论文题目：BSR1526和BSR1955在布鲁氏菌毒力中的作用及布鲁氏菌病的防控研究
摘要：布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）是一种人兽共患传染病,在世界多个国家和地区广泛流行,给人类健康及畜牧业发展造成严重影响。人主要通过与患病家畜及其产品的密切接触而感染。通常通过刀伤、擦伤、口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道,甚至未损伤的皮肤而感染。随着我国畜牧业的快速发展及动物布鲁氏菌病新发病例数的剧增,加大了人感染布鲁氏菌病的风险。布鲁氏菌病迄今仍是国际、国内广受关注的世界性公共卫生问题,主要原因是对布鲁氏菌致病机制的研究仍不够透彻,针对性的防控措施尚不能完全满足当前防疫的实际需要。布鲁氏菌是公认的细胞内寄生菌,是胞内细菌感染研究的重要模式菌。大量研究表明,布鲁氏菌胞内生存是致病的关键环节,对于胞内生存过程中的适应力研究,有助于了解其致病机制。布鲁氏菌可引起天然宿主网状内皮系统持续性感染,当前对该病防控的主要措施还是对动物的普查和淘汰。本文侧重探索了 2种布鲁氏菌sRNA对其胞内生存和毒力的作用,调查了局部地区疫病防控状况,评估了羊布鲁氏菌病的临床监测与净化效果,以期为布病的有效防控提供参考。1.非编码sRNA BSR1526对布鲁氏菌适应胞内生存和毒力的作用根据16MRNA的特异性单链测序,预测出1个新的sRNA,即BSR1526。采用Northern blot验证了 sRNABSR1526在布鲁氏菌中存在转录。在不同培养条件下,用RT-PCR检测sRNABSR1526的转录水平,结果发现总RNA中BSR1526存在转录,且在酸性刺激条件下的转录水平较高。采用融合PCR构建并用RT-PCR验证16M-ΔBSR1526（BSR1526缺失株）,利用多拷贝质粒pBBRl-MCS获得过表达载体MCS4-BSR1526,电转入16M感受态细胞,构建过表达株16M-BSR1526;比较BSR1526缺失株和过表达株。结果表明,BSR1526不仅对布鲁氏菌的生长能力有影响,也对胞内环境适应力有影响。BSR1526缺失可使布鲁氏菌抵抗热应激能力、抗氧化能力和在酸性环境下的生长能力明显下降。毒力试验表明,16M-ΔBSR1526在接种后14 d小鼠脾脏内布鲁氏菌量明显下降,说明BSR1526与布鲁氏菌毒力有一定的关系。综上所述,布鲁氏菌中的sRNABSR1526对其在胞内生存和毒力均有重要作用。2.非编码sRNA BSR1955在布鲁氏菌适应胞内生存和毒力上的作用根据16MRNA的特异性单链测序,预测出1个新的sRNA,即BSR1955。在不同培养条件下,用RT-PCR检测sRNABSR1955的转录水平,结果发现在营养缺乏、低pH值以及高氧化压力下,BSR1955转录水平均有增加。采用融合PCR构建并用RT-PCR验证BSR1955缺失株。利用多拷贝质粒pBBRl-MCS获得过表达载体MCS4-BSR1955,电转入16M感受态细胞构建过表达株16M-BSR1955。对BSR1955缺失株（16M-ΔBSR1955）和过表达株16M-BSR1955表型进行研究。结果表明,BSR1955的缺失会减慢布鲁氏菌的生长速度;16M-ΔBSR1955和16M-BSR1955在不同环境压力条件下的存活率研究表明,BSR1955缺失能提高布鲁氏菌对高盐、高渗环境的适应能力。毒力试验表明,缺失BSR1955后布鲁氏菌使第28和45 d小鼠脾脏内载菌量显著增加。综上所述,sRNABSR1955可影响布鲁氏菌的胞内生存能力;缺失BSR1955后布鲁氏菌抵抗高盐、高渗环境的能力提高,同时在小鼠体内的毒力增强。3.川北某地区布鲁氏菌病防控现状调查对兽医防疫队伍建设的调查发现,基层兽医专业技术人员欠缺,学历结构总体合理,但部分县区低学历职工占比较大;75.54%基层兽医站工作人员都是兽医相关专业毕业,构成了该地区的兽医队伍基础。从职称结构来看,该地区基层兽医队伍以初级和中级职称为主,且初级职称的人员数量最多。目前该地区基层兽医站工作人员中,取得执业兽医资格证人数仅占总人数的1.05%,不利于执业兽医师制度的推进。从年龄结构来看,该地区基层兽医站工作人员中,30.36%为50岁以上职工,后备专业人才的储备相对不足。对村级动物防疫员的调查发现,全市的村防员还未能满足1村1位村防员的防疫要求。且年龄上以50-60岁村防员人数最多（56.90%）;60岁以上村防员人数仍占8.24%,老龄化问题十分突出。从该地区专业技术知识测试的结果看,县（区）级部门的兽医人员基本掌握了布鲁氏菌病防控的专业知识;乡镇兽医技术人员不合格人数占19.75%;村级兽医防疫员中,不合格比例达到40.12%,不利于布鲁氏菌病的总体防控。从近几年的监测统计来看,2013年以前,以市级实验室监测为主。2014年,该地区才开始大面积监测工作。2015年第4季度该地区监测的样品总数仅占到全市存栏羊只数量的1.77%,总体检测样品数偏低。各级政府对畜间布鲁氏菌病防控净化工作重视程度不够,对布鲁氏菌病相关知识的宣传力度不够。活畜调运十分频繁,不重视调运过程中的卫生和防疫,开展布鲁氏菌病检疫的工作难度大,监管力度跟不上产业的发展速度。顶层设计不够,阳性病畜处置难度大,兽医实验室专业技术人员缺乏,不能满足全市监测需要。4.川北某地区羊布鲁氏菌病临床净化试点与效果分析根据该地区的总体情况,制定综合的监测净化措施,选择1个区进行羊布鲁氏菌病监测净化试点。从血清学监测结果看,布鲁氏菌病感染羊的基数大。普查检测1181份血清样品中,共检测出布鲁氏菌病抗体阳性血清55份,总体阳性率为4.66%。监测净化过程中,布鲁氏菌病血清学阳性数量逐渐减少。从监测净化的血清学检测结果来看,第一阶段监测中,检测出阳性463份,布鲁氏菌病总体阳性率达34.48%,显著高于普查监测中的4.66%。对阳性场（户）的羊进行无害化处理后,阳性率逐渐降低,依次降至第二阶段的9.53%,第三阶段的2.78%,第四阶段的1.75%以及监测净化最后阶段的0.78%。从阳性率来看,监测净化后布鲁氏菌病血清学阳性羊只数量呈明显下降的趋势。监测净化总体效果明显,复检阳性率显著降低,总体阳性率为0.91%。从横向来比较,2016年8月该地区布鲁氏菌病监测的结果中,平均水平为4.12%,监测净化后的布鲁氏菌病血清学阳性率有了显著降低。
关键词：布鲁氏菌;布鲁氏菌病;非编码RNA;胞内生存;监测;净化
学科专业：兽医博士（专业学位）
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 文献综述
第一章 布氏菌病研究现状
1 布鲁氏菌病研究简史
1.1 国外布鲁氏菌病研究
1.2 我国布鲁氏菌病研究历史
2 布鲁氏菌病的流行情况
2.1 人间疫情
2.2 兽间疫情
3 布鲁氏菌的病原学特征
3.1 布鲁氏菌的分类
3.2 布鲁氏菌的理化特性
3.3 布鲁氏菌的致病机理
4 布鲁氏菌病的诊断技术进展
5 布鲁氏菌病的疫苗研究进展
5.1 传统疫苗
5.2 布鲁氏菌新型疫苗的研究
6 羊布鲁氏菌病
参考文献
第二章 细菌SRNA研究现状与进展
1 细菌sRNA概述
1.1 细菌sRNA分类
1.2 细菌sRNA的功能
2 细菌sRNA的筛选与鉴定方法
3 细菌sRNA靶基因的筛选与鉴定
4 布鲁氏菌sRNA的研究状况
5 本研究目的意义
参考文献
第二部分 试验研究
第三章 非编码SRNA BSR1526对布氏适应胞内生存和毒力的作用
1 材料
1.1 培养基
1.2 菌株及载体
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
1.5 实验动物
1.6 引物
2 方法
2.1 BSR1526的预测
2.2 Northern blot验证BSR1526
2.3 BSR1526靶基因的预测
2.4 不同刺激条件下BSR1526的RT-PCR鉴定
2.5 缺失株16M-ΔBSR1526和过表达株16M-BSR1526的构建
2.6 BSR1526突变株和过表达株的RT-PCR验证
2.7 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526的生长曲线测定
2.8 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526体外应激试验
2.9 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526的小鼠毒力试验
3 结果与分析
3.1 BSR1526的预测
3.2 Northern blot验证
3.3 BSR1526靶基因的预测
3.4 不同刺激条件下BSR1526的RT-PCR鉴定
3.5 BSR1526缺失株和过表达株构建
3.6 16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526的RT-PCR验证
3.7 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526的生长曲线
3.8 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526体外应激试验
3.9 16M、16M-ΔBSR1526和16M-BSR1526的小鼠毒力实验
4 讨论
参考文献
第四章 非编码小RNA BSR1955在布鲁氏菌适应胞内生存和毒力上的作用
1 材料
1.1 培养基
1.2 菌株及载体
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
1.5 实验动物
1.6 引物
2 方法
2.1 BSR1955的筛选和定位
2.2 BSR1955靶基因的预测
2.3 不同刺激条件下BSR1955的RT-PCR鉴定
2.4 缺失突变株16M-△BSR1955的构建
2.5 过表达株16M-BSR1955的构建
2.6 BSR1955突变株和过表达株的RT-PCR验证
2.7 16M、16M-△BSR1955和16M-BSR1955生长曲线测定
2.8 16M、16M-△BSR1955和16M-BSR1955体外应激试验
2.9 16M、16M-△BSR1955和16M-BSR1955的小鼠毒力试验
3 结果
3.1 BSR1955起始位点的定位
3.2 BSR1955靶基因预测
3.3 BSR1955在不同刺激条件下的转录分析
3.4 BSR1955缺失突变株的构建
3.5 BSR1955过表达株的构建与鉴定
3.6 16M-△BSR1955和16M-BSR1955的RT-PCR验证
3.7 16M、16M-ΔBSR1955和16M-BSR1955的生长曲线
3.8 16M、16M-ΔBSR1955和16M-BSR1955体外应激试验
3.9 16M、16M-△BSR1955和16M-BSR1955的小鼠毒力试验
4 讨论
参考文献
第五章 川北某地区布鲁氏菌病防控现状调查
1 调查内容
1.1 兽医队伍情况和对布鲁氏菌病的专业知识了解情况
1.2 布鲁氏菌病宣传教育情况
1.3 布鲁氏菌病监测流调和扑灭情况
1.4 布鲁氏菌病检疫监管状况
1.5 养殖场的常规防控措施落实情况
2 调查方法
2.1 问卷调查
2.2 实地走访
2.3 统计调查
2.4 其他
3 结果与讨论
3.1 基层兽医队伍状况和兽医布鲁氏菌病专业知识掌握情况
3.2 布鲁氏菌病宣传教育情况
3.3 羊布鲁氏菌病检测监测开展情况
3.4 检疫监管及防疫方面的问题
3.5 存在的其他问题
4 防控对策
4.1 提升重视程度,做好全面保障
4.2 加大宣传和科普工作,做好相关人员防护工作
4.3 加强监管和检疫力度
4.4 推行监测净化,实施综合防控措施
4.5 其他防控措施
参考文献
第六章 川北某地区羊布鲁氏蕾病临床净化试点与效果分析
1 试验地点
2 试验时间
3 试验方案
3.1 集中监测
3.2 紧急监测
3.3 净化方案
3.4 动物卫生监管
3.5 再次集中监测和净化
3.6 监测净化措施的效果评估
3.7 其它措施
4 布鲁氏菌病的血清学检测
4.0 试验材料
4.1 血清的采集和处理
4.2 虎红平板凝集试验
4.3 动物布鲁氏菌病试管凝集试验
5 结果
5.1 净化准备阶段
5.2 净化第1阶段
5.3 净化第2阶段
5.4 净化第3阶段
5.5 净化第4阶段
5.6 净化第5阶段
5.7 第6阶段
6 结果分析
6.1 从血清学检测结果看,布鲁氏菌病感染的羊基数大
6.2 监测净化过程中,布鲁氏菌病血清学阳性数量逐渐减少
6.3 监测净化总体效果明显,复检阳性率显著降低
7 讨论
7.1 布鲁氏菌病的监测净化中各种措施需严格执行到位
7.2 布鲁氏菌病实验室检测严谨准确,做好生物安全措施
7.3 监测净化措施需要长时间坚持
参考文献
全文结论
致谢