氧自由基清除能力法 (Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC) 用于检测样品的总抗氧化能力, 因其具有自动化且标准化等优点, 已然成为体外抗氧化能力的标准检测方法之一, 例如国众多生产商已经将通过ORAC法测得的物质ORAC值写在了商标上以表明其产品的抗氧化能力。在ORAC法检测中, 基于荧光酶标仪检测不同时间间隔△t的抗氧化标准物质Trolox、被检测样品以及荧光素等的荧光衰退强度, 并通过计算荧光衰退的净面积计算被检测样品抗氧化能力的ORAC值。作为潜在的抗氧化能力标准检测方法, 诸多文献对其ORAC检测数值的影响因素做了深入探讨, 如盐离子浓度, p H值与温度等。
进一步的文献检索发现, 不同的研究人员在检测过程中选取的荧光衰退时间间隔△t是不一样的, 从1 min到5 min不等。例如Usami等测定甘蓝ORAC值时△t选为1min。张红城[1]等测定蜂胶多酚ORAC值时△t选为1 min。汤杰[2]等测定桉叶提取物ORAC值时△t选为1.5 min。曹亚兰[3]测定大豆肽ORAC值时△t选为2 min。Tai[4]等测定抗坏血酸原的ORAC值时采用的△t亦为2 min。何秋彤[5]等测定20种市售凉茶ORAC值时△t选为2.5 min, 张水平[6]测定胡椒叶ORAC值时△t选为3 min, Wan[7]等测定大鼠血清ORAC值时△t选为4.5 min, 林利美[8]等测定草鱼肽ORAC值时△t选为4.5 min, 李富华[9]等测定苦荞麦皮黄酮ORAC值时△t选为4.5 min, Di[10]等测定牛酪蛋白水解物ORAC值与王立峰[11]等测定薏米酚类提取物ORAC值时的△t选为5 min。尽管对于某一物质, 其荧光衰减曲线是一定的, 但是选取不同的荧光衰退时间间隔决定了荧光强度衰退曲线的光滑度, 也决定了ORAC值计算时所需的曲线下的面积, 相当于光滑曲线变为离散折线。一方面, 荧光衰退时间间隔对于ORAC值是否没有影响, 实验者是否可以任意选取, 尚未有文献定量讨论;且在实际的检测中, 包括笔者在内的不少研究人员都曾困惑如何选取合适的荧光衰退时间间隔;另一方面, 有的荧光酶标仪是手动记录读数, 如若荧光衰退间隔时间较短, 会给人工记录带来不便, 因此需要用较长的荧光衰退间隔时间, 且如若取较长的荧光衰退间隔时间, 还可在实际检测中对于不同的样品进行交叉检测, 因有的样品通过酶标仪获取OD值时仅需要很短时间。基于此, 以维生素C (Vc) 和实验室提取的桑葚花色苷提取物 (Mulberry Fruit Anthocyanin Extraction, MFAE) 为研究对象, 在检测中选取了不同的荧光衰退时间间隔, 实验定量探讨荧光衰退时间间隔对于Vc和MFAE的ORAC值的影响, 为ORAC法中选取荧光衰退间隔时间提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源
维生素C (Vc) 购自西陇化工股份有限公司, 桑椹花色苷提取物来自实验室提取。
1.1.2 主要仪器与试剂
多功能酶标仪 (En Vision, 美国Perkin Elmer) 、移液枪 (北京大龙兴创实验仪器有限公司) 。荧光素钠 (FL) 、2, 2-偶氮二 (2-甲基丙基咪) 二盐酸盐 (AAPH) 均购自上海晶纯生化科技股份有限公司, 抗氧化物标准物Trolox购自阿拉丁生化科技股份有限公司, 磷酸氢二钾与磷酸二氢钠购自北京化工厂;以上试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 ORAC实验方法
ORAC测定参照Tai[4]等的方法, 并作一定修改。将测定温度设置为37℃, 在96孔荧光板各微孔加入20 μL不同浓度 (1, 2, 4, 6, 8, 10 μmol/L) 抗氧化标准物Trolox溶液, 用于绘制标准曲线;加入20 μL的1 mg/m L MFAE与20 μL的1 mg/m L Vc溶液 (因本文讨论间隔时间选取的影响, 故固定样液浓度) 。随后加入20 μL的75 mmol/L磷酸盐缓冲液 (p H7.4) , 接着加入20 μL浓度为70nmol/L荧光素 (FL) , 待仪器测定温度升至37℃后, 将已加入体系溶液的96孔板放入仪器内, 孵育15 min。启动反应前将荧光衰退测定间隔时间分别设为1, 2, 3, 4, 5min, 激发波长为485 nm, 发射波长为520 nm, 随后用八道移液枪快速加入12 mmol/L AAPH 140 μL, 立即启动测定;待各孔荧光衰退呈基线后停止测定。
1.2.2 统计分析
每个样品均设置4个重复孔, 实验结果取平均值;ORAC值的计算方法参照Tai[4]。采用Origin 9.0软件作图分析。
2 结果分析
2.1 AAPH诱导不同浓度的Trolox与样品荧光衰退曲线
加入AAPH后立即对体系溶液的荧光强度进行测定, 荧光强度衰退测定间隔时间分别设为1, 2, 3, 4, 5min。图1给出了荧光强度衰退测定间隔时间为1 min的荧光衰退曲线, 荧光强度衰退测定间隔时间为2, 3, 4, 5 min的衰退曲线与图1类似。由图1可知, 荧光曲线衰退速率随着抗氧化标准物质Trolox浓度的增大而减缓;未加抗氧化物质的溶液体系, 其荧光衰退曲线相对来说较快, 约125 min达到了基线状态;202 min后, 最高浓度Trolox (10 μmol/m L) 荧光曲线到达基线状态, 说明荧光素钠被氧自由基破坏完全, 测试反应达到终点。荧光衰退曲线下的面积随着Trolox浓度的增大而增大。相同浓度情况下, MFAE的荧光衰退明显比Vc减缓, 即Vc在125 min时基本呈基线趋势, 而MFAE荧光衰退达到基线状态则需要180 min。由图1可知, 可直观地看出MFAE抗氧化能力较Vc强。
2.2 荧光衰退间隔时间对于Trolox与样品AUC数值的影响
由图2可知, 不同间隔时间对不同浓度Trolox、MFAE和Vc的AUC数值确系有一定的影响, 即从△t为1min至△t为3 min, 所有曲线下的AUC数值均逐渐减小;随后, 当△t为4min时, 所有曲线下的AUC数值增加;当△t为5 min时, 所有曲线下的AUC数值急剧下降至最低。进一步地, 从不同浓度Trolox、MFAE和Vc的AUC的数值上看, 不同时间间隔下得到的AUC数值却相差不大, 即同一待测物AUC的最大数值与最小数值相差的百分比分别是:1.35% (1 μmol/L Trolox) 、1.32% (2 μmol/L Trolox) 、1.23% (4 μmol/L Trolox) 、1.13% (6 μmol/L Trolox) 、1.07% (8 μmol/L Trolox) 、1.00% (10μmol/L Trolox) 、1.03% (MFAE) 与1.40% (Vc) 。
2.3 荧光衰退间隔时间对于Trolox与样品Net AUC数值的影响
由图3可知, 不同间隔时间对不同浓度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC (AUCTrolox– AUCblank) 也有一定的影响。例如对于1 μmol/L的Trolox, 随着间隔时间的增加, Net AUC先减小后增加, 且在间隔时间△t为3 min时达到最小值, 而对于10 μmol/L的Trolox, 随着间隔时间的增加, Net AUC呈线性减小;对于MFAE, 其Net AUC在△t为4 min时达到最小值, 而对于Vc, 其Net AUC在△t为5 min时达到最小值。从不同浓度Trolox、MFAE和Vc的Net AUC的数值上看, 不同时间间隔下得到的Net AUC数值相差不大, 即最大数值与最小数值相差的百分比分别是:1.31% (1 μmol/L Trolox) 、0.64% (2 μmol/L Trolox) 、0.21% (4 μmol/L Trolox) 、0.34% (8 μmol/L Trolox) 、0.31% (MFAE) 与1.4% (Vc) 。
2.4 荧光衰退间隔时间对于桑葚提取物与维生素C的ORAC数值的影响
由图4可知, 在本实验样品的浓度下, 桑葚花色苷提取物ORAC的数值较Vc的高, 表明其抗氧化能力较强, 约为Vc的5.8倍;随着间隔时间的增加, 对于桑葚提取物MFAE的ORAC值, 除了在△t为4 min时下降, 总体呈现上升趋势;进一步地, 在不同荧光衰退间隔时间下, MFAE的ORAC最大值为5527.5 μmol TE/g, 最小值为5497.4 μmol TE/g, 相差为30.1 μmol TE/g。对于维生素C的ORAC值, 随着间隔时间的增加首先增加, 在△t为3min时达到最大值;随后逐渐减小, 在△t为5 min时达到最小值;进一步地, 在不同荧光衰退间隔时间下, Vc的ORAC最大值为953.5 μmol TE/g, 最小值为942.3 μmol TE/g, 相差为11.2 μmol TE/g。从不同时间间隔下得到的ORAC数值的最大值与最小值的相差百分比上来看, MFAE的是0.55%, Vc的是1.2%, 表明荧光衰退间隔时间的不同对于标准物Vc与自制样品MFAE的ORAC计算值影响较小。
3 结语
本文以维生素C和桑葚花色苷提取物为研究对象, 定量地探讨了选取不同荧光衰退时间间隔对于样品ORAC值的影响。结果表明:在不同荧光衰退间隔时间下, 从1min到5 min, MFAE的ORAC最大值与最小值相差为30.1μmol TE/g, 相差百分比为0.55%;维生素C的ORAC最大值与最小值相差为11.2 μmol TE/g, 相差百分比为1.2%;即荧光衰退时间间隔对于本文样品ORAC值的影响均在2%以内。因此, 第一, 本文的研究为ORAC法中选取荧光衰退间隔时间提供参考, 建议可在为1~5 min范围内随机选取;第二, 基于手动记录读数的荧光酶标仪, 建议选取较长的荧光衰退间隔时间, 如5 min, 以有利于手动记录, 也有利于与某些检测时间较短的试样交叉进行。
摘要：目的:实验定量探讨荧光衰退时间间隔的选取对抗氧化物质ORAC值的影响。方法:以维生素C和实验室自提的桑葚花色苷提取物为样品, Trolox为标准物, 选取设置不同的荧光衰退时间间隔, 应用ORAC法测定样品与标准物的荧光衰退曲线, 计算样品ORAC值, 分析不同荧光衰退时间间隔对样品AUC、Net AUC和ORAC值的影响。结果:荧光衰退时间间隔对于维生素C和桑葚花色苷提取物ORAC值的影响均在2%以内, 定量地表明了荧光衰退间隔时间对于论文中样品ORAC值影响较小。结论: (1) 研究结论为ORAC法中选取荧光衰退间隔时间提供参考, 建议可在为15 min范围内随机选取; (2) 基于手动记录读数的荧光酶标仪, 研究结论建议可选取较长的荧光衰退间隔时间, 如5 min, 以有利于手动记录, 也有利于与某些检测时间较短的试样交叉进行。
关键词：氧自由基清除能力,荧光衰退,间隔时间,维生素C,桑葚花色苷提取物
参考文献
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