评职称或毕业的时候，都会遇到论文的烦恼，为此精选了《荆芥挥发油化学成分分析论文(精选3篇)》相关资料，欢迎阅读！[摘要]目的：体内、体外实验观察荆芥挥发油及主要成分薄荷酮、胡薄荷酮的抗甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）作用及其Toll样受体/干扰素（toll-likereceptor/interferon，TLR/IFN）信号通路机制。方法：制备流感病毒性肺炎模型小鼠，以预防和治疗方式给药，测定模型动物肺组织病毒滴度以评价药物体内抗H1N1效应。
荆芥挥发油化学成分分析论文 篇1：
荆芥挥发油对内毒素中毒模型小鼠的保护作用
[摘要] 觀察荊芥挥发油对内毒素（LPS）中毒模型小鼠的保护作用，并采用GC-MS对荆芥挥发油进行化学成分测定。雄性C57BL/6J小鼠按体重分层随机分为空白对照组、模型对照组、地塞米松组（5 mg·kg-1）、荆芥挥发油0.226 g·kg-1及0.452 g·kg-1剂量组。除地塞米松组实验当日腹腔注射给药一次外，其余各组小鼠连续灌胃给药5 d，1次/d。各组末次给药30 min后，除空白组小鼠外，其余各组小鼠腹腔注射LPS（15 mg·kg-1）制备内毒素中毒模型。造模12 h后，小鼠取血分离血清，采用ELISA及液相蛋白芯片技术测定炎症因子IL-18，IL-1β，IL-5，TNF-α，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1β），巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的水平；剖取肺脏、脾脏、胸腺称重，计算脏器指数；取小鼠全血进行白细胞（WBC）、血小板（PLT）计数；同时进行各组小鼠肺组织病理组织学检查。GC-MS检测结果显示薄荷酮、胡薄荷酮的相对质量分数分别为46.67%，33.92%，二者质量分数占总挥发油的80.59%。荆芥挥发油预防给药，0.452，0.226 g·kg-1剂量均能显著降低模型小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF水平（P<0.01或P<0.05），荆芥挥发油0.452 g·kg-1剂量亦降低血清IL-18，GM-CSF水平（P<0.01或P<0.05）；荆芥挥发油0.226 g·kg-1剂量能使肺组织内嗜中性粒细胞浸润减少，显示出良好抗炎效应。但荆芥挥发油预防给药，对模型小鼠白细胞计数的升高、血小板计数的减少及脾脏指数、肺指数的升高、胸腺指数的降低无明显干预作用。结果表明，荆芥挥发油预防给药对内毒素（LPS）中毒模型小鼠有一定保护作用，作用发挥主要与抑制各类炎性细胞因子的释放，减轻炎症反应有关。
[关键词] 荆芥挥发油；内毒素中毒；保护作用；小鼠
[
[Key words] Schizonepeta volatile oil；endotoxin poisoning；protective effects；mice
doi：10.4268/cjcmm20162425
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为内毒素的主要成分，在多种疾病的病理进程中发挥重要作用，如感染性休克、多器官功能衰竭、发热反应、弥散性血管内凝血等。荆芥为临床常用辛温解表药之一，具有祛风解表、宣毒透疹、理血止痉之功效，多用于外感表证[1]。现代药理研究表明，荆芥抗炎、抗病毒作用良好，临床常用于治疗感冒发热、 咽喉肿痛和皮疹、皮肤瘙痒等。前期研究已证明荆芥挥发油具有良好的抗炎作用，其作用的发挥与影响花生四烯酸代谢、抗氧化、抑制促炎因子生成等有关[2-8]。内毒素作为细菌致病主要物质，能激活单核-巨噬细胞系统，产生大量炎症因子，而解表药恰能通过发汗解表祛邪之功效发挥抗炎、抗菌、抗病毒的作用，因此本课题组采用LPS造模，观察荆芥挥发油对模型小鼠的影响，以期进一步揭示和完善该提取部位的抗炎效应与机制，为其临床应用提供药理学数据。
1 材料
1.1 动物 SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，体重18～22 g，北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001，动物合格证号11400700130007。
1.2 受试物 荆芥购自成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定，为唇形科植物荆芥Schizononepeta tenuifolia Briq.的地上部分。荆芥挥发油提取：按2015年版《中国药典》第4部通则2204挥发油提取法中甲法提取，无水硫酸钠充分脱水，得到浅黄色、透明油状液体，密闭贮存于棕色瓶中，4 ℃保存备用，挥发油的提取率为0.61%（mL·g-1），符合2015年版《中国药典》荆芥含挥发油不得少于0.6%（mL·g-1）的要求。GC-MS进行挥发油成分分析。实验时用0.35%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）溶液配制使用，给药剂量分别为其LD50的1/10和1/5，即0.226，0.452 g·kg-1。
1.3 试剂 地塞米松（Sigma，批号D-4902-25 mg）；LPS（Escherichia coil 055：B5，Lot#044 M4004V）购自Sigma公司。Mouse IL-18 ELISA kit，批号118018007，购自E-bioscience公司。MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel-Immunology Multiplex Assay，批号2683668，购自Millipore公司。
1.4 仪器 HP6890/5973GC/MS仪（美国Agilent）；3001型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific）；Luminex Magpix（液相悬浮芯片仪，美国Millipore ）；BS323S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；MEK-6318K全自动血液分析仪（日本Nihon Kohden公司）。
2 方法
2.1 荆芥挥发油的GC-MS测定 将荆芥挥发油样本与色谱甲醇按50 μL∶2 mL进行混匀，然后采用0.22 μm尼龙筛网进行过滤，再装入棕色瓶内。将已处理好样本按照以下条件进行检测：HP-INNOWx色谱柱（0.53 mm×15 mm×50 m）；载气He；流速1 mL·min-1，柱初温80 ℃，程序升温10 ℃·min-1至140 ℃，再程序升温5 ℃·min-1至200 ℃后，程序升温25 ℃·min-1至终温260 ℃；电离方式EI，电离能70 eV；倍增器电压330 V；扫描范围20～450。质谱标准谱库为美国NIST，相对含量的确定为面积归一化法。
2.2 荆芥挥发油对LPS中毒模型小鼠的影响 取健康C57BL/6J雄性小鼠，按体重分层随机分为空白组、模型组、地塞米松（5 mg·kg-1）组（即阳性对照组）、荆芥挥发油0.452，0.226 g·kg-1组。除地塞米松组实验当日腹腔注射给药一次外，其余给药组小鼠按0.02 mL·g-1体积灌胃给药，空白组与模型组给予等体积0.35%吐温-80溶液，连续给药5 d，1次/d，末次给药30 min后，小鼠腹腔注射LPS（15 mg·kg-1，0.01 mL·g-1）造模，造模后12 h小鼠取血分离血清，采用ELISA试剂盒检测血清IL-18水平，采用液相悬浮芯片仪检测血清IL-1β，IL-5，TNF-α，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），巨噬细胞炎性蛋白-1β（MIP-1β），巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平。另取小鼠全血 20 μL至装有 2 mL稀释液的 EP 管中，混匀，采用全自动血细胞分析仪测定白细胞计数。剖取小鼠脾脏、胸腺、肺脏称重，计算脏器指数。将分离后的小鼠左肺固定于10%中性福尔马林中，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察各组小鼠肺组织的病理损伤。
2.3 数据处理 实验过程中所产生数据均采用SPSS 18.0软件进行统计分析，所有数据用±s表示，各组数据间采用独立样本t检验分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 荆芥挥发油 GC-MS测定 从本实验所用荆芥挥发油中分离出相对质量分数0.5%以上的成分12个，其中薄荷酮相对质量分数为46.67%，胡薄荷酮相对质量分数为33.92%，二者质量分数占总挥发油的80.59%，为挥发油主要组成成分。经计算，本實验挥发油样品的胡薄荷酮质量分数为0.207%，符合2015年版《中国药典》所述胡薄荷酮（C10H16O）含质量分数不得少于0.020%的规定。结果见表1。
3.2 荆芥挥发油对模型小鼠全血白细胞与血小板计数、脏器指数的影响 与空白组比较，模型组小鼠全血白细胞计数显著增加（P<0.05），血小板计数显著降低（P<0.05）；模型组脾脏指数、肺指数显著升高（P<0.01或P<0.05），胸腺指数显著降低（P<0.01）；与模型组比较，各给药组对全血白细胞，血小板计数均无明显影响作用；地塞米松组能显著降低脾脏指数（P<0.01），其余各给药组对脏器指数无明显作用，见表2，3。
3.3 荆芥挥发油对模型小鼠血清IL-18水平的影响 与空白组比较，模型组血清IL-18含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，荆芥挥发油0.452 g·kg-1剂量显著降低血清IL-18水平（P<0.01），见表4。
3.4 荊芥挥发油对模型小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α 含量均显著增加（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，荆芥挥发油0.452，0.226 g·kg-1剂量组对此均有显著对抗作用，能降低血清IL-1β，IL-5，TNF-α含量（P<0.01或P<0.05），见表5。
3.5 荆芥挥发油对模型小鼠血清MCP-1，MIP-1β， M-CSF，GM-CSF水平的影响 与空白组相比，模型组血清中MCP-1，MIP-1β，M-CSF，GM-CSF均显著增加（P<0.01或P<0.05）；荆芥挥发油0.452，0.226 g·kg-1剂量组能显著降低血清中MCP-1，MIP-1β，M-CSF水平（P<0.01或P<0.05）；荆芥挥发油0.452 g·kg-1剂量组显著降低血清中GM-CSF水平（P<0.05），见表6。
3.6 荆芥挥发油对模型小鼠肺组织病理组织学的影响 镜下观察可见，与空白组比较，造模组小鼠肺组织中肺泡隔内嗜中性粒细胞浸润明显，肺泡膈有不同程度增厚，肺组织小血管内充满嗜中性粒细胞，肺泡膈增厚的主要原因为炎细胞浸润造成。为了更直观说明药物对此病变程度的影响作用，实验中对各造模组肺组织切片中肺泡膈和小血管内嗜中性粒细胞的数量进行定量，评价方法：每叶肺400倍镜下取上、中、下3张图片，肺叶尖为上，支气管进入处最下端为下，两端之间为中部，每只动物取6张图片，计数每张图片上的嗜中性粒细胞数目，取其平均值作为该例标本嗜中性粒细胞的计数，并以此作为急性炎性反应程度指标进行统计学处理，统计方法为SPSS 18.0方差分析。结果见表7，图1，荆芥挥发油对内毒素所诱导的肺组织急性炎性细胞浸润有减轻作用，其中0.226 g·kg-1剂量组作用显著（P<0.01）。
4 讨论
内毒素又名“致热物质”，为革兰氏阴性菌细胞壁外膜特有成分，能够直接或间接损伤肺泡-毛细血管屏障，导致毛细血管通透性增加，炎症介质释放失控和中性粒细胞迁移，常见于感染性疾病和严重创伤中。内毒素中毒是指内毒素大量积聚于血液中，超过机体各自卫系统的清除能力所导致的不同程度的内毒素血症。内毒素血症进一步的发展可能引起脓毒性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征等。脂多糖（LPS）作为内毒素的主要成分，是重要的致病因素之一，在细菌繁殖或死亡时可释放到细胞外发挥致病效应[9]。由LPS所致的内毒素中毒模型可表现出肺泡膈增厚，细胞成分增加，炎细胞浸润等。大量研究发现，由LPS诱导的动物内毒素中毒模型具有易于操作，可重复性好，不会引起多器官功能衰竭的特点，因此十分适用于药物抗炎作用机制的研究。
IL-1β作为一种前炎性释放因子，能诱导单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1β）的产生。IL-18又名IFN-γ诱导因子，能诱导IFN-γ，细胞间黏附因子（ICAM-1），TNF-α等的产生。TNF-α可直接损伤肺血管内皮细胞和激发中性粒细胞大量释放炎性介质，造成肺组织损伤[11]。有研究报道给予LPS刺激后，模型小鼠体内IL-1β，IL-18，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF等促炎因子水平均明显上升[12-16]。本实验结果显示，LPS所诱导的中毒模型小鼠血清中促炎因子IL-18，IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF，GM-CSF的水平均明显升高，且肺组织内中性粒细胞浸润明显，与文献报道相符，表明造模成功。荆芥挥发油预防给药，0.452，0.226 g·kg-1剂量均能显著降低血清IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF含量，0.452 g·kg-1剂量同时能降低血清中IL-18，GM-CSF水平，表明荆芥挥发油能通过抑制大量促炎细胞因子的释放来减轻模型小鼠的炎性损伤，是其抗炎机制之一。此外，病理学组织检测发现，荆芥挥发油0.226 g·kg-1剂量能使肺组织内嗜中性粒细胞浸润减少，显示出良好抗炎效应。
此外，实验结果显示，LPS诱导的中毒模型小鼠全血白细胞计数显著增加，血小板计数明显下降，脾脏指数、肺指数显著升高，胸腺指数显著降低，均体现出LPS对血液系统及器官组织的损伤表现，与文献报道相符[15]，然而荆芥挥发油预防给药对上述损伤表现的干预作用不明显。
综上，荆芥挥发油预防给药对内毒素中毒模型小鼠具有一定保护作用，主要是通过减轻炎症反应来发挥保护作用，作用机制与下调促炎因子的释放，减轻炎性细胞浸润有关。但其对于炎症反应相关信号通路的影响有待进一步探讨。
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[責任编辑 马超一]
作者：温桃群 桑文涛 徐锋 王凤 曾南
荆芥挥发油化学成分分析论文 篇2：
荆芥挥发油及其主要成分抗流感病毒作用与机制研究
[摘要] 目的：体内、体外实验观察荆芥挥发油及主要成分薄荷酮、胡薄荷酮的抗甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）作用及其Toll样受体/干扰素（toll-like receptor/interferon，TLR/IFN）信号通路机制。方法：制备流感病毒性肺炎模型小鼠，以预防和治疗方式给药，测定模型动物肺组织病毒滴度以评价药物体内抗H1N1效应。ELISA法观察药物对模型小鼠血清干扰素-α（interferon-alpha，IFN-α），干扰素-β（interferon-beta，IFN-β），白介素-2（interleukin-2，IL-2），白介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）水平的影响及病毒感染狗肾传代细胞（Madin-Darby canine kidney cell，MDCK）上清液中IFN-β分泌水平的影响。实时荧光定量RT-PCR法观察药物对病毒感染MDCK细胞白介素1 受体相关激酶-4（IL-1 R-associated kinase-4，IRAK4）与Toll样受体3（toll-like receptor-3，TLR3） mRNA表达水平的影响。结果：体内实验表明，荆芥挥发油 0.226 mg·kg-1、薄荷酮 0.5 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1治疗方式给药明显降低感染小鼠肺组织病毒滴度；荆芥挥发油0.226 mg·kg-1明显升高感染小鼠血清IFN-α，IL-2含量；薄荷酮0.5 mg·kg-1显著提高血清IFN-β含量。薄荷酮0.5 mg·kg-1、胡薄荷酮0.19 mg·kg-1明显降低病毒感染小鼠血清IL-6含量。荆芥挥发油0.452，0.226 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1明显降低模型小鼠血清TNF-α含量。体外实验显示，荆芥挥发油0.1 g·L-1、胡薄荷酮0.1 g·L-1显著升高感染细胞上清液中IFN-β含量，并使细胞IRAK4 mRNA 表达水平显著升高；薄荷酮0.25 g·L-1使感染细胞IRAK4 mRNA 表达显著增强，但明显降低TLR3 mRNA表达。结论：荆芥挥发油、薄荷酮及胡薄荷酮治疗方式给药能显著降低病毒感染小鼠肺组织病毒滴度，显示出体内抗病毒作用，但预防给药效果不明显。体内抗病毒感染机制与提高感染小鼠干扰素（IFN-α，IFN-β），IL-2水平，抑制IL-6，TNF-α分泌有关；细胞模型结果提示药物通过TLR3和TLR7信号通路影响IFN-β的表达。
[关键词]荆芥挥发油；薄荷酮；胡薄荷酮；甲型流感病毒（H1N1）；病毒滴度；细胞因子；TLR/IFN信号
[稿件编号] 20121008004
[基金项目] 国家自然科学基金项目（30973923）；2010年度高层次留学人才回国资助人选项目、2010年度留学回国人员科技活动项目择优项目（国家人社部人社厅函[2010]411，412号）
[通信作者] *曾南，教授，Tel：（028）61800231，E-mail：zengnan966@126.com
荆芥为唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥茎叶及花穗，性微温，味辛，具有祛风解表，透疹等功效。已有研究表明，荆芥挥发油及其主要成分在鸡胚、细胞水平上具有较好的抗流感病毒作用，且对流感病毒感染小鼠具有良好保护作用[1-2]。本研究基于前期研究结果，进一步观察药物对病毒感染模型小鼠肺组织病毒滴度的影响以揭示其抗流感病毒作用，并从模型小鼠血清细胞因子水平，病毒感染细胞干扰素-β（interferon-beta，IFN-β）分泌水平，及白介素1 受体相关激酶-4（IL-1 R-associated kinase-4，IRAK4）与Toll样受体3（toll-like receptor-3，TLR3）mRNA表达角度，探讨药物抗流感病毒的作用机制，为该药发散表邪之功效的现代科学内涵阐释提供药理实验依据。
1 材料
1.1 受试药物 荆芥原药材购于成都荷花池中药材市场，产地河北，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定为唇形科植物荆芥S. tenuifolia的干燥茎叶及花穗，符合药典标准。荆芥挥发油，采用2010年版药典附录挥发油提取甲法提取，获淡黄色油状液体，无水硫酸钠脱水后避光密闭保存，GC-MS测定其含薄荷酮40.31%，胡薄荷酮45.18%。胡薄荷酮（HPLC测定纯度为92%）、薄荷酮（HPLC测定纯度为85%），百灵威科技有限公司，批号分别为41850100，203610250。利巴韦林片，四川美大康药业股份有限公司，批号110305。 利巴韦林，Sigma公司，批号020M4003。应用于细胞试验的药物配制方法同文献[1]。
1.2 病毒株及细胞 流感甲型病毒鼠肺适应株A/PR/8/34（H1N1），四川大学华西医学中心提供，-80 ℃保存备用。使用前9日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1∶512。狗肾传代细胞（Madin-Darby canine kidney cell，MDCK），由四川省疾病预防控制中心惠赠，传代后使用。
1.3 动物 KM小鼠，SPF级，体重18～22 g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK（川）2008-24。
1.4 仪器和试剂 EN 12469：200 class生物安全柜、Multiskan MK3酶标仪、4MK2洗板机（均为美国Thermo公司）；ND1000核酸蛋白测定仪（美国Nano Drop）；IQ5 optical module实时荧光定量RT-PCR仪（美国Bio-Rad）；OS-10震荡器（德国BOECO）。Dulbecco′s modified eagle medium（DMEM）培养基，青、链霉素母液，7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ，HEPES，胎牛血清（FBS），0.25%EDTA-胰酶均购自Invitrogen公司；Alserver液，TPCK-胰酶，4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT），二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；PBS磷酸盐缓冲溶液购自Thermo Scientific公司；各类细胞因子ELISA试剂盒（批号201202），均为R&D公司产品；逆转录试剂盒（批号DR037S）与SYBR Premix Ex Taq试剂盒（批号BKA2704），均为TaKaRa产品；琼脂糖，Marker，Trizol均购自大连宝生物工程有限公司。
2 方法
2.1 药物对流感病毒性肺炎模型小鼠肺组织病毒滴度的影响 取KM小鼠，按体重、性别分层随机分为荆芥挥发油0.452，0.226 mg·kg-1剂量组，薄荷酮1.0，0.5 mg·kg-1剂量组，胡薄荷酮0.19，0.095 mg·kg-1剂量组，空白对照组，模型对照组及利巴韦林片组。戊巴比妥钠麻醉小鼠，固定，使头部向上与水平呈45度角（便于病毒液顺利流入肺部），在颈部正中做切口，分离气管，用微量进液针吸取50 μL 浓度为30 LD50病毒液（病毒感染小鼠的半数致死量LD50为10-3.5/0.1 mL），向肺部方向注射入气管，缝合，完成病毒感染[2]。预防方式给药：小鼠病毒感染前5 d开始以灌胃途径给药，每天1 次，连续 5 d，末次给药后当天进行手术感染病毒；治疗方式给药：小鼠病毒感染后当天开始灌胃给药，每天1 次，连续5 d。感染后5 d小鼠禁食不禁水8 h，颈椎脱臼处死小鼠后取全肺，用生理盐水制备10%组织匀浆，4 000 r·min-1离心10 min后取上清液进行血凝试验，血凝板上12个孔内每孔加入0.05 mL生理盐水，吸等量肺组织匀浆上清液于第1 孔内，混匀后吸出0.05 mL于第2 孔内混匀，以此类推稀释至第12孔，并弃去第12孔多余的0.05 mL，然后从左至右依次孔内加入1%鸡红细胞悬液0.05 mL。将血凝板置于振荡器上振荡2 min，充分混匀，于37 ℃恒温培养箱中放置10 min后取出观察。出现完全凝集（红血球在反应板底部全部均匀铺开）的肺组织匀浆液的最高稀释度，即为血凝滴度。
2.2 药物对流感病毒性肺炎模型小鼠血清细胞因子水平的影响 实验分组、治疗方式、给药方法同2.1项，末次给药后2 h小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清置于-20 ℃备用。临用前平衡至室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，检测干扰素-α（interferon-alpha，IFN-α），干扰素-β（interferon-beta，IFN-β），白介素-2（interleukin-2，IL-2），白介素-6（interleukin-6，IL-6），和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）的水平。
2.3 药物对病毒感染MDCK细胞 IRAK4，TLR3 mRNA 表达的影响 待T25 细胞瓶中细胞形成薄单层后，弃上清，Hank′s 液轻柔洗细胞3 次；加入10 倍半数感染剂量（50% tissue culture infective dose，TCID50）病毒液0.5 mL/瓶（正常细胞对照组加入Hank′s 液0.5 mL/瓶），36.5 ℃，5%CO2培养箱吸附病毒1 h，然后吸出病毒液，Hank′s液轻柔洗细胞3次。病毒对照组加入病毒生长液，阳性对照组加入含利巴韦林病毒生长液（终浓度1 g·L-1），荆芥挥发油、薄荷酮和胡薄荷酮组加入含药病毒生长液（药物终浓度分别为0.1，0.25，0.1 g·L-1），细胞对照组加入无血清培养液，33.5 ℃，5%CO2培养箱继续培养7 h，消化收集细胞，-80 ℃保存[1]。取-80 ℃保存的MDCK细胞，Trizol法提取细胞RNA，核酸蛋白测定仪260 nm处测定各组RNA浓度，Nuclease-Free Water将各组调整成相同浓度。RT试剂盒进行逆转录，逆转录反应体系（10 μL）与反应条件，以及实时荧光定量RT-PCR反应体系（25 μL）和反应条件均同文献描述[1]。各引物均由大连宝生物工程有限公司设计合成，引物序列为18S RNA：F 5′-CGGACAGGATTGACAGATT-3′，R 5′- CAAATCGCTCCACCAACTAA-3′；IRAK4：F 5′- GGC AAAGACAGGACATTTGTGT-3′，R 5′- TTTTCTGGAC TTGAGGAGTCAGG-3′；TLR3：F 5′- CCTGGTTTGTTA ATTGGATTAACAG-3′，R 5′- TGAGGTGGAGTGTTG CAGAGG-3′。
仪器分析得出各个样品量C t值，所有样品基因均经过内参18S RNA的均一化处理，然后用2-ΔΔC t公式计算mRNA的相对表达量。
2.4 病毒感染MDCK细胞上清液IFN-β含量测定 待6孔板中细胞形成薄单层后，弃上清，Hank′s 液轻柔洗细胞3 次；加入10 TCID50病毒[1]0.25 mL/孔（细胞对照组加入Hank′s 液0.25 mL/孔 ），36.5 ℃，5%CO2培养箱吸附1 h，吸出病毒液，Hank′s液轻柔洗细胞3次；加入相应培养液5 mL/孔。实验分6 组进行，每组设置8 个平行样品，其中病毒对照组加入病毒生长液，阳性对照组加入含利巴韦林病毒生长液（终浓度1 g·L-1），荆芥挥发油、薄荷酮和胡薄荷酮组加入含药病毒生长液（药物终浓度分别为0.1，0.25，0.1 g·L-1）[1]，细胞对照组加入无血清培养液，33.5 ℃，5%CO2培养箱继续培养7 h，用无菌EP管收集各孔上清液。4 ℃，3 000 r·min-1离心20 min，避开沉淀小心收集离心后的上清液，-20 ℃备用。临用前平衡至室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测IFN-β水平。
3 结果
3.1 药物对流感病毒性肺炎模型小鼠肺组织病毒滴度的影响 与正常组比较，模型组动物肺组织病毒滴度明显升高，提示模型的成功。与模型组比较，经预防途径给药后各组药物对病毒感染小鼠肺组织
病毒滴度影响不明显，仅表现出降低趋势；经治疗途径给药后荆芥挥发油 0.226 mg·kg-1、薄荷酮 0.5 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1能明显降低模型小鼠肺组织病毒滴度（P<0.05，P<0.01）。此外，本实验与前期实验[2]中均未发现小鼠性别会影响流感病毒的感染强度及药物的效应，见表1。
表1 药物对流感病毒性肺炎模型小鼠肺组织病毒滴度的影响（±s，n=10）
Table 1 The effect of drugs on HA titers in lung tissue from Flu viral pneumonia model mice（±s，n=10）
注：与正常组比较1）P<0.05，2）P<0.01；与模型组比较3）P<0.05，4）P<0.01，5）P<0.001（表2同）。
3.2 药物对流感病毒性肺炎模型小鼠血清细胞因子水平的影响 与模型组比较，经治疗途径给药后，荆芥挥发油0.226 mg·kg-1明显提高感染小鼠血清中IFN-α，IL-2 含量；薄荷酮0.5 mg·kg-1明显升高IFN-β含量。薄荷酮0.5 mg·kg-1和胡薄荷酮0.19 mg·kg-1明显降低病毒感染小鼠血清IL-6含量；荆芥挥发油0.452，0.226 mg·kg-1及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1能明显降低模型小鼠血清TNF-α 含量（P<0.05，P<0.01），见表2。
表2 药物治疗方式给药对流感病毒性肺炎模型小鼠血清细胞因子水平的影响（±s，n=8）
Table 2 The effect of drugs on the serum cytokine levels in Flu viral pneumonia model mice by treatment ways（±s，n=8）
3.3 药物对病毒感染MDCK细胞IRAK4和TLR3 mRNA 表达的影响 与细胞对照组比较，病毒对照组细胞IRAK4和TLR3 mRNA 表达有所增加。与病毒对照组比较，荆芥挥发油0.1 g·L-1、薄荷酮0.25 g·L-1及胡薄荷酮0.1 g·L-1剂量组IRAK4 mRNA 表达水平显著升高，其中荆芥挥发油作用优于胡薄荷酮、薄荷酮。与病毒对照组比较，薄荷酮0.25 g·L-1剂量组TLR3 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），见表3。
表3 药物对染毒MDCK细胞IRAK4和TLR3 mRNA表达量的影响（±s，n=4）
Table 3 The effect of drugs on IRAK4 and TLR3 mRNA expressions in H1N1-infected MDCK cells（±s，n=4）
注：与细胞对照组比较1）P<0.05，2）P<0.01；与病毒对照组比较3）P<0.05，4）P<0.01，5）P<0.001（表4同）。
3.4 药物对病毒感染MDCK细胞IFN-β分泌的影响 与病毒对照组比较，荆芥挥发油0.1 g·L-1和胡薄荷酮0.1 g·L-1剂量使IFN-β分泌水平显著升高（P<0.01），见表4。
表4 药物对病毒感染MDCK细胞IFN-β分泌水平的影响（±s，n=8）
Table 4 The effect of drugs on IFN-β production in H1N1-infected MDCK cells（±s，n=8）
4 讨论
荆芥作为一味常用的解表药，化学研究表明挥发油为其主要有效部位群之一[3-4]，其中又以薄荷酮和胡薄荷酮为主要成分。药理学研究已表明荆芥挥发油是其抗炎抗过敏的主要物质基础[5-8]。近期研究发现荆芥挥发油及其主要成分在鸡胚和细胞水平上都有较好的抗流感病毒作用[1-2]。本研究采用流感病毒感染小鼠模型观察药物对小鼠肺组织病毒滴度的影响，结果表明荆芥挥发油、薄荷酮和胡薄荷酮经预防途径给药，对模型小鼠肺组织病毒滴度影响不明显，仅表现出降低趋势；但经治疗途径给药，荆芥挥发油0.226 mg·kg-1、薄荷酮 0.5 mg·kg-1、胡薄荷酮0.19 mg·kg-1剂量均能明显降低模型小鼠的肺组织病毒滴度。该结果与前期研究报道，即荆芥挥发油、薄荷酮与胡薄荷酮治疗方式给药能显著降低流感病毒感染小鼠肺指数的结果相吻合[2]，进一步证实了荆芥挥发油与其主要成分的抗流感病毒作用。
为探讨药物的抗流感病毒作用机制，本研究检测了治疗方式给药后药物对病毒感染小鼠血清细胞因子水平的影响。IFN-α与IFN-β是2种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增长和免疫调节作用的细胞因子，病毒感染宿主后，IFN-α与IFN-β基因去UNC93B1（一种含有12个跨膜结构区域的内质网蛋白）抑制而表达，然后启动IFN调控基因的表达，生成多种酶和蛋白质并作用于病毒，使机体在短时间内处于抗流感病毒状态[9]。实验结果显示，流感病毒感染造模后，小鼠血清IFN-α与IFN-β水平均有一定程度的上升趋势，提示机体在病毒感染后自身存在一定程度的抵抗能力，而荆芥挥发油0.226 mg·kg-1治疗给药后能明显升高小鼠血清IFN-α含量，薄荷酮0.5 mg·kg-1明显升高血清IFN-β含量，提示提高感染动物血清IFN-α和IFN-β水平是药物抗流感病毒作用发挥的环节之一。研究表明，流感病毒感染机体后会导致IL-2分泌水平降低，并导致机体免疫功能失调，实验发现荆芥挥发油0.226 mg·kg-1经治疗方式给药后能明显升高小鼠血清IL-2含量，提示药物可通过促进感染小鼠IL-2分泌从而调节感染所引起的机体免疫功能失调来发挥抗流感病毒作用。IL-6与TNF-α是由单核和巨噬细胞分泌的细胞因子，具有非常重要的促炎活性和免疫调节作用，临床研究表明流感病毒感染后血清IL-6与TNF-α水平高低与典型的临床症状密切相关[10]。本实验中，流感病毒感染小鼠后，小鼠血清IL-6与TNF-α水平均明显升高，提示其参与病毒感染导致的肺组织病理损伤，与文献报道吻合[11-13]。薄荷酮0.5 mg·kg-1、胡薄荷酮0.19 mg·kg-1治疗方式给药后明显降低模型小鼠血清IL-6含量，而荆芥挥发油0.452，0.226 mg·kg-1以及胡薄荷酮0.19 mg·kg-1能明显降低小鼠血清TNF-α含量，提示药物抑制感染小鼠IL-6与TNF-α的分泌是其减轻肺组织炎性损伤的环节之一。
流感病毒为单链负链RNA病毒[（-）ssRNA]，在复制过程中会产生中间体——双链RNA（dsRNA）。研究已证实TLR7能特异性识别ssRNA，TLR3能特异性识别dsRNA[14-15]；同时，李毅等[16]还指出TLR3识别的dsRNA不仅可以是病毒基因组的RNA，还可以是病毒进行复制过程中所出现的RNA。鉴于前期研究所发现的荆芥挥发油与其主要成分的抗流感病毒作用与激活TLR7，诱导IFN-β表达有关的基础[1-2]，本实验进一步选取TLR7信号通路相关分子IRAK4，同时针对流感病毒特点选取TLR3和IFN-β作为切入点，以感染细胞为载体，选取各药物对细胞的最大无毒浓度探讨其机制。研究发现，与病毒对照组比较荆芥挥发油0.1 g·L-1、薄荷酮0.25 g·L-1及胡薄荷酮0.1 g·L-1体外能显著提高染毒细胞的IRAK4 mRNA 表达水平，尤以荆芥挥发油作用较强，而薄荷酮0.25 g·L-1同时显著抑制TLR3 mRNA表达。此外，荆芥挥发油0.1 g·L-1、胡薄荷酮0.1 g·L-1能促进染毒细胞IFN-β分泌，薄荷酮0.1 g·L-1使IFN-β分泌水平轻微降低，该结果与前期实验中药物诱导染毒细胞TLR7，IFN-β mRNA表达的结果相一致[1]。此外，结合前期研究结果，即荆芥挥发油与胡薄荷酮对流感病毒细胞内增殖的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）分别为1.7×10-3，1.9×10-3 g·L-1，对流感病毒直接杀灭作用的IC50分别为3.1×10-3，7.2×10-3 g·L-1；薄荷酮对流感病毒细胞内增殖抑制作用较差，但对流感病毒有直接杀灭作用，IC50为5.1×10-3 g·L-1。
综上，笔者认为：①荆芥挥发油和胡薄荷酮能通过激活TLR7通路，诱导下游相关分子IRAK4 mRNA表达，最终致使IFN-β大量分泌而发挥抗流感病毒作用。②薄荷酮抗流感病毒作用的发挥可能与TLR3和TLR7 2条通路有关。有文献报道在Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染的上皮细胞中，发现TLR7被诱导表达的时候TLR3的表达却被抑制，提示TLR3和TLR7在病毒感染过程中可能依次作用来调节上皮细胞的免疫反应过程而发挥抗病毒效应[17]。③药物抗病毒效应的强弱与TLR/IFN信号通路相关分子表达水平的高低密切相关。关于荆芥挥发油、薄荷酮及胡薄荷酮的抗流感病毒机制课题组将进一步深入研究。
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Study on effect and mechanism of volatile oil of Schizonepetae Herba and
its essential components against influenza virus
HE Ting，TANG Qi，ZENG Nan*，GOU Ling，LIU Jin-wei，YANG Jing，YU Liu，WANG Zhe，GONG Xi-ping
（Cultivation Base of State and Provincial Key Laboratory for Research，Development and Utilization of Traditional
Chinese Medicine Resources，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）
[Key words] volatile oil of Schizonepetae Herba； menthone； pulegone； influenza virus A/PR/8/34 （H1N1）； hemagglutination titer； cytokines
doi：10.4268/cjcmm20131125
[责任编辑 张宁宁]
作者：何婷,汤奇,曾南*,苟玲,刘金伟,杨靖,于柳,王哲,龚锡平
荆芥挥发油化学成分分析论文 篇3：
基于化学成分和药理效应的荆芥传统分段加工与一体化加工工艺比较
[摘要] 测定荆芥经饮片一体化加工与传统分段加工后所得产品中挥发油的含量，并采用GC-MS测定挥发油中8个代表性化合物（薄荷酮、胡薄荷酮、1-辛烯-3-酮、d-柠檬烯、β-石竹烯、β-香叶烯、薄荷呋喃、3-辛酮）的含量，通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，考察荆芥2种加工方法抗炎作用的差异。通过对荆芥不同加工产品挥发性成分含量与功效的比较，阐述荆芥药材、饮片一体化加工工艺的合理性。结果显示，荆芥一体化工艺加工产品8个化合物含量均高于传统工艺产品；2种加工方法均能降低小鼠耳廓肿胀度、降低致炎小鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6的含量，产生抗炎作用。经过同剂量间比较，一体化加工工艺的抗炎作用整体上优于传统加工工艺。相比传统分段加工工艺，一体化加工在保证饮片质量的同时，提高了效率、节约时间及人工成本，具有合理性。
[关键词]荆芥； 一体化； 化学成分； 抗炎
[Key words]Schizonepetae Herba； integration； chemical component； anti-inflammatory
doi：10.4268/cjcmm20161117
荊芥是唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，又名假苏，始载于《神农本草经》[1]，为临床常用中药，性温、味辛，以全草入药，具有解表散风、透疹、消疮之功效，主治风寒感冒、咽喉肿痛及多种皮肤病[2-3]。现代药理研究表明荆芥具有抗病毒、解热、抗菌、抗过敏、镇痛、降温等作用[4-7]，在解表药中其地位独特而重要[8-9]。挥发油类成分是其抗炎的主要物质基础之一，沸点较低，容易挥发散失，而且对日光及温度较敏感，易于分解变质[10]。2015年版药典中规定荆芥的产地加工方法主要是除杂后干燥成药材，需制成饮片时，将荆芥药材除去杂质后喷淋清水，洗净润透，于50 ℃烘1 h，再经切段干燥即得。综合其加工过程，药材加工成饮片时需水处理及重复干燥，会造成挥发油及其他水溶性成分的损失，且分段加工干燥时间长，效率低下，雨天易霉烂变质、容易被鼠、虫、灰尘等污染，药材含水量、质量难以稳定[11]。为避免分段加工造成的有效成分的流失、降低药材饮片加工的时间及人工成本，本实验室前期探索了荆芥药材、饮片一体化加工工艺，现拟通过比较传统加工饮片与一体化加工饮片有效成分含量与功效的异同，探讨荆芥药材、饮片一体化工艺的可行性与合理性。
1 材料
薄荷酮、胡薄荷酮对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 111705-201205，111706-201205）； 1-辛烯-3-酮、d-柠檬烯、β-石竹烯对照品均购自Tokyo Chemical Industrial公司（日本）；β-香叶烯、薄荷呋喃、3-辛酮对照品均购自Sigma-Aldrich公司（奥地利），对照品纯度均大于98%；萘（内标，国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；正戊烷（内标，国药集团化学试剂有限公司，GC级）；乙酸乙酯为色谱纯；阿司匹林购自南京白敬宇制药有限责任公司（批号140601）；二甲苯（批号20110410，江苏永华精细化学品有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号F20101222，国药集团化学试剂有限公司）；小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Elisa试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，批号分别为SBJ-R0024，SBJ-M0044，SBJ-M0010）。
荆芥于2014年10月采自河北安国，经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为唇形科植物荆芥S.tenuifolia的地上部分。
Agilent 6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪、Agilent ChemStation化学工作站软件（美国 Agilent公司）；B211D 电子天平（1/10万，赛多利斯科学仪器有限公司）。
ICR小鼠，SPF级，雄性，体重（20±2） g。由浙江省实验动物中心提供，合格证号SCXK（浙）2013-0016。
2 方法
2.1 荆芥挥发油含量及其所含成分的定量测定[12]
2.1.1 GC-MS条件 色谱柱： HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度200 ℃；载气氦气，载气流速1.0 mL·min-1；分流比20∶1；程序升温：初始温度为50 ℃，以10 ℃·min-1升温至90 ℃，保持6 min，再以8 ℃·min-1升温至150 ℃，保持2 min；进样量1 μL；电轰击电离源（EI）；电子能量70 eV；四级杆度150 ℃；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；扫描范围m/z40～400。GC-MS图见图1。
2.1.2 样品制备 一体化加工方法：鲜荆芥除杂后50 ℃干燥5 h，切段（1 cm），40 ℃干燥3 h干燥成饮片。传统加工方法：除去杂质，晒干，制得药材。取药材喷淋清水，洗净，润透，于50 ℃烘1 h，切段（1 cm），40 ℃干燥3 h得饮片。挥发油的提取：取荆芥饮片适量，照《中国药典》2015年版四部 “挥发油提取法”甲法提取挥发油，计算得率。提取的挥发油加入适量无水Na2SO4静置保存。
2.1.3 内标溶液的制备 取萘和正癸烷适量，置100 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL含萘1.73 mg，正癸烷0.29 mg）。
2.1.4 供试品溶液的制备 取加入适量无水Na2SO4静置1 h后的荆芥挥发油约50 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液和内标溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度。
2.1.5 对照品溶液的制备 精密称取对照品3-辛酮12.47 mg、β-香叶烯10.91 mg、薄荷酮160.35 mg、1-辛烯-3-酮13.64 mg、D-柠檬烯21.18 mg、薄荷呋喃14.07 mg、胡薄荷酮270.42 mg、β-石竹烯12.95 mg，分别置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各待测化合物的对照品溶液。精密量取3-辛酮溶液0.5 mL、β-香叶烯0.3 mL、薄荷酮2 mL、1-辛烯-3-酮0.5 mL、D-柠檬烯1 mL、薄荷呋喃1 mL、胡薄荷酮2 mL、β-石竹烯1 mL置同一10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。荆芥中8个化合物MS监测数据见表1。
2.1.6 线性关系的考察 分别精密量取对照品混合溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置10 mL量瓶中，分別精密加入内标溶液 1 mL，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述6份溶液各1 μL，进样，按内标法以峰面积计算。以各待测化合物与内标的峰面积比值（y）为纵坐标，各待测化合物质量浓度（x，mg·L-1）为横坐标，进行线性回归，得回归方程。各化合物线性关系考察结果见表2。
2.1.7 精密度试验 精密量取对照品混合溶液1 mL置10 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得精密度试验溶液。连续进样6次，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为1.4%～2.4%，表明本方法精密度良好，具体结果见表3。
2.1.8 重复性试验 取同一荆芥饮片所得挥发油6份，分别按2.1.4项下方法制备供试品溶液，照上述试验条件进样测定，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，按内标法计算含量，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为2.3%～2.9%，表明本方法重复性良好，具体结果见表3。
2.1.9 稳定性试验 取同一份荆芥挥发油供试品溶液，照上述试验条件分别在0，2，4，6，8，12 h进样测定，计算各待测化合物峰面积与内标峰面积的比值，计算RSD，结果为8种化合物的RSD为1.5%～2.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定，具体结果见表3。
2.1.10 加样回收试验 取已知待测化合物含量的同一荆芥挥发油约50 mg，共6份，精密称定，置10 mL量瓶中，分别加入薄荷酮对照品溶液和胡薄荷酮对照品溶液各1 mL，加入3-辛酮对照品溶液、β-香叶烯对照品溶液和d-柠檬烯对照品溶液各0.1 mL，加入1-辛烯-3-酮对照品溶液和β-石竹烯对照品溶液各0.3 mL，加入薄荷呋喃对照品溶液0.5 mL，用乙酸乙酯溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液和内标溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度。照上述试验条件进样测定，以各待测化合物与内标的峰面积比值按内标法计算样品含量，再计算加样回收率，结果见表3。
2.1.11 样品测定 分别取3个批次的鲜荆芥，每个批次分为2份，分别按2.1.2项下制备2个加工工艺的样品。取每份样品适量，按2.1.4项下制备供试品溶液。照上述实验条件进行测定，以各待测化合物与内标的峰面积比值按内标法计算待测成分含量，再以含油量换算饮片中各待测成分的含量，取平均值，结果见表4。
2.2 2种工艺产品抗炎作用的比较
2.2.1 分组与给药 取ICR小鼠90只，随机分为空白组、模型组、阳性组、一体化高、中、低剂量组（1.5，3.0，6.0 g·kg-1）、传统高、中、低剂量组（1.5，3.0，6.0 g·kg-1），每组10只。二甲苯致炎前每天上午9：00和下午4：00灌胃给药，连续给药3 d。阳性组给予阿司匹林混悬液，一体化高、中、低剂量组分别给予不同浓度的荆芥一体化工艺产品粉末混悬液，传统高、中、低剂量组分别给予不同浓度的荆芥传统工艺产品粉末混悬液，空白组和模型组给予等体积的0.5% CMC-Na溶液，各组小鼠每次灌胃给药体积均为15 mL·kg-1（体重）。
2.2.2 模型制备与耳肿胀度检测 末次给药1 h后，除空白组外，各组小鼠于左耳正反两面涂抹0.04 mL二甲苯致炎，右耳做对照。1 h后将小鼠脱颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径7 mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重，以左右耳片重量之差与右耳的比值为肿胀度。
2.2.3 ELISA法检测荆芥对耳肿胀小鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6含量的影响 二甲苯致炎1 h后眼框取血，血样静置30 min后3 000 r·min-1離心10 min，取上清，ELISA法检测血清中TNF-α， IL-1β和IL-6含量。
2.2.4 数据处理 数据用±s表示，采用SPSS 20.0进行统计学分析，以P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 一体化工艺与传统工艺加工产品化学成分的比较
相比传统加工工艺产品，一体化加工工艺产品中挥发油与8个待测成分的含量均有所增加，见表4。
3.2 对二甲苯致耳廓肿胀小鼠肿胀度的影响
与模型组比较，阳性药抑制肿胀作用明显，荆芥一体化工艺和传统工艺产品各剂量均能降低小鼠耳廓肿胀度，高、中剂量作用尤其显著（P<0.01或P<0.05）。经同剂量间比较，传统工艺产品中剂量的抑制肿胀作用效果明显优于一体化工艺产品中剂量（P<0.05）；与传统高剂量组比较，一体化高剂量组小鼠耳廓肿胀度的降低更加显著（P<0.01），见表5。
3.3 对二甲苯致耳廓肿胀小鼠的血清中TNF-α，IL-1β，IL-6含量的影响
与空白组比较，模型组小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6的含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较，阳性药明显降低小鼠血清中TNF-α的含量（P<0.05），荆芥一体化中、高剂量组显著降低小鼠血清中TNF-α的含量（P<0.01），且一体化中剂量组的作用明显强于同计量的传统组（P<0.05）；各给药组均能显著降低小鼠血清中IL-1β和IL-6的含量（P<0.01或P<0.05），同剂量组之间比较，一体化工艺产品对于小鼠血清中IL-1β，IL-6含量的影响略优于传统工艺产品，但无显著的统计学差异，见表5。综合来看，相比较于荆芥传统分段加工产品，荆芥一体化工艺产品的抗炎效果较强。
4 讨论
现代中医学研究认为，表证症状与炎症这一基本病理过程紧密相连，解表药的抗炎作用是其发挥解表功效的重要药理基础之一，因而研究荆芥抗炎作用及作用机制是研究荆芥的解表作用的重要途径[13]。本实验通过比较小鼠的肿胀度以及血清中TNF-α，IL-1β和IL-6含量，来考察荆芥一体化工艺和传统工艺产品高、中、低3种剂量饮片粉末的抗炎作用。TNF-α作为炎症反应的重要介质，通过增高微血管壁通透性和趋化、增强中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附性激活炎性细胞。IL-1β和IL-6介导中性粒细胞等炎性细胞到局部病灶，是炎症性疾病中的重要因素[14]。在本实验中，荆芥一体化工艺产品与传统工艺产品均能降低小鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6炎症细胞因子的含量，降低小鼠耳廓肿胀度，发挥抗炎作用。
研究表明，挥发油是荆芥的主要药效成分，其药效作用可能是几种成分的加和或协同作用，不同成分组成或主要成分比例有较大差异的荆芥挥发油，药效和急性毒性相差很大[15-16]。前期研究发现，胡薄荷酮、薄荷酮、柠檬烯、3-辛酮、1-辛烯-3-酮、β-香叶烯、β-石竹烯、薄荷呋喃在荆芥挥发油中占有很高的比例，其中胡薄荷酮、薄荷酮和柠檬烯的含量最高，为挥发油的主要药效成分，故本实验选取荆芥挥发油中主要的8种成分作为指标，考察一体化工艺与传统工艺的挥发性成分差异。结果发现，荆芥一体化工艺产品折干后挥发油含油量为1.08%，传统工艺产品折干后挥发油质量分数为0.55%，明显低于一体化工艺产品，所以其胡薄荷酮等8个成分的含量远低于一体化工艺产品。
本课题前期已采用正交实验优化荆芥一体化加工工艺参数（本部分正在申报专利），一体化工艺产品含油量较高是因为只经过一次干燥加工过程，避免了挥发油的流失。挥发油乃热不稳定性成分，重复干燥过程势必会造成其含量的降低。荆芥采收后经产地加工为干燥药材，此时的荆芥叶、穗质地较脆，在包装、运输及饮片加工过程中易脱落造成损失，以致挥发油含量降低。而一体化工艺产品是由荆芥采收后直接切段干燥成饮片，减少荆芥叶、穗在长途运输过程中的脱落损失，保证了饮片质量。此外，传统加工还经过水处理，两个工艺产品的水溶性成分及其他成分是否存在差异还需进一步的研究与探索。
药效研究结果表明，一体化工艺产品的抗炎作用整体上优于传统工艺，结合化学成分比较分析的结果，一体化工艺产品挥发油及其中各个组分的含量均高于传统工艺产品，故推断一体化工艺产品挥发油成分较高与其抗炎效果优于传统工艺产品之间有密切相关性。此外，工业化生产中一体化工艺不仅能够保证饮片质量，更能够提高加工效率，节约时间及人工成本。因此荆芥药材、饮片一体化加工有其一定的可行性及合理性。
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[责任编辑 孔晶晶]
作者：钱岩 于生 单鸣秋 姚卫峰 张丽