养不良性钙化是椎间盘退行性病变发生的主要因素[3]。椎间盘基质生成减少的幅度与范围与椎间盘发生的退行性病变的严重性具有因果联系。有研究已经证明椎间盘基质生成的减少主要与细胞因子和酶激有关, 其激活椎间盘相关的细胞因子和酶, 并促进相关因子和酶的释放, 充分其发挥在椎间盘退变中的重要作用[4]。
有研究已经证实:HIF-1α对维持内环境稳定起到非常重要的作用, 它对于维持正常氧浓度和低氧浓度条件下的能量的产生以及软骨基质的生产, 对维持关节软骨细胞的生存起着重要的作用[5]。最近有研究表明腰椎间盘突出症患者关节软骨中存在缺氧诱导因子-1α的表达, 缺氧诱导因子-1α在与腰椎间盘突出症的人类椎间盘细胞的重吸收与椎间盘细胞的生存方面可能发挥关键作用[6]。
摘要：目的 研究在大鼠退变椎间盘中缺氧诱导因子-1 (HIF-1α) 表达及意义。方法 建立大鼠椎间盘退变动物模型, 根据不同的时间点获得椎间盘标本, 腰段手术干预椎间盘为模型组, 无手术干预腰椎间盘为对照组。用免疫组化染色方法对模型组与对照组的椎间盘组织中HIF-1α的阳性表达进行定性、定位阳性检测, 结果 模型组免疫组化染色观察结果:第4周在椎间盘免疫组化切片中可以看到一些细胞具有HIF-1α表达, 单因子表达细胞较少, 细胞周围基质中可见散在阳性表达;第8周至第12周的模型组免疫组化染色切片中HIF-1α表达在逐渐增加。结论 HIF-1α表达增加和椎间盘退变的加剧呈正相关联系。
关键词：缺氧诱导因子-1α,椎间盘,退行性病变
参考文献
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