近期研究表明动脉粥样硬化的钙化具有骨钙化的特征[1], 骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 作为转化生长因子β细胞因子超家族成员中的一员, 在骨形成和骨愈合过程中是不可缺少的细胞因子。在人动脉粥样硬化的钙化斑块中发现有BMP-2的mRNA的表达, 所以进一步推测BMP-2与人动脉粥样硬化的发生和发展密切相关[2,3]。
RAS系统及其主要活性物质血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 在动脉粥样硬化发生发展中居于核心地位, 起着关键性作用。但其与BMP-2的关系的研究却鲜有报道, 本研究通过体外细胞培养用AngⅡ刺激细胞同时用其拮抗剂厄贝沙坦干预来研究BMP-2表达的影响, 并用免疫组织化学法来测定NFkb-P65的表达, 初步探讨其可能机制。
注:与对照组 (0μmol/L AngⅡ) 相比, *P<0.01;与厄贝沙坦干预组比较, △P<0.01
1 对象与方法
1.1 实验对象
人脐静脉内皮细胞株。
1.2 实验方法
HUVECs的体外培养 (方法略) , 选择3～4代HUVECs进行转板长满后随机分为5组给予不同浓度的AngⅡ、厄贝沙坦, 干预48h后观察对BMP-2的表达的影响, 具体如下:药物终浓度分别为:AngⅡ0.5μmol/L, 10μmol/L, 20μmol/L, AngⅡ20μmol/L+5μmol厄贝沙坦, 干预48h用ELISIA法检测细胞上清液中BMP-2的水平, 并且用免疫组织化学测定NFkb-P65亚基的核转移。
1.3 图象分析
采用病理图文分析系统对切片进行分析。
注:与对照组 (0μmol/L AngⅡ) 相比, *P<0.01;与厄贝沙坦干预组比较, △P<0.01
1.4 统计学处理
采用SPSS 14.0统计软件分析。所有资料均采用均数±标准差 (x-±s) 表示, 进行正态分布性检验, P<0.05为有显著性差异, P<0.01为有非常显著性差异。
2 结果
2.1 不同浓度的AngⅡ对HUVECs的BMP-2表达的影响
随着AngⅡ浓度的升高, 细胞培养基上清液中的BMP-2浓度明显增高 (P<0.01) , 且有一定的浓度的依赖性, 线性相关分析是正相关关系, r=0.98 (P<0.05) ;而给予厄贝沙坦联合刺激细胞培养基上清液中的BMP-2浓度明显降低 (P<0.01) , 具体见表1。
2.2 细胞免疫组织化学检测HUVECs的NF-kB的表达量
细胞免疫组化结果, NF-kB在未被激活时在胞浆有所表达, 受到刺激激活后可见到胞核表达。本研究发现:HUVECs在一定AngⅡ浓度刺激下, 可以见到NF-KbP65的激活, 表达增加。而在厄贝沙坦干预后, NF-KbP65表达的阳性减弱。病理图文分析结果如表2:AngⅡ刺激后平均吸光度和阳性面积百分比均增加, 厄贝沙坦干预后明显下降, 有统计学差异 (P<0.01) 。
3 讨论
动脉钙化是动脉粥样硬化的病理改变之一, 而BMP-2作为β细胞因子超家族中的一员, 与动脉钙化关系最为密切, 其在血管表达可能与氧化应激, 炎症及高血糖等代谢紊乱有关[4,5]。
AngⅡ在动脉粥样硬化发生发展中起着关键性的作用, 而这些作用可被其受体拮抗剂 (ARB) 药物阻断, 血管钙化一般发生于有动脉粥样硬化的病变处, 被作为动脉粥样硬化的标志, 应用于预测动脉粥样硬化程度, 但二者的发生又有不同的机制。尽管AngⅡ在AS中的研究深入透彻, 但与血管钙化的关系如何, 相关研究甚少。Cs is za r A[6]发现:TNF-α可诱导NF-кB激活并引起BMP-2mRNA及BMP-2蛋白表达显著增加, 认为炎性刺激以及血管内高压力可引起H2O2介导的NF-kB激活, 从而调节血管BMP-2表达。而AngⅡ被认为是致动脉硬化因子, 推测其可能对BMP-2有调节作用, 对此, 我们做了初步的探讨。
血管内皮细胞是动脉粥样硬化病理改变的基本单元, 所以本实验选择内皮细胞作为研究对象, 并发现:一定浓度的AngⅡ可以增加细胞培养液中BMP-2的浓度, 说明AngⅡ的刺激可以增加BMP-2的表达。本研究细胞免疫组化结果显示:在AngⅡ诱导BMP-2表达增加的同时, 一定浓度的AngⅡ刺激, 可使NFkb-P65在细胞核内表达明显增加, 提示BMP-2表达与NF-kB的激活有关, AngⅡ刺激内皮细胞BMP-2表达的机制可能是通过NF-kB途径来实现的。
本研究同时用ARB药厄贝沙坦干预, 发现厄贝沙坦可以下调BMP-2的表达, 相应抑制NFKb-P65在胞核的表达, 提示厄贝沙坦有可能是通过对抗氧化应激损伤, 抑制NF-Kb通路的激活, 而最终实现下调BMP-2的表达, 提示厄贝沙坦具有潜在的阻止血管钙化进展的可能, 这也许提示厄贝沙坦不仅可以治疗高血压, 抗动脉粥样硬化作用, 而且可能具有预防血管钙化的作用。
4 结语
AngⅡ可以增加脐静脉内皮细胞BMP-2表达, 并呈浓度依赖性, 可能与损伤脐静脉内皮细胞, 使氧化应激水平增加, 而激活NFkb-p65有关。
厄贝沙坦干预能阻断AngⅡ诱导的的脐静脉内皮细胞BMP-2的表达, 其机制可能是通过抑制NFkb通路来实现。
摘要：目的 研究AngⅡ对人脐静脉内皮细胞表达BMP-2的影响, 初步探讨AngⅡ对BMP-2表达影响的可能机制。方法 培养人脐静脉内皮细胞, 测定不同条件下细胞培养上清液中BMP-2的浓度。用免疫组化法检测各实验组细胞内NFkb-P65的表达。结果 (1) 不同浓度AngⅡ刺激使人脐静脉内皮细胞培养上清液中的BMP-2水平呈剂量依赖性增加, (2) 细胞免疫组化结果显示, AngⅡ在增加BMP-2表达的同时, NFkb-P65表达也相应增强, 厄贝沙坦干预使AngⅡ诱导的NFkb-P65的表达水平下降。结论 (1) AngⅡ可以剂量依赖性刺激人脐静脉内皮细胞BMP-2的表达, 而厄贝沙坦可抑制AngⅡ诱导的脐静脉内皮细胞BMP-2的表达。 (2) AngⅡ诱导BMP-2表达的机制可能是通过NF-kB途径来实现的。
关键词：AngⅡ,厄贝沙坦,脐静脉内皮细胞,BMP-2,NFKb-P65
参考文献
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[5] Parhami F, Bostrom K, Watson K, et al.Role of molecular regula-tion in vascular calcification[J].J Atheroscler Thromb, 1996, 3 (2) :90～94.
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