论文题目：番茄中SISINA泛素连接酶家族的功能分析及对果实生长发育的影响
摘要：生物技术是现在食品科学发展中最具潜力的技术,其中通过基因工程改良植物的果实产量、品质等已经取得了显著成效,而了解植物生长发育的分子机理对更好的利用基因工程获得高品质的食物具有重要意义。Seven in absentia（SINA）蛋白家族是一类具有泛素连接酶活性的蛋白,在其N端有一个保守的C3H4型RING结构域和两个锌指结构,而C端负责形成二聚体和与底物结合。最近,我们课题组从番茄（Solanum Lycopersicum,l）基因组中发掘出了 6个SINA基因,其中之一被名为SlSINA3,该基因的编码产物为E3泛素连接酶,可以特异的泛素化抗病相关转录因子S1NAC1并促进其降解。在本研究中,我们鉴定了所有6个SlSINA基因和其编码产物的生化特性,并解析了它们在多个生理过程中的作用,包括抗病反应和植物生长发育。生物信息学的分析揭示了 S1SINA1在氨基酸序列上的特异性。通过定量RT-PCR,我们发现在根、茎、叶、花等不同的组织中,所有SlSINA基因的表达水平都受到了不同程度的调控。体外泛素化实验表明所有的SlSINA蛋白都具有依赖于RING结构域的E3泛素酶活性,并且对于E2泛素结合酶的选择具有相似的特异性,其中只有来自番茄体内Ⅱ组的E2才能使所有的SlSINA发挥出活性,这可能也暗示着SlSINA泛素酶在生物体内工作的特性。我们还对这些蛋白进行了亚细胞定位实验,SlSINA1、3、4、5、6同时定位在细胞核与细胞质,而SlSINA2只唯一定位于细胞核。此外,酵母双杂交与免疫共沉淀实验都共同证实,SlSINA可以彼此相互作用形成同源二聚体或异源二聚体。对SlSINA蛋白的功能性研究发现,SlSINA4可以引起类过敏反应的细胞死亡,并且这种特性依赖于其E3泛素活性,而其它的SlSINA蛋白可以抑制过敏反应引起的细胞死亡。这一结果表明SlSINA4在防御信号通路中起到正调控的作用,而其它SlSINA却是负调控因子。通过植物组织培养,我们获得了多个基因的转基因植物,并且,在转基因番茄中,当上调SlSINA2的表达量时,植物的叶片会出现黄化的现象,这说明SlSINA2参与调控叶绿素的合成;而在过表达SlSINA5的植物中,花的结构会出现变化,柱头伸出雄蕊外,意味着SlSINA5在花的发育中发挥重要的作用。作为E3泛素连接酶,SlSINA可能通过调节一些蛋白的稳定性,参与植物生命活动。在本研究中,我们发现番茄抗逆转录因子SlNAC4可以被SlSINA4识别并降解,并且过表达SlNAC4的番茄果实明显变小,而且植株的生长也会受到抑制,严重影响到果实的产量。
关键词：基因工程;食品科学;番茄;果实;Seven in absentia;转录因子
学科专业：食品科学
致谢
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
1.1 生物技术在食品科学发展中的应用
1.2 生物技术在番茄改良中的应用
1.3 果实的生长发育简介
1.4 蛋白泛素化的机制和在植物生长发育过程中的作用
1.4.1 蛋白泛素化的过程
1.4.2 泛素系统相关酶的研究
1.4.3 泛素化在植物生长发育过程中的作用
1.5 SINA蛋白的发现与研究进展
1.6 植物的抗病系统
1.7 研究目标与意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 植物材料
2.1.2 主要试剂、耗材
2.1.3 质粒材料
2.1.4 实验所有菌株
2.1.5 实验所用引物
2.1.6 仪器设备
2.2 常用试剂、缓冲液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 序列比对与进化树分析
2.3.2 植物RNA提取和反转录合成cDNA
2.3.3 定量PCR
2.3.4 分子克隆步骤
2.3.5 化学感受态细胞的制备
2.3.6 电转化感受态细胞的制备
2.3.7 大肠杆菌重组蛋白表达、提取与纯化、脱盐与浓缩
2.3.8 体外泛素化分析
2.3.9 农杆菌介导烟草瞬时表达系统
2.3.10 烟草表达样品的蛋白提取
2.3.11 蛋白印迹(Western Blotting)
2.3.12 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
2.3.13 激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白
2.3.14 酵母双杂交实验
2.3.15 病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene-silencing,VIGS)
2.3.16 农杆菌转化法培育转基因番茄植株
2.3.17 转基因植株的阳性鉴定
第三章 实验结果与分析
3.1 番茄SlSINA蛋白家族的生物信息学分析
3.1.1 生物信息学简介
3.1.2 分析步骤
3.1.3 结果与结论
3.2 SlSINA基因的表达模式
3.2.1 SINA表达水平的研究现状
3.2.2 实验过程
3.2.3 结果与结论
3.3 SlSINA蛋白是具有泛素活性的E3连接酶
3.3.1 SINA E3活性的研究进展
3.3.2 实验过程
3.3.3 结果与结论
3.4 SlSINA泛素活性需要完整的RING-domain
3.4.1 E3活性的背景介绍
3.4.2 实验过程
3.4.3 结果与结论
3.5 SlSINA蛋白在泛素化过程中对E2的特异性选择
3.5.1 E2-E3结合简介
3.5.2 实验过程
3.5.3 结果与讨论
3.6 SlSINA的RING结构域突变体不具有显性抑制特性
3.6.1 背景介绍
3.6.2 实验设计
3.6.3 结果与讨论
3.7 SlSINA蛋白的亚细胞定位
3.7.1 SINA亚细胞研究进展
3.7.2 实验过程
3.7.3 结果与结论
3.8 SlSINA蛋白的相互作用
3.8.1 背景介绍
3.8.2 实验过程
3.8.3 结果与讨论
3.9 SlSINA4引起植物细胞死亡
3.9.1 研究背景
3.9.2 实验过程
3.9.3 结果与讨论
3.10 SlSINA4引起的细胞死亡与SGT1有关
3.10.1 植物细胞死亡简介
3.10.2 实验过程
3.10.3 结果与讨论
3.11 SlSINA1、2、3、5、6在防御反应中具有负调控的作用
3.11.1 植物防御反应简介
3.11.2 实验过程
3.11.3 结果与讨论
3.12 SlSINA4可以降解番茄NAC转录因子SlNAC4
3.12.1 NAC转录因子简介
3.12.2 实验过程
3.12.3 结果与讨论
3.13 SlNAC4的过表达引起多种性状的改变
3.13.1 番茄中NAC研究现状
3.13.2 实验过程
3.13.3 结果与讨论
3.14 过表达SlSINA2导致番茄叶片发黄,植株生长迟缓
3.14.1 植物SINA转基因的研究
3.14.2 实验过程
3.14.3 结果与讨论
3.15 SlSINA5在番茄花的发育中发挥作用
3.15.1 番茄花器官概述
3.15.2 实验过程
3.15.3 结果与讨论
第四章 讨论
第五章 总结与展望
参考文献