论文题目：KCTD9分子在NK细胞的发育和功能中的作用的研究
摘要：研究背景及目的自然杀伤细胞（natural killer cell,NK细胞）是天然免疫系统的效应细胞,在抵御病原入侵以及抗肿瘤中至关重要。NK细胞因其无需预刺激即可杀伤细胞的特点受到关注,而后经过40余年的研究,人们逐渐认识到NK细胞的免疫学功能非常广泛。NK细胞除有强大的杀伤功能外,还能通过分泌细胞因子实现调节功能。近年还发现,NK细胞也有抗原递呈、记忆功能以及组织修复功能[1,2]。了解NK细胞的发育分化途径是认识NK细胞的根本。尽管有文献报道,在胸腺、淋巴结或肝脏等器官中NK细胞也可发育成熟[3-5],但通常认为骨髓是NK细胞最主要的发育场所,目前对小鼠NK细胞发育的认知主要建立在骨髓来源的NK细胞的研究上。在骨髓里,造血干细胞（Haematopoietic stem cell,HSC）分化为早期淋巴前体细胞（Early lymphoid progenitor,ELP）,进一步分化为共同淋巴组细胞（common lymphoid progenitor,CLP）。CLP分化产生NK系定向祖细胞,已知最早的是pre-pro NK,Pre-pro NK进而分化为NK前体细胞（NK progenitor,NKP）。随着深入研究发现,传统定义的NKP异质性太高,只有1/12的比例是特异发育为NK的。再有研究又定义出更特异的NK前体细胞r NKp（refined-NKP）[6,7]。NKP/rNKP分化而来的未成熟NK细胞（imature NK,iNK）继续在骨髓中或者进入外周器官,再发育为成熟NK细胞（mature NK,mNK）。NK细胞的成熟主要指获得细胞因子分泌（如IFN-γ、TNF-α）及杀伤等功能,伴随着NK细胞受体（如NKG2A、NKG2D、NKp46、Ly49）及表面标志的变化。NK前体细胞继续发育而表达NK1.1,成为未成熟NK（iNK）细胞,iNK进一步发育为成熟（mNK）细胞[1]。检测C57BL/6J小鼠NK细胞是用抗CD3和NK1.1抗体,在本研究中使用了Balb/c小鼠中,对该种系小鼠NK细胞的鉴定是通过检测DX5表达[8,9]。根据表型对NK细胞的成熟过程划分阶段,对于小鼠NK细胞,基于CD11b和CD27分子表达的划分标准最为公认。小鼠的NK细胞从不成熟到成熟其发育依次经历CD11b-CD27-,CD11b-CD27+,CD11b+CD27+,CD11b+CD27-四个阶段,而CD11b的表达标志着NK细胞成熟。因此CD11b-NK细胞为iNK细胞,CD11b+NK细胞为mNK细胞。未成熟NK细胞发育到成熟NK细胞过程中,细胞因子的分泌能力下降,增殖潜能逐渐丧失,但是对靶细胞的杀伤能力增强[10,11]。NK细胞发育分化的核心问题是寻找决定CLP向NK定向发育的转录因子。既往研究通过细胞转录组和蛋白组水平检测,辅以敲除小鼠验证,已经发现了一系列决定NK发育分化的重要转录因子。E4BP4又称NFIL3,是目前已知唯一的NK细胞特异性转录因子,可能在CLP向NKP发育以及iNK向mNK成熟过程中均发挥了重要作用[12-14]。GATA3是T细胞向Th2方向分化的关键转录因子,近来研究发现,其对NK细胞和其他固有淋巴细胞（innate lymphoid cell,ILC）的发育也有重要作用,但GATA3在调控NK细胞发育中的具体靶点和作用阶段尚不明确[15-17]。ID2是调节iNK向mNK细胞分化的关键转录因子:ID2的缺陷并不影响NKP和iNK细胞,但NK细胞停止在iNK阶段[1,14]。T-bet和Eomes是转录因子T-box家族的成员,是NK细胞发育成熟的重要调控因子,分别调控NK细胞成熟中的不同关卡。T-bet主要调控NK细胞前体向iNK的分化,因为T-bet缺失导致小鼠iNK细胞减少。iNK向mNK成熟的环节需要Eomes,因为Eomes缺失使得NK细胞发育停滞在iNK阶段[3,18,19]。NK细胞的效应功能也受细胞因子和转录因子的调控。病毒感染时,机体环境中的炎性因子作用于NK细胞,经过信号转导,引起NK细胞杀伤靶细胞及分泌IFN-γ。病毒感染时,Ⅰ型干扰素通过下游的STAT1转录因子增强NK细胞的杀伤能力,同时保护活化NK免于凋亡。小鼠巨细胞病毒（mouse cytomegalovirus,MCMV）感染模型中,IL12可以通过下游的STAT4转录因子促进NK细胞分泌IFN-γ,并促进NK细胞增生和产生免疫记忆[2]。NK细胞获得最大的杀伤能力需要核因子Ah R的参与。C/EBP或MITF缺失的NK细胞,其杀伤能力和分泌IFN-γ下降[2,20]。一些调控NK细胞发育和成熟的转录因子也对NK细胞的功能有影响。FOXO1缺失的NK细胞在MCMV感染应答中分泌IFN-γ增多,对B16F10细胞系成瘤的抗性增强。BL1MP1和AIOLOS敲除小鼠对B16F10细胞系成瘤的抗性也增强。与之相反,MEF可正性调控NK细胞分泌IFN-γ及表达穿孔素,故而MEF敲除小鼠对于成瘤的抗性减弱。在IRF2敲除鼠及NK细胞特异性GATA3敲除鼠中也观察到了IFN-γ的分泌降低,而细胞杀伤未受影响[1]。这些研究表明,NK细胞的发育、成熟以及正常功能的发挥是多层面的精细调控过程。尽管近些年对于NK系的分化发育及成熟阶段的划分有较大进展,但由于NK细胞发育分化的转录调控的研究起步较晚,尚缺乏NK细胞特异性的转录因子的发现。且多种转录因子之间的相互关联,如何共同确保NK系稳态尚不清楚。进一步的研究仍需结合NK发育阶段表型变化及转录水平变化,寻找出NK细胞发育定向的关键分子[14]。随着NK细胞新功能的不断发现,NK细胞抗感染、抗肿瘤及在自身免疫疾病方面的研究取得重要进展。本实验室前期研究发现,NK细胞通过介导肝细胞损伤,在HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF）以及MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎（fulminant hepatic failure,FHF）病程中发挥重要作用[21]。在本实验室的前期重型肝炎研究过程中,利用人全转录组芯片技术分析了重型乙型肝炎患者和轻中度慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞（PBMC）的基因差异表达谱,找到了在重型肝炎中高表达的263种基因。其中,Kctd9在重型肝炎中高表达,较轻型肝炎中上调6倍。后续的大样本检测证实了该结果的可靠性。进一步研究发现,HBV-ACLF患者NK细胞中KCTD9分子表达增高,且NK细胞KCTD9高表达与肝损伤程度呈正相关。细胞实验也证明,NK92细胞系过表达KCTD9蛋白后,活性增强,提示KCTD9分子参与调控NK细胞的活化和功能[22]。KCTD9分子是KCTD（potassium channel tetramerizationdomain）家族26个成员中的一个,这些蛋白均有钾离子通道T1结构域,因而得名,但并不形成通道,大多功能不明。对该家族分子的结构分析发现,在KCTD家族分子中,KCTD9分子具有独特的五肽重复结构域（pentapeptide repeats）,而真核细胞基因组中仅存在一个编码五肽重复结构域的基因,从而推测KCTD9分子具有独特功能[23]。研究发现,KCTD9分子与泛素连接酶亚基Cullin3（Cul3）分子亲和力高,其T1结构域中的BTB结构域可与Cul3相结合,且电镜下观察到了KCTD9/Cul3复合物[24]。Cul3在泛素化途径中至关重要,且已有研究证明KCTD家族中多种分子通过BTB结构域与Cullin结合,作为其接头分子参与底物的泛素化[23,25],故认为KCTD9也是Cul3的接头蛋白,参与泛素化途径[24]。另有文献报道,在用Y2H筛选方法鉴定与甲型流感病毒核蛋白（NP）结合的人类宿主蛋白时,发现KCTD9可与NP结合[26]。独特的结构及少量研究结果提示KCTD9分子在细胞生物学中可能有重要的功能。但对于KCTD9分子的功能缺乏研究,除了本实验室的前期研究,未见其它报道。为了探索KCTD9分子的生物学功能,也为了进一步寻找调控NK细胞的关键分子,我们观察分析了kctd9基因敲除（kctd9-/-）小鼠和野生基因型（wild-type,WT）小鼠在NK细胞的发育成熟以及分泌、杀伤效应方面的差异,以明确KCTD9分子在NK细胞的发育成熟,及功能中的作用。研究方法利用流式细胞术,检测1.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠骨髓中的NK前体细胞及NK细胞数;野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠的NK细胞表面受体（NCR）的表达2.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠的骨髓及外周器官（脾脏、肝脏、淋巴结）中NK细胞CD11b/CD27分群3.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠的NK细胞的细胞因子分泌能力:IFN-γ4.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠的NK细胞的杀伤相关功能:Granzyme B的诱导表达、脱颗粒,以及对敏感靶细胞的杀伤5.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠的NK细胞的稳态增殖状态和细胞因子诱导下的增殖能力6.野生基因型小鼠与kctd9-/-小鼠NK前体细胞及NK细胞中转录因子的水平实验结果1.Kctd9基因敲除后,NK系的发育受阻1.1 Kctd9-/-小鼠骨髓中NK前体细胞rNKP细胞减少分离野生基因型Balb/c和kctd9-/-小鼠的骨髓细胞,流式细胞术检测其中的CLP、pre-NKP、rNKP细胞,计算总数。与野生基因型相比,kctd9-/-小鼠骨髓中的rNKP占Lin-CD27+CD244+CD127+细胞群体的比例下降（16.85±1.076%vs.27.75±1.993%,P=0.0003）,rNKP绝对细胞数明显减少（4409±406.9 vs.8875±734.9,P=0.0001）。至于pre-NKP、CLP的细胞数,kctd9-/-小鼠与野生基因型小鼠之间无统计学差异。1.2 Kctd9-/-小鼠骨髓中NKP、iNK、mNK细胞减少分离野生基因型Balb/c和kctd9-/-小鼠的骨髓细胞,流式细胞术检测其中的NKP、iNK、mNK,计算总数。相较于野生基因型,kctd9-/-小鼠的NKP绝对细胞数下降（12887±691.9 vs.16037±463.7,P=0.0036）,iNK,mNK均减少（iNK 79784±5911 vs.107093±6959,P=0.0135;mNK 33107±3896 vs.63532±4357,P=0.0003）。1.3 Kctd9-/-小鼠骨髓中NK细胞的NCR表达下降分离野生基因型Balb/c和kctd9-/-小鼠的骨髓细胞,流式细胞术检测其中的NK细胞表面几种NCR的表达。Kctd9-/-NK细胞表达Ly49C/I、NKG2A、NKp46的比例低于野生型NK细胞（Ly49C/I 19.58±1.109%vs.22.93±0.7215%,P=0.0445;NKG2A29.85±0.7577%vs.39.88±1.396%,P=0.0007;NKp46 48.25±1.623%vs.60.15±1.501%,P=0.0017）。而两种基因型小鼠NK细胞Ly49G、KLRG1的表达无统计学差异。2.Kctd9-/-小鼠NK细胞成熟受抑制2.1 Kctd9-/-小鼠骨髓中成熟和终末期成熟NK亚群比例下降,外周器官中终末期成熟NK细胞减少分离野生基因型Balb/c和kctd9-/-小鼠的骨髓、淋巴结细胞,脾脏和肝脏淋巴细胞,流式细胞术检测其中的NK细胞CD11b/CD27的表达。分析两种小鼠四种组织中NK细胞CD11b/CD27分群比例的差异。Kctd9-/-小鼠骨髓中NK细胞中CD11b+CD27+、CD11b+CD27-亚群,即成熟和终末期成熟NK细胞比例均低于野生基因型小鼠（CD11b+CD27+11.5±0.1528%vs.16.2±0.8622%,P=0.0058;CD11b+CD27-23.8±0.4583%vs.33.03±1.625%,P=0.0054）。Kctd9-/-小鼠外周器官NK细胞中,CD11b+CD27-亚群比例均较野生基因型小鼠降低（脾脏42.6±1.845%vs.56.8±0.723%,P=0.0020;肝脏43.43±1.683%vs.54.67±1.507%,P=0.0076;淋巴结11.97±0.3667%vs.22.47±0.8969%,P=0.0004）。Kctd9-/-小鼠骨髓、脾脏NK细胞中,最不成熟CD11bCD27-亚群和不成熟CD11b-CD27+亚群比例均高于野生基因型小鼠（骨髓CD11bCD27-32.97±0.348%vs.26.17±0.4333%,P=0.0003;骨髓CD11b-CD27+31.77±0.636%vs.24.63±1.126%,P=0.0053;脾脏CD11b-CD27-10.23±0.08819%vs.7.967±0.4333%,P=0.0069;脾脏CD11b-CD27+21.83±1.033%vs.12.2±0.3512%,P=0.0009）。Kctd9-/-小鼠肝脏和淋巴结NK细胞中不成熟CD11b-CD27+亚群比例高于野生基因型小鼠（肝脏19.97±0.6009%vs.11.17±0.7535%,P=0.0008;淋巴结49.17±0.7623%vs.36.07±0.2728%,P＜0.0001）。2.2 Kctd9-/-小鼠NK细胞CD11b+:CD11b-比值下降根据NK细胞CD11b/CD27划分的四亚群数据,计算各器官中NK细胞中CD11b+与CD11b-比例的比值,以反映成熟度。敲除Kctd9后,小鼠骨髓、脾脏、肝脏、淋巴结四种器官,该比值均低于野生基因型小鼠（骨髓0.5667±0.03333 vs.0.9667±0.03333,P=0.0011;脾脏2.1±0.1155 vs.3.967±0.2028,P=0.0013;肝脏1.933±0.1453 vs.3.233±0.348,P=0.0261;淋巴结0.7333±0.03333 vs.1.067±0.06667,P=0.0111）。2.3 Kctd9-/-小鼠外周器官CD11b+mNK细胞中CD27-:CD27+比值下降计算CD11b+mNK细胞中,CD27-与CD27+比例的比值,以反映NK细胞的终末成熟情况。实验结果表明,kctd9-/-小鼠外周器官NK细胞的该比值均低于野生基因型小鼠（脾脏1.667±0.1333 vs.2.433±0.03333,P=0.0051;肝脏1.933±0.08819 vs.2.6±0.1,P=0.0075;淋巴结0.4±0 vs.0.8±0.05774,P=0.0023）。3.Kctd9-/-NK细胞分泌IFN-γ的能力下降低浓度细胞因子（（IL12 1ng/ml+IL18 10ng/ml）或（IL12 5ng/ml+IL18 10ng/ml））刺激6小时,流式检测NK细胞胞内IFN-γ水平。结果显示,kctd9-/-小鼠IFN-γ+NK细胞比例低于野生基因型小鼠（（IL12 1ng/ml+IL18 10ng/ml）29.73±0.6223%vs.40.65±3.75%,P=0.0116,（IL12 5ng/ml+IL18 10ng/ml）38.7±0.4916%vs.51.4±2.7%,P=0.0022）,且阳性细胞的平均荧光强度（MFI）亦低于野生基因型小鼠（（IL121ng/ml+IL18 10ng/ml）454.5±10.53 vs.546.5±31.5,P=0.0210,（IL12 5ng/ml+IL1810ng/ml）545.5±12.48 vs.724.5±28.5,P=0.0022）。4.Kctd9-/-NK细胞杀伤功能减弱4.1 Kctd9-/-NK细胞Granzyme B的合成下降分别纯化野生基因型和kctd9-/-小鼠脾脏NK细胞,在含IL15（20ng/ml）培养基中诱导24小时,流式细胞术检测Granzyme B的水平。结果显示,kctd9-/-小鼠的NK细胞Granzyme B阳性率低于野生基因型（54±4.105%vs.71.8±2.178%,P=0.0186）,且阳性细胞的MFI亦低于野生型（733.3±42.4 vs.922.3±46.93,P=0.0404）。4.2 Kctd9-/-NK细胞脱颗粒下降野生基因型和kctd9-/-小鼠脾脏细胞,经细胞因子（IL12 10ng/ml+IL18 10ng/ml）刺激6小时,流式检测NK细胞表面CD107a水平。Kctd9-/-小鼠NK细胞CD107a+比例低于野生基因型小鼠（7.367±0.5044%vs.11.53±1.091%,P=0.0257）。4.3 Kctd9-/-NK细胞的细胞杀伤减弱纯化的野生基因型和kctd9-/-小鼠脾脏NK细胞,分别以不同效靶比（20:1,10:1,5:1,2:1）与Yac-1细胞共培养4小时,流式检测Annexin V+Yac-1细胞比例。结果显示,KCTD9分子缺失后,各效靶比的Yac-1凋亡比例均较野生基因型降低（20:1比例71.03±2.571%vs.84.5±2.4%,P=0.0375;10:1比例62.57±1.763%vs.71.53±1.703%,P=0.0216,5:1比例46.27±1.484%vs 64.1±1.557%,P=0.0012,2:1比例26.83±1.184%vs.34.5±1%,P=0.0204）。5.Kctd9-/-NK细胞增殖能力增强5.1 Kctd9-/-NK细胞在稳定状态下增殖更活跃检测野生基因型和kctd9-/-小鼠骨髓NK细胞的增殖标志Ki67分子。结果显示,kctd9-/-小鼠NK细胞处于增殖期的比例略高于野生基因型小鼠（43.6±1.041%vs.38.87±0.8212%,P=0.0234）。而且,kctd9-/-小鼠iNK和mNK亚群的增殖比例也分别较野生基因型小鼠略高（iNK 49.73±0.5925%vs.45.3±1.358%,P=0.0402,mNK38.35±1.15%vs.33.13±0.9262%,P=0.0382）5.2 Kctd9-/-NK细胞在细胞因子刺激条件下增殖更活跃纯化的野生基因型和kctd9-/-小鼠脾脏NK细胞,预染CFSE后,于含50ng/ml IL15培养基中培养72小时,流式检测NK细胞的绿色荧光强度,荧光减弱的即分裂后的子代细胞。结果显示,kctd9-/-小鼠NK细胞增殖比例高于野生基因型小鼠（56.03±0.696%vs.50.47±0.7965%,P=0.0062）。且kctd9-/-小鼠iNK和mNK亚群的增殖比例也均高于野生基因型小鼠（iNK 63.77±1.065 vs.59.4±0.6658,P=0.0254,mNK 38.23±0.9025vs.22.43±0.9404,P=0.0003）。6.Kctd9-/-NK前体细胞及NK细胞中Eomes水平下降流式细胞术检测野生基因型和kctd9-/-小鼠骨髓rNKP和NK细胞的Eomes表达。相较于野生基因型,kctd9-/-rNKP细胞中Eomes表达水平降低（1535±60.56 vs.1835±80.24,P=0.0389）。Kctd9-/-NK细胞中Eomes水平也低于野生基因型（1023±17.5 vs.1365±75.39,P=0.0399）。Kctd9-/-NK中CD11b+CD27+、CD11b+CD27-亚群Eomes水平低于野生基因型（CD11b+CD27+1690±17 vs.2197±76.88,P=0.0119;CD11b+CD27-1014±109 vs.1421±81.33,P=0.0429）。结论1.与野生基因型小鼠相比,kctd9-/-小鼠骨髓中NK前体rNKP、NKP细胞减少,iNK、mNK细胞减少,NK细胞Ly49C/I、NKG2A及NKp46的表达比例下降,提示KCTD9分子作用于NK发育的早期,KCTD9分子促进NK细胞的发育。2.与野生基因型小鼠相比,kctd9-/-小鼠骨髓及各外周器官（脾脏、肝脏、淋巴结）NK中终末成熟期CD11b+CD27-亚群比例均下降,CD11b+NK:CD11b-NK的比值均减小,外周器官CD11b+NK细胞中CD27-:CD27+的比值均减小,说明KCTD9分子缺失导致NK细胞成熟受阻。KCTD9分子在各器官iNK细胞向mNK的成熟,及外周器官NK细胞的终末成熟中发挥促进作用。3.Kctd9-/-NK细胞与野生基因型相比,受IL12/IL18刺激后,产生IFN-γ的细胞比例和IFN-γ强度均下降,说明KCTD9分子参与维持细胞因子诱导的NK细胞的分泌功能。4.Kctd9-/-NK细胞与野生基因型相比,在IL15诱导下,表达Granzyme B的比例和表达强度下降,IL12/IL18刺激后脱颗粒的细胞比例下降,对Yac-1细胞的直接杀伤减弱,说明KCTD9分子对NK细胞杀伤有正性调控作用,且很可能是通过调控Granzyme B合成和脱颗粒过程实现的。5.Kctd9-/-小鼠骨髓稳定状态下NK细胞的增殖期比例略高于野生基因型小鼠,而且iNK和mNK亚群的增殖比例也均略高。Kctd9-/-脾脏NK细胞于体外IL15刺激下增殖率也高于野生基因型,iNK、mNK也均如此。说明KCTD9分子负性调控NK细胞的增殖。进而也说明kctd9-/-小鼠骨髓中NK系的细胞数目的减少,并非增殖下降所致,而是NK系分化发育受抑制的结果。6.Kctd9-/-小鼠骨髓的NK前体细胞及NK细胞的Eomes水平下降,表明KCTD9分子能够调节Eomes的表达,可能通过Eomes调控NK细胞的发育成熟和功能。
关键词：自然杀伤细胞;KCTD9;发育;功能;CD11b;CD27
学科专业：感染病学
中文摘要
Abstract
1 第一部分 KCTD9分子在NK细胞的发育和成熟中的作用
1.1 前言
1.2 材料与方法
1.3 结果
1.4 讨论
1.5 参考文献
2 第二部分 KCTD9分子参与调控NK细胞的功能
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.3 结果
2.4 讨论
2.5 参考文献
全文小结
综述
参考文献
致谢