第一篇：单克隆抗体的动物免疫
《动物细胞融合与单克隆抗体》教案设
计
一、教材的地位和作用
《动物细胞融合与单克隆抗体》是人教版普通高中程标准实验教科书生物选修3专题二第2节动物细胞工程中第2小节的内容，由于细胞工程是建立在细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，动物细胞融合又是细胞工程中基本技术之一，所以第2小节教学内容是在高中必修教材基础上的深入和扩展，也是第1小节动物细胞培养教学后的必然及延伸，是安排在学习了免疫、遗传与基因工程的基础上来进行教学的，学生既有一定的知识基础，又能为后面的微生物与发酵工程的教学奠定基础，尤其是为微生物的选种教学打下基础。同时，生物技术中各个分支领域相互渗透、相互促进，细胞融合技术也不例外，它在现代生物技术中具有一定的理论意义和经济意义。
二、学情分析
学生是在学习了《植物细胞工程》和《动物细胞培养和核移植技术》的基础上学习本节的，所以对于动物细胞融合这一部分应该能较轻松的理解，但是单克隆抗体的制备较复杂学生理解起来会有一定的难度，教师应详细介绍。
三、教学目标
根据新标要求和本节的具体内容，结合学生现有的知识水平，拟定下列教学目标。
、知识目标
(1)掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。
(2)简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。
(3)了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。
2、能力目标
(1)由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。
(2)让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。
(3)分析动物细胞融合技术的意义和应用，逐步提高学生独立获取知识、分析问题和解决问题的能力。
3、情感目标
(1)初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
(2)通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
(3)关注动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展和应用前景。
四、教学重难点
、重点
(1)动物细胞融合技术。
(2)单克隆抗体的制备过程。
2、难点
单克隆抗体的制备过程。
五、教学实施程序
教师组织和引导
学生活动
设计意图
创设情境，导入新
、多媒体播放科幻电影中相关桥段，并展示人-鼠细胞杂交的图片，激发学生的学习欲望，导出本节的题。
2、进行学习目标的解读。
、观看电影片段和人-鼠细胞杂交的图片，回忆所学知识。
2、熟悉本节所学内容，把握难点内容。
1、回顾人-鼠细胞杂交试验，让学生对动物细胞融合技术有初步的认识。
2、教学做到有的放矢。
自主学习，知识梳理
、多媒体展示相关问题，组织学生进行解答。
2、根据学生的回答了解学生的预习情况。
、通过前预习并进行知识梳理，组内讨论，形成统一认知。
2、小组进行展示。
培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。
合作探究，班内交流
、多媒体展现合作探究内容，引导学生进行相互交流，并进行小组展示。
1、并合作交流，并确定学习难点内容。
培养学生合作精神。
点拨精讲，解难释疑
单克隆抗体制备的过程：
通过多媒体展示单克隆抗体的设计思路及制备过程，同时提出问题，学生讨论。
(教师讲解为主)
合作探究以下问题：
、如何获得B淋巴细胞?
2、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式(类型)?
3、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么?
4、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养?
本部分知识较难，但学生通过预习能简单的分析出一部分，通过讨论使知识完整培养学生全面思考问题的能力
随堂练习，当堂反馈
多媒体展示相关习题
读题，思考与讨论，并进行解答
、巩固学生对实验分析解读能力。
2、通过对学生练习结果的评价，了解学生对知识的掌握情况，以便确定下一步的补偿性学习的安排。
归纳总结，科评价
、多媒体展示“三个重要过程”“三个一”，帮助学生记忆和理解。
2、对学生的堂表现进行评价。
观看多媒体展示内容，对所学内容有一个概括性的总结。
科学评价有利于小组内学生之间的相互团结，培养学生团队合作的意识
七、板书设计
222动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞的融合
二、单克隆抗体*
、概念：
、抗体11概念:Ig
2：B细胞
2、方法：
2、概念：杂交瘤细胞、高度单
一、抗体
3、过程
3、制备过程(杂交瘤制备技术)
4、意义：制备单克隆抗体
4、应用：“生物导弹”
八、教学反思
第二篇：动物细胞融合与单克隆抗体教学案1
学习目标：
1、 举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。
学习重点:
1、单克隆抗体的制备和应用。
2、单克隆抗体的制备过程。
一、自主学习(阅读课本52页完成相关内容)
翻翻课本，动手填填，基础知识的梳理与强化，永远是学习的第一生命!
1、 动物细胞的融合
(1)概念：指 或 动物细胞结合形成一个细胞的过程，也称为细胞杂交。 (2)结果：形成 细胞。
(3)过程：不同 的两个细胞 细胞。
(4)意义：克服了 杂交的不亲和性，成为研究 、 、 肿瘤和生物 培育的重要手段。
2、 单克隆抗体
(1) 抗体：由淋巴细胞(浆细胞)产生，成分为球蛋白，具有 。从血清中分离出来的抗体产量低、纯度低、特异性差。 (2) 单克隆抗体的制备 a. 过程
b.杂交瘤细胞的特点：既能大量 ，又能产生 。 c.单克隆抗体的特点： 强、 高、产量大。 细品老师对知识的释疑、及时完成对应练习，对知识的深化理解、灵活运用，是学习的本质与灵魂。
二、小组讨论。(独立思考，合作共赢)
1、动物细胞的融合最有价值的应用是什么?细胞融合完成的标志是什么?
单克隆抗体
1、单克隆抗体?单：单个细胞? 。
提醒：①若a和b两种细胞融合，则融合的方式有三种 、 和
。满足要求的为 ，所以融合后要筛选。
克隆：无性繁殖抗体：抗原→B细胞→抗体特异性结合②动物细胞特有的诱导融合方式为灭火的病毒处理，其他的物理和化学方法在植物和动物细胞融合方面是通用的。
3、 单克隆抗体的确切定义是什么?
4、 制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞?在融合的过程中你可以找出几种类型的细胞?
5、 制备单克隆抗体的过程有两次筛选，两次筛选的目的是什么?
第一次筛选是
第二次筛选是 流畅的思维方法，规范的解题步骤，准确无误的答案，是获取高分的法宝。
三、同步训练
1、单克隆抗体是指 A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B.单个淋巴细胞增殖产生的抗体 C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体D.单个抗体通过克隆，产生大量抗体
2、细胞合成DNA有D和S两种途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞由这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。骨髓瘤细胞尽管没有S途径，但能不断的分裂增殖，将这两种细胞在试管的培养液中混合，加聚乙二醇促融，再加入氨基嘌呤可筛选出某种细胞。在培养液中存在的细胞种类及筛选出的细胞分别是(细胞融合是仅考虑两个细胞的融合) A.三种 杂交瘤细胞 B.五种 骨髓瘤细胞 C.五种 杂交瘤细胞 D.一种 杂交瘤细胞
3.(多选)将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是
A.B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖B.淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体
C.骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体D.骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能无限增殖
4.下列用动物工程技术获取单克隆抗体的实验步骤中，不正确的是
A.将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞
B.用蛋白酶处理B淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞
C.用灭活的仙台病毒做诱导剂，促使B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合
D.筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体
5、结合单克隆抗体制备的流程回答下列问题。
① 技术是单克隆抗体技术的基础。 ②单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是
③动物细胞的融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用
④选出的杂交瘤细胞即具备骨髓瘤细胞 的特点，又具备淋巴细胞的 的特点。
⑤淋巴细胞是由骨髓中的 细胞分化发育而来。 ⑥杂交瘤细胞从培养基吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是
第三篇：选修3 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体教学案例
2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体简洁教案
柴欢欢
一、 教学目标
1. 知识目标
(1) 掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别与联系。 (2) 简述动物细胞融合与单克隆抗体制备的过程。
(3) 了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说出应用的实例。 2. 能力目标
(1) 通过对植物体细胞杂交过程的学习和类比，帮助理解动物细胞融合的过程，培养学生的知识迁移能力。
(2) 通过对单克隆抗体的制备过程的分析，培养学生联系和想像的能力。 (3) 通过小组讨论，培养学生的合作精神。 3. 情感态度价值观目标
(1) 认同细胞工程技术已取得了突飞猛进的发展，前景非常广阔。 (2) 认同联系和想像能力在科学研究和创新中的重要作用。
二、 教学重难点
1. 教学重点
(1) 动物细胞融合的原理和过程。 (2) 单克隆抗体制备的原理和过程。 2. 教学难点
(1)单克隆抗体制备的原理和过程。
三、 计划课时
1课时
四、 教学过程
1. 引入新课
(1) 出示“人——鼠杂交细胞”并提问引入新课。 2. 温故知新
(2) 回顾植物体细胞杂交过程类比学习动物细胞融合
a. 回顾植物体细胞杂交过程。 b. 比较动植物细胞结构上不同。
3. 动物细胞融合
c. 学生阅读课本52页图2-23和生物技术资料卡，以问题串引导学生理解动植物细胞杂交的原理、方法、促融手段、用途和意义。 d. 通过c过程让学生自己总结“动物细胞融合的概念”和动植物细胞杂交的区别和联系。
4. 单克隆抗体
e. 通过问题串，引导学生找到产生抗体的细胞。
f. 学生阅读课本52-53页找到传统生产抗体的不足，并在教师帮助下理清B细胞与抗体之间的关系。
g. 教师引导学生思考：我们已经找到能产生单一抗体的细胞，要使该细胞能无限繁殖并产生单一抗体。运用我们刚学过的动物细胞融合知识应该与什么细胞杂交?学生很容易想到用瘤细胞与能产生单一抗体的B细胞杂交。
h. 顺利过渡到单克隆抗体的制备过程的教学，并引导学生解决制备过程中的疑难问题。 i. 简介单克隆抗体的应用。
五.课堂巩固练习
六.板书设计
动物细胞融合与单克隆抗体
一、 动物细胞融合
1. 2. 3. 4.
概念
融合过程和结果
意义：突破有性杂交局限，使远缘杂交成为可能。 应用：主要用于制备单克隆抗体。
二、 单克隆抗体
1. 概念 2. 过程 3. 应用
七.课后巩固作业
课本55页，“思考与探究”
基础题：第1题 提高题：第2题
第四篇：单克隆抗体的制备
摘 要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。
关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞
现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。
1.国外现代生物技术产业发展的现状
自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术(包括近代生物技术)已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用;现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
2.我国现代生物技术医药产业发展的现状
现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿(包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内)。
目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。
3. 单克隆抗体
3.1单克隆抗体的概念
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
3.1单克隆抗体的主要特点
1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同;
2)由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性; 3)产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。
3. 2单克隆抗体的应用
作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。
作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。
作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。
作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： (1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。 (3)检测淋巴细胞表面标志 用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义.
4实验方法
4.1材料
a.盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克， NaH2P04·H
2O0.69克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。
标准培养液;RPMI1640，DMEM或者Iscove‘s培养液，加入10%灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2%100×谷酰胺，1%100×丙酮酸钠，1%100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位/m1)，0.05%0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。 选择性培养液：即所谓HAT培养液，
100× HAT培养液，
100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。 100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM.必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。
I00×T;Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。 然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。
HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1%加入营养液即成。
细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。 b、骨髓瘤细胞株
BALB/c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63) 和其衍生株SP—2/0，SP—2/0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10%CO
2、7%O2和83%N2，37℃恒温培养。
4.2 方法
a、小鼠免疫
成年BALB/c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。
在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。 b、腹腔内巨噬细胞的采取
把成年BALB/c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(=11.6%)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。 c、大孔培养
24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95%。
换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。
如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。 d、微量培养法 平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。
5.结论
通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。
(1).各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。
(2).巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。
(3).加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于10的阳性孔。
(4).用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长
(5).限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。
(6).骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株(x63)，产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。
(7).融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。
(8).细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。
(9).各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。
(10).不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。
(11). 在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。
4(12). 在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。
参考文献
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第五篇：单克隆抗体生产的杂交瘤技术
Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies (mAbs) 单克隆抗体生成的杂交瘤技术 Abstract 1 Introduction 2 Materials
2.1 Preparation of splenocytes 2.1 脾细胞制备
1 spleens from immunized mice 免疫小鼠的脾脏
2 RPMI-1640 medium(Serum-free cell freezing medium)无血清细胞冻存培养基 无血清细胞冻存培养基 3 Petri dishes 有盖培养皿
4 Sterile surgical instruments,including microdissecting scissors and forceps,for collecting animal samples 用于收集动物样品的无菌手术器械，包括显微解剖剪和钳子， 5 sterile microscope glass slide with frosted ends 磨砂的的无菌显微玻片 6 15-ml conical tubes 15-ml 锥形瓶
2.2 Preparation of myeloma cells as the fusion partner 作为融合头(融合标签)的骨髓瘤细胞的制备 2.3 cell fusion 细胞融合
2.4 hybridoma screening by FACS 2.5 hybridoma screening by ELISA 通过ELISA进行杂交瘤筛选 2.6 hybridoma screening by IHC 2.7 hybridoma subcloning 2.8 hybridoma cryopreservation 低温保存杂交瘤细胞 2.9 antibody isotyping 抗体同型
2.10 thawing and growth of hybridoma cells 杂交瘤细胞的融化和生长
3 methods 3.1 preparation of splenocytes from the immunized mouse 来自免疫鼠的脾细胞的制备 3.2 preparation of myeloma cells 骨髓瘤细胞的制备 3.3 cell fusion 细胞融合
3.4 hybridoma screening using flow cytometry 通过流式细胞仪进行杂交瘤筛选 3.5 hybridoma screening by ELISA 通过ELISA进行杂交瘤筛选 3.6 hybridoma screening by IHC 通过免疫组化进行杂交瘤筛选 3.7 hybridoma subcloning 杂交瘤亚克隆
3.8 hybridoma cryopreservation 杂交瘤低温保存 3.9 antibody isotyping 抗体同型
3.10 Thawing and growth of hybridoma cells 杂交瘤细胞的融化和生长 4 小记 参考文献