论文题目：PPRV N、C蛋白单克隆抗体的制备及C基因沉默的重组病毒拯救
摘要：小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的主要感染山羊和绵羊的急性传染病,因其高发病率和高死亡率,给养羊业带来巨大危害。PPR目前无特效治疗药物,接种仅有的弱毒疫苗是主要预防措施,但弱毒疫苗存在稳定性差、安全性低,无法区分动物是野毒感染还是疫苗株免疫（Differentiate between infected and vaccinated animals,DIVA）等不足。PPRV基因组可编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白C和V,C蛋白与病毒的复制和致病性密切相关,但机制仍不清楚。利用反向遗传学技术构建全长c DNA感染性克隆进行重组病毒拯救是制备标记疫苗的有效策略,同时也为开展病毒致病机制深入研究提供了一种有用工具。本文在前期研究基础上运用小鼠脾细胞和骨髓瘤（SP2/0-Ag14）细胞融合技术制备了抗PPRV N蛋白和C蛋白单克隆抗体（Monoclonal antibody,Mc Ab）;运用基因定点突变和重叠延伸PCR技术从项目组前期构建的PPRV Nigeria 75/1疫苗株全长基因组c DNA感染性克隆质粒构建了C基因沉默表达的全长c DNA感染性克隆p Bluescript SK-PPRV-△C,并在BSR T7/5细胞和山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）中拯救出突变重组病毒。获得以下研究结果:1.根据PPRV C蛋白和N蛋白基因编码多肽链氨基酸序列,预测C蛋白优势抗原表位为25-44 20mers,N蛋白优势抗原表位454-472 19mers。人工合成N、C蛋白抗原肽,并与载体蛋白（钥血孔蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin,KLH）和生物素蛋白（Biotin））交联制备获得各两条抗原肽（N-KLH-CRSGKPRGETPGPL LPEIMQ,N-Biotin-RSGKPRGETPGPLLPEIMQ;C-KLH-PLRAGERGLAPQAVQ HRTLIK,C-Biotin-PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK）。2周一次,共3次免疫小鼠5只,三免后第30天冲击免疫。间接ELISA检测免疫血清效价,半数小鼠免疫血清效价达62500以上。将效价较高的小鼠脾细胞和SP2/0-Ag14细胞融合,HA T选择培养基选择培养,间接ELISA分别筛选出N蛋白阳性杂交瘤细胞株36株和C蛋白阳性杂交瘤细胞株38株,有限稀释法克隆筛选分别获得稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3株、分泌抗C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2株,经免疫印迹（WB）和间接免疫荧光（IFA）鉴定,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。2.以p Bluescript SK-PPRV为基础,将C基因的起始密码子由AUG突变为ACG,并在氨基酸序列的第9位、第12位引入终止密码子,SOE PCR构建C基因突变的全长c DNA感染性克隆质粒p Bluescript SK-PPRV-△C。测序结果表明,突变全长c DNA感染性克隆质粒序列与原始毒株基因组序列同源性达98%。3.根据N、P、L蛋白在PPRV m RNA合成中的功能及BSR T7/5细胞生长特性,优化全长及三种辅助质粒pc DNA3.1-N、pc DNA3.1-P、pc DNA3.1-L的转染比例为4:2:1:1。将p Bluescript SK-PPRV（4μg）与p Bluescript SK-PPRV-△C（4μg）及辅助质粒pc DNA3.1-N（2μg）、pc DNA3.1-P（2μg）、pc DNA3.1-L（1μg）分别共转染表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞48 h以拯救r PPRV和r PP RVΔC,RT-PCR检测表明BSR T7/5细胞总RNA中无辅助质粒残留,r PPRV和r PPRV-ΔC转染细胞中扩增出1578 bp N基因、1530 bp P基因和2539 bp L基因片段;WB检测到r PPRVΔC转染细胞中N蛋白表达。IFA鉴定进一步表明r PPRV-ΔC在BSR T7/5细胞中成功拯救,可观察到特异性免疫荧光,但r PPRV未获得拯救。重组病毒在EECs细胞中能连续传代至P4代,未见CPE。RT-q PC R检测表明随着亲本PPRV和r PPRV-ΔC在感染EEC细胞中传代次数增加,亲本PPRV N基因表达增强,而r PPRV-ΔC N基因表达呈降低趋势。研究结果为进一步研究PPRV非结构蛋白C致病机理奠定了基础,也为利用反向遗传学技术构建PPRV标记疫苗提供了基础材料。
关键词：N蛋白;C蛋白;单克隆抗体;反向遗传系统;重组病毒;PPRV
学科专业：预防兽医学
项目基金来源
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 文献综述
1 PPRV研究进展
1.1 病毒的基因组结构及功能
1.2 病毒的复制
1.3 病毒的流行
2 PPRV反向遗传系统的研究进展
2.1 PPRV反向遗传系统
2.2 反向遗传系统在PPRV中的应用
2.2.1 致病机制研究进展
2.2.2 疫苗研究进展
3 研究目的和意义
第二章 PPRV N、C蛋白单克隆抗体的制备
1 前言
2 材料与方法
2.1 试剂、材料及配制方法
2.1.1 毒株、细胞和实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验器材
2.1.4 试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 C蛋白抗原表位的预测
2.2.2 免疫原的制备
2.2.3 小鼠免疫
2.2.4 免疫血清效价的测定
2.2.5 细胞融合
2.2.6 阳性杂交瘤的筛选
2.2.7 单克隆抗体的筛选
2.2.8 细胞建株
2.2.9 WB检测单克隆抗体特异性
2.2.10 间接免疫荧光(IFA)鉴定单克隆抗体病毒反应性
2.2.11 数据统计学分析
3 结果
3.1 C蛋白抗原表位预测结果
3.1.1 氨基酸序列特异性与保守性分析
3.1.2 基因序列特异性与保守性分析
3.1.3 跨膜结构域分析
3.1.4 亲疏水性预测
3.1.5 二级结构预测
3.2 免疫血清效价测定
3.3 阳性杂交瘤的筛选结果
3.3.1 阳性杂交瘤初筛
3.3.2 阳性杂交瘤复筛
3.4 单克隆抗体的筛选结果
3.4.1 单克隆抗体初筛
3.4.2 单克隆抗体复筛
3.5 杂交瘤细胞系的建立
3.6 WB检测单克隆抗体特异性
3.7 间接免疫荧光(IFA)鉴定单克隆抗体病毒反应性
4 讨论
5 小结
第三章 C基因沉默的PPRV感染性克隆的构建及重组病毒拯救
1 前言
2 材料与方法
2.1 实验耗材、试剂及试剂配制方法
2.1.1 细胞、毒株和质粒
2.1.2 试剂
2.1.3 器材
2.1.4 试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 C基因沉默的PPRV感染性克隆的构建
2.2.3 重组病毒的拯救
2.2.4 重组病毒的鉴定
3 实验结果
3.1 C基因沉默的PPRV感染性克隆的构建
3.1.1 替换片段的扩增
3.1.2 C基因沉默的全长质粒的酶切鉴定
3.2 重组病毒的鉴定
3.2.1 重组病毒N、P、L2基因鉴定结果
3.2.2 WB检测重组病毒N、C蛋白
3.2.3 重组病毒的间接免疫荧光分析
3.2.4 重组病毒感染EECs细胞CPE观察
3.2.5 RT-q PCR分析病毒体外复制效率
4 讨论
5 小结
第四章 全文结论
参考文献
致谢