论文题目：健康成年人短期PM2.5暴露的代谢特征研究及中医药干预探索
摘要：背景:PM2.5（空气动力学直径＜2.5μm的颗粒物）是研究最充分的空气污染形式,其化学成分复杂,因巨大的表面积吸附,较粗颗粒物对健康的影响更大。中国是世界上最大的人为空气污染排放国之一,室外空气污染水平位居世界前列。PM25是我国的主要空气污染物。复杂的PM2.5组成介导了氧化应激、遗传毒性、炎症反应以及免疫失衡等机制,对人体造成健康损害。碳质气溶胶在城市污染大气中占PM2.5主要部分,并且贡献了更多的健康损害（20-50%）。碳质气溶胶中有机气溶胶主要来自挥发性有机化合物（VOCs）的一次来源和二次转化,因此VOCs作为二次有机气溶胶的重要前体,OC的重要组成部分,其病理特性及代谢机制也是PM2.5研究中重要的一环。此外,中医药复方具有多靶点、患者接受度高、副作用小等优势,可以通过减少氧化应激、抗炎反应以及调节免疫失衡达到防治PM2.5健康损害的作用,但是目前中药复方临床运用防治雾霾致肺损伤尚属于探索阶段,缺乏评价机制效应的生物监测指标。课题组基于前期观察及网络药理学分析认为科室自拟方清肺降霾汤可能具有减少雾霾健康的生物学效应,但具体效果尚不明确。代谢组学是探索生物小分子代谢变化的重要技术方法,PM2.5暴露生物样本中测量出的大量化学物质填补了基因组和环境相互作用之间的空白。代谢组学在PM2.5研究中的应用有助于研究人员更加广泛地认识蛋白质响应环境暴露而发生的变化,从而确定PM2.5暴露的潜在生物标志物和代谢途径,为相关机制研究提供更多线索。目的:研究一以健康受试者作为研究对象,采用便携式空气净化器构建自然暴露-净化-再暴露-再净化的干预模型,结合靶向尿液巯基尿酸检测与基因组学,全面理解并探索VOCs尿液代谢物巯基尿酸的代谢特征。研究二设计一项随机对照单盲试验,以筛选出的尿液巯基尿酸作为PM2.5暴露的生物检测指标,对中药复方清肺降霾汤干预雾霾暴露的科学性进行临床验证,拓展中药复方在防治PM2.5相关健康损害方面的应用。研究三对研究一试验设计中的尿液样本进行非靶向代谢组学分析,绘制PM2.5尿液代谢谱,为认识及科学防治PM2.5提供更多可能性。方法:研究一基于靶向代谢组学对50例健康受试者尿液中5种目标巯基尿酸进行定量分析,并观察其在自然暴露-净化-再暴露-再净化的试验模型中的变化趋势。使用Sequenom MassARRAY平台对47个基于前期工作筛选的SNP进行了引物延伸质谱基因分型,结合以上两部分数据探讨SNP与MAs代谢的相关性,并进行KEGG基因-功能分析。研究二纳入不吸烟的健康受试者84名,在细颗粒污染期间开展为期7天的随机对照单盲试验,比较干预前后尿液中巯基尿酸代谢水平,评价清肺降霾汤在防治雾霾健康损伤方面的临床应用价值。研究三对50人5个时间点的尿液采集进行GC-MS非靶向代谢组分析,通过总体样本PCA、有监督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）更好地区分代谢差异,进行代谢轮廓分析。根据OPLS-DA模型计算第一主成分差异权重贡献值（VIP）,t检验计算每个代谢物在组间半定量分析中的FDR（False positive rate）P值,确定组间差异代谢物,并进行KEGG代谢通路富集分析。利用获得的代谢组学数据可构建ROC曲线用于筛选临床样本与PM2.5暴露相关的潜在生物标志物并进行SMPDB富集分析。通过筛选代谢趋势相反的差异代谢物进一步筛选PM2.5相关差异代谢物,用以PM2.5短期暴露的生物标志物。结果:研究一通过比较不同时间点尿液巯基尿酸的代谢变化,发现室外空气污染（PM2.5）暴露与 5 种目标巯基尿酸（CEMA、SPMA、HMPMA、HPMA、HEMA）尿液水平密切相关。其中CEMA为PM2.5超短期暴露敏感的生物标志物,SPMA更适宜作为空气净化效能的生物学评价指标,而HMPMA、HPMA、HEMA在PM2.5暴露中的变化稳定且持久,更适宜作为时间段的生物监测。运用Sequenom SNP分型检测数据共筛选出与5种尿MAs的代谢能力存在相关性的SNP位点共14个,其中GSTP1、EPHX1基因在筛选出与尿MAs代谢能力相关的SNP基因-代谢网络中发挥核心作用,而细胞色素P450对外源性物质的代谢、Hippo信号通路、氧化磷酸化、哮喘等路径与目标5种尿液MAs的代谢存在关联。TLR4基因（rs10759931、rs10759932）与 SPMA,TP63 基因（rs4488809、rs4600802）与CEMA的代谢能力存在关联。rs10759931的G等位基因、rs10759932的C等位基因通过促进SPMA排泄、rs4488809的T等位基因、rs4600802的C等位基因通过促进CEMA的排泄对人体产生保护作用。研究二经过7天中药复方清肺降霾汤干预,试验组HEMA（Z=-3.614,P＜0.001）、HMPMA（Z=-1.988,P=0.047）干预前后差值显著大于对照组。控制干预前尿液浓度,干预后试验组HEMA显著高于对照组（F=7.597,P=0.007）。清肺降霾汤显著增加了尿液中HEMA的排泄。研究三基于GC-MS非靶向代谢组学方法筛选出10条共有KEGG富集通路,包括丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢,精氨酸和脯氨酸的代谢,乙醛和二羧酸代谢,谷胱甘肽代谢,精氨酸的生物合成,丁酸盐代谢（肠道）,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢,嘧啶代谢,卟啉和叶绿素的代谢,组氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢以及氮素代谢,其中D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢与丙氨酸对代谢差异贡献最大。通过单变量ROC曲线分别筛选出2,3-二羟基吡啶（AUC=0.932）、葡庚糖酸（AUC=0.936）两种在组间变化十分显著的代谢物,具有极高的诊断价值。利用差异变化系数筛选出5种与PM2.5暴露密切相关的差异代谢物,分别是鸟氨酸、甘氨酸、（2R）-2-氨基-3-膦酰丙酸、肌酸、乙醇胺。其中甘氨酸 FC（C/Pol）=2.9012,FC（Pol/Pul）=0.26548,鸟氨酸 FC（C/Pol）=2.6291,FC（Pol/Pul）=0.28201在时间点间的变化较其他代谢物更加明显。结论:1短期PM2.5暴露即可对人体产生显著的代谢变化,与氧化应激、遗传毒性、能量紊乱等机制密切相关。2 GSTP1、EPHX1基因在巯基尿酸代谢的KEGG基因-代谢网络中发挥核心作用,TLR4 基因（rs10759931、rs10759932）,TP63 基因（rs4488809、rs4600802）与挥发性有机物的尿液代谢存在关联。3通过随机对照单盲试验,发现中药复方清肺降霾汤干预可显著增加北京地区健康人群PM2.5暴露期间尿液中环氧乙烷代谢物HEMA的排泄,增强PM2.5中有毒成分的脱毒过程,具有防霾治霾实际运用价值。4筛选出5个与PM2.5暴露变化显著相关的差异代谢物,其中鸟氨酸与甘氨酸可以作为监测PM2.5短暂暴露以及诊断PM2.5相关健康损害的生物标志物。
关键词：PM2.5;巯基尿酸;VOCs;清肺降霾汤;SNP
学科专业：中西医结合临床（专业学位）
摘要
Abstract
英文缩略词
综述一 PM_(2.5)相关健康损害及代谢组学在PM_(2.5)研究中的应用
1 PM_(2.5)概述
2 中国PM_(2.5)污染现状
3 PM_(2.5)相关健康损害的流行病学证据
4 代谢组学在PM_(2.5)研究中的应用
参考文献
综述二 中药复方防治PM_(2.5)相关呼吸系统损伤机制研究
1 PM_(2.5)相关呼吸系统损伤的机制研究
2 中药复方作用机制研究
3 小结
参考文献
研究一 北京地区健康成年人短期PM_(2.5)暴露的代谢特征
1 前言
2 技术路线图
3 临床研究
4 材料
5 方法
6 结果
7 讨论
8 小结
研究二 清肺降霾汤对尿液中PM_(2.5)相关代谢物巯基尿酸含量的影响
1 前言
2 临床资料
3 结果
4 讨论
5 小结
研究三 健康成年人短期PM_(2.5)暴露的代谢组学研究
1 前言
2 技术路线图
3 研究方案
4 材料
5 方法
6 结果
7 讨论
8 小结
结论
创新点
不足与展望
参考文献
致谢
附件