论文题目：绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮品质的影响及作用机理
摘要：红豆草（Onobrychis viciifolia Scop.）和紫花苜蓿（Medicago sativa L.）均属优质豆科牧草,由于其具有适应性强、营养价值高、产草量稳定等优良特性,在我国畜牧业发展中具有举足轻重的作用。青贮是饲草常用的贮存技术,但由于豆科牧草自身的生物学特性,使得优质青贮制作工艺较难掌握,而微生物添加剂的使用是青贮调制过程中最常用的方法。绿汁发酵液（Fermented Green Juices）是一种天然活菌型生物添加剂,因其具有经济、环保、制作简单等特性而被广泛推广。因此,本试验以红豆草（OS）和紫花苜蓿（ML）为研究对象,采用双因素（2×7）完全随机试验设计,研究了自然发酵（CK）以及分别添加甘蓝（BL）、燕麦（AL）、玉米（ZL）、甜高粮（SS）、红豆草（OSF）和紫花苜蓿（MLF）六种植物原料制作而成的绿汁发酵液对OS和ML青贮发酵品质的影响。并通过体外发酵试验研究了不同绿汁发酵液处理对OS和ML青贮体外降解性能的影响。结合青贮发酵品质及其体外发酵试验的研究结果,筛选出品质较优青贮组,并利用高通量测序技术,测定了其细菌群落的多样性和组成,分析了不同绿汁发酵液处理对OS和ML青贮中细菌群落组成的影响及其与发酵参数之间的关联性。本试验旨在研究绿汁发酵液在红豆草和紫花苜蓿青贮中的作用效果和机理,为有针对性的开发青贮用微生物添加剂提供理论支持,同时为实际生产中进行优质豆科牧草青贮发酵品质调控提供科学依据。主要研究结果如下:1.青贮开袋后,所有处理均未产生霉变,其中OS-BL、OS-AL和ML-BL感官评分为1级优良,OS-ZL感官评分为3级中等;绿汁发酵液处理使豆科牧草青贮p H、氨态氮（AN/TN）、乳酸（LA）和丙酸（PA）含量均产生显著差异（P＜0.05）,其中OS-BL、OS-OSF和ML-BL组青贮p H显著低于其他处理,分别为4.27、4.34和4.27,OS-BL、ML-CK和ML-AL组青贮AN/TN显著低于其他处理,分别为12.52%、12.99%和12.29%;两种青贮原料对豆科牧草青贮LA含量存在显著影响,其中ML组青贮LA含量显著高于OS组（P=0.005）;绿汁发酵液对两种豆科牧草青贮粗蛋白（CP）、酸性洗涤纤维（ADF）、灰分（Ash）和可溶性碳水化合物（WSC）含量影响显著（P＜0.05）,其中OS-BL和ML-BL以及ML-AL组CP含量分别达到了15.34%、17.28%和17.74%;两种青贮原料对豆科牧草青贮干物质（DM）、CP、Ash和WSC含量影响显著（P＜0.05）,其中ML青贮显著高于OS青贮组;绿汁发酵液处理显著影响了青贮中酵母菌的数量（P＜0.05）,对乳酸菌数量影响不显著（P＞0.05）;通过灰色关联分析,在OS青贮组中,青贮品质的加权关联度及排序依次为,CK＞BL＞OSF＞AL＞MLF＞SS＞ZL。在ML青贮组中,青贮品质的加权关联度及排序依次为,AL＞BL＞CK＞MLF＞ZL＞OSF＞SS。综合分析表明,OS-CK、OS-BL、ML-AL和ML-BL组青贮品质较优。2.青贮原料对两种豆科牧草青贮体外发酵产气性能存在显著影响,其中OS青贮组快速降解部分产气量（P=0.006）、慢速降解部分产气量（P=0.001）、潜在产气量（P=0.001）、产气速率常数（P=0.002）和体外发酵总产气量均显著高于ML青贮;不同青贮原料对其青贮体外发酵参数存在显著影响,其中ML青贮组体外发酵p H（P=0.001）显著高于OS青贮;OS青贮组中乙酸（P=0.001）、丙酸（P=0.003）、乙酸/丙酸（P=0.001）、异丁酸（P=0.001）、丁酸（P=0.001）和戊酸（P=0.001）和TVFA（总挥发性脂肪酸）浓度显著高于ML青贮（P＞0.05）;不同绿汁发酵液处理对两种豆科牧草青贮的体外产气特性和体外发酵参数均无显著影响（P＞0.05）。3.在OS青贮中,BL绿汁发酵液处理组青贮细菌群落的Shannon指数和Simpson指数显著低于CK组和AL绿汁发酵液处理组,但在ML青贮中,AL绿汁发酵液处理组显著低于CK组和BL绿汁发酵液组（P＜0.001）;ML青贮细菌群落的ACE（P=0.008）、Shannon（P=0.061）和Chao1（P=0.011）指数的显著高于OS青贮;在OS青贮组中,相较于CK组,BL绿汁发酵液处理显著提高了青贮中乳酸杆菌属（Lactobacillu）的相对丰度（P=0.015）,降低了魏斯氏菌属（Weissella）的相对丰度（P=0.074）,但在ML青贮组中,BL绿汁发酵液处理组青贮中Lactobacillu的相对丰度显著低于其他处理（P=0.015）;两种青贮原料对其青贮中Weissella、肠球菌属（Enterococcus）和乳球菌属（Lactococcus）的相对丰度均存在显著影响,其中OS青贮中Weissella的相对丰度有高于ML青贮的趋势（P=0.055）,Enterococcus和Lactococcus的相对丰度显著低于ML青贮（P=0.001,P=0.033）;通过对青贮细菌群落进行LEf Se进化分支分析发现,绿汁发酵液处理使两种豆科牧草青贮细菌群落产生了显著差异物种,同时改变了青贮中细菌群落之间的作用关系;两种豆科牧草青贮中细菌在属水平的相对丰度与青贮p H、AN/TN和有机酸均存在显著相关性（P＜0.05）。综上所述,豆科牧草青贮时,添加合适的绿汁发酵液可明显减少青贮损失,提高青贮发酵品质。BL和AL绿汁发酵液分别能够显著提高OS和ML青贮的营养成分和发酵品质;在青贮细菌群落多样性中,BL和AL绿汁发酵液分别降低了OS和ML青贮中细菌群落的Shannon和Simpson指数,提高了优势菌属Lactobacillus的相对丰度,说明绿汁发酵液处理,通过改变青贮中细菌群落的组成,进而影响了青贮的发酵品质。但不同绿汁发酵液的作用效果存在差异,且受青贮原料的影响显著。在本试验条件下,BL和AL绿汁发酵液对两种豆科牧草均具有较好的添加效果。
关键词：绿汁发酵液;豆科牧草;青贮品质;细菌多样性;营养价值
学科专业：农学·畜牧学
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Abstract
第一章 绪论
1 研究背景
1.1 我国饲草产业概况
1.2 豆科牧草的饲用价值
2 研究现状
2.1 绿汁发酵液
2.2 乳酸菌添加剂
2.2.1 同型乳酸菌添加剂
2.2.2 异型乳酸菌添加剂
2.3 青贮品质评定及综合评价方法
2.3.1 感官评定
2.3.2 化学分析评定法
2.3.3 体外产气法
2.4 青贮饲料微生态系统及其研究方法
2.4.1 青贮饲料微生态系统
2.4.2 分子生物学在青贮饲料细菌多样性研究中的应用现状
3 研究目的和意义
4 研究内容和方案
4.1 研究内容
4.2 技术路线
第二章 不同绿汁发酵液处理对红豆草及紫花苜蓿青贮发酵品质的影响
1 前言
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.2 试验设计
2.3 绿汁发酵液制备
2.4 青贮饲料调制
2.5 测定指标及方法
2.6 数据处理与分析
3 结果
3.1 青贮原料化学成分和微生物数量
3.2 青贮品质感官鉴定
3.3 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮发酵特性的影响
3.4 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮营养成分的影响
3.5 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮微生物数量的影响
3.6 红豆草和紫花苜蓿青贮品质综合评价
4 讨论
4.1 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮发酵特性的影响
4.2 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮营养成分的影响
4.3 绿汁发酵液对红豆草和紫花苜蓿青贮微生物数量的影响
5 小结
第三章 不同绿汁发酵液处理两种豆科牧草青贮的体外发酵性能
1 前言
2 材料与方法
2.1 体外发酵产气试验
2.2 测定指标
2.3 数据统计
3 结果
3.1 绿汁发酵液对两种豆科牧草青贮体外发酵降解性能的影响
3.2 绿汁发酵液对两种豆科牧草青贮体外发酵参数的影响
4 讨论
4.1 绿汁发酵液对两种豆科牧草青贮体外降解性能的影响
4.2 绿汁发酵液对两种豆科牧草青贮体外发酵参数的影响
5 小结
第四章 绿汁发酵液对红豆草与紫花苜蓿青贮细菌多样性的影响
1 前言
2 材料与方法
2.1 细菌DNA的提取
2.2 16Sr RNA基因全长序列扩增
2.3 Pac Bio测序
2.4 生物信息学分析
3 结果
3.1 测序质量分析
3.2 绿汁发酵液对豆科牧草青贮细菌群落Alpha多样性的影响
3.3 绿汁发酵液对豆科牧草青贮细菌群落Beta多样性的影响
3.4 绿汁发酵液对豆科牧草青贮细菌群落组成及相对丰度的影响
3.4.1 青贮样品在门水平上的细菌相对丰度
3.4.2 青贮样品在属水平上的细菌相对丰度
3.4.3 青贮样品在种水平上的细菌相对丰度
3.5 红豆草和紫花苜蓿青贮中细菌群落网络关联分析
3.6 青贮中细菌与发酵品质之间的相关性分析
4 讨论
4.1 绿汁发酵液对豆科牧青贮细菌群落结构多样性和相似度的影响
4.2 绿汁发酵液对豆科牧草青贮细菌群落构成和相对丰度的影响
4.3 青贮细菌群落网络关联分析及其与发酵参数之间的相关性分析
5 小结
第五章 结论与展望
1 结论
2 创新展望
参考文献
项目资助
致谢