论文题目：黄豆黄素诱导人胃癌AGS细胞凋亡机制的研究
摘要：胃癌是一种常发生在人体消化系统上的恶性肿瘤,癌症发病率数据分析表明,每年胃癌新增病例约为100万人。其中,我国胃癌每年新确诊病例约占全球发病病例的百分之五十,对国民生命健康构成了严重危害。黄豆黄素（Glycitein）作为一类主要的非营养素组分普遍存在于大豆的种子、根、茎、叶及其他豆科植物中。黄豆黄素具有多种生物活性,因其表现了良好的活性而受到各国学者关注。但其防癌抗癌作用机制及有效浓度尚未明确。因此,本研究通过食品毒理学,分子生物学和细胞生物学等方法,以黄豆黄素作为研究对象,并以12种人胃癌细胞作为体外研究模型,从细胞及分子水平上,揭示黄豆黄素对胃癌细胞的毒性作用,对正常细胞的毒理作用,周期阻滞,诱导细胞凋亡信号传导途径及其潜在的分子作用机制,为研制治疗胃癌的功能因子和开发新型抗肿瘤功能型食品提供新的思路和理论依据。本实验利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法进行检测黄豆黄素对12种人胃癌细胞的杀伤作用以及对4种人正常细胞的毒理作用;通过Hochest 33342/PI双染色法、Annexin V-FITC/PI双染法、JC-1线粒体膜电位荧光染色法及流式细胞术检测黄豆黄素对人胃癌细胞的诱导凋亡作用;通过流式细胞术、蛋白免疫印迹法检测黄豆黄素对人胃癌细胞内DNA相对含量和细胞周期相关蛋白表达量的调控作用;黄豆黄素对人胃癌细胞内凋亡相关蛋白表达量的调控作用采用蛋白质免疫印迹法进行检测;运用蛋白质免疫印迹法测定黄豆黄素对人胃癌细胞内MAPK/NF-κB/STAT3信号通路蛋白表达量的影响及三者信号通路相互间调节作用;使用DCFH-DA活性氧荧光探针法、流式细胞术及蛋白质免疫印迹法测定黄豆黄素对人胃癌细胞内活性氧水平及信号通路蛋白量的影响。CCK-8实验结果表明,黄豆黄素能够降低12种人胃癌细胞存活率,且呈剂量依赖性。此外,黄豆黄素对人正常胃GES-1细胞、人正常肝QSG-7701细胞、人类正常肺IMR-90细胞和人类正常胚胎肾293-T细胞的杀伤作用均无明显的毒副作用,且明显低于阳性对照5-FU组。Hochest 33342/PI双染色法和Annexin V-FITC/PI双染法结果表明,黄豆黄素处理AGS细胞后,细胞凋亡形态变化明显且凋亡比例不断增加。JC-1线粒体膜电位荧光染色法结果显示,黄豆黄素使AGS细胞内线粒体膜电位下降,通透性增加。此外,黄豆黄素能够显著上调促凋亡蛋白Bax的蛋白表达量,减少抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达量,Caspase-3和PARP被活化,进而触发人胃癌AGS细胞内部凋亡途径。此外,黄豆黄素能够使得人胃癌AGS细胞阻滞在周期的G0/G1期,并伴随有cyclinD1、cyclinE、CDK2/4/6蛋白的表达量下降,P21、P27表达量上升。此外,DCFH-DA活性氧荧光探针法与蛋白免疫印迹法实验结果表明黄豆黄素能够有效上调AGS细胞内活性氧水平,从而增加AGS细胞中p-p38和p-JNK的蛋白表达量,下调p-ERK、NF-κB和p-STAT3蛋白表达量,致使人胃癌AGS细胞发生线粒体依赖凋亡。综合以上结果,黄豆黄素对12种人胃癌细胞具有杀伤作用,其具体作用机制可能是黄豆黄素通过增加人胃癌AGS细胞内活性氧的累积,激活MAPK信号通路,抑制下游STAT3和NF-κB信号通路,促使线粒体膜电位下降,改变凋亡相关蛋白表达量,激活Caspase凋亡级联反应,最终诱导人胃癌AGS细胞发生线粒体依赖性凋亡,本实验结果旨在为研制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。
关键词：黄豆黄素;人胃癌细胞;细胞凋亡;细胞周期阻滞;MAPK/STAT3/NF-κB信号通路
学科专业：食品科学
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 胃癌的研究进展
1.2 胃癌的发病机制
1.2.1 家族遗传因素
1.2.2 性别因素
1.2.3 幽门螺杆菌
1.2.4 生活方式及饮食因素
1.2.5 癌前病变
1.3 胃癌的治疗方法
1.3.1 手术治疗
1.3.2 化学治疗
1.3.3 放射治疗
1.3.4 生物免疫治疗
1.3.5 分子靶向治疗
1.4 细胞凋亡及相关信号转导通路
1.4.1 细胞凋亡
1.4.2 活性氧簇
1.4.3 Mitogen-activated protein kinases (MAPK)信号通路
1.4.4 Signal transducer and activator of transcription (STAT3)信号通路
1.4.5 Nuclear factorκB (NF-κB)信号通路
1.5 大豆异黄酮研究进展
1.5.1 机体内化学动力学
1.5.2 抗骨质疏松,预防骨坏死
1.5.3 降血脂降血糖
1.5.4 抗肿瘤作用
1.5.5 类雌激素和抗雌激素活性
1.6 目的及意义
1.7 实验技术路线
第二章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验细胞系及黄豆黄素标品
2.1.2 主要实验试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.2 细胞的传代培养及体外扩增
2.3 CCK-8 比色法
2.4 Hoechst33342 染色法
2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法
2.6 线粒体膜电位检测法
2.7 DCFH-DA活性氧检测
2.8 蛋白质免疫印迹法
2.9 统计学分析
第三章 结果与分析
3.1 黄豆黄素对人胃癌细胞的杀伤作用及对人正常细胞的毒副作用
3.2 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞的诱导线粒体依赖凋亡作用
3.2.1 Hoechst33342/PI染色法检测细胞凋亡情况
3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况
3.2.3 JC-1 荧光探针法检测细胞线粒体膜电位变化
3.2.4 Western blotting法检测参与细胞凋亡调控蛋白表达量变化
3.3 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞周期调控机制
3.4 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞内MAPK/NF-κB/STAT3 凋亡相关信号通路的调控机制
3.5 黄豆黄素对人胃癌AGS细胞内活性氧(ROS)水平的影响
第四章 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢