论文题目：基于生物信息学筛选的CCL2调控脊髓损伤后自噬和炎症及其分子机制的研究
摘要：研究背景脊髓损伤（SCI）是一种破坏性疾病,通常会导致损伤部位以下感觉和自主运动功能不可逆转的丧失。脊髓损伤的病理生理学过程包括原发机械性损伤和继发的一系列级联损伤过程事件,使脊髓逐渐变性,坏死。这些继发事件包括缺血,缺氧,血管损伤,缺血后再灌注,自由基形成,钠和钙介导的细胞损伤,谷氨酸的兴奋性毒性和离子稳态紊乱,细胞氧化损伤,强烈的炎症反应,水肿,脱髓鞘,瓦勒氏变性,轴突萎缩,神经元细胞死亡。继发性损伤放大了初级损伤,并促进囊性变性,基质重塑和胶质疤痕的演变及形成从而阻止神经功能恢复。已知脊髓损伤后的二次损伤生物过程涉及免疫,血管和神经系统中不同的细胞和分子。例如,由Plxnb2编码的Plexin-B2最初被认为是一种轴突引导分子,在损伤激活的小胶质细胞和巨噬细胞中被上调,是脊髓损伤后运动感觉恢复的必要前提。SIRT6是sirtuin家族成员,在控制DNA修复,端粒维护和炎症反应方面起着重要作用。上调的SIRT6可以减轻炎症反应,过氧化应激,防止脊髓损伤后细胞过度发生凋亡。干扰素基因刺激因子（STING）激活由I型干扰素调控的先天免疫反应,在炎症调节中发挥关键作用,敲除STING后,NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化,减轻了小鼠脊髓损伤后强烈的炎症反应,从而部分促进脊髓损伤后再生功能的恢复。对基因变化的分析有助于了解脊髓损伤后基因表达和下游信号通路引起的级联,瀑布样,复杂的网络分子调控所引起的损伤分子机制。急性脊髓损伤后,临床治疗二次损伤的方法是大剂量的激素应用:甲强龙冲击疗法,而甲强龙会引起多方面的副作用使其受到较大争议。虽然最新的治疗方法有许多种,如:控制血压,治疗性低体温,脑脊液引流,药物治疗:GM-1神经节苷脂,利鲁唑,米诺环素,细胞因子治疗:成纤维细胞生长因子,粒细胞集落刺激因子,肝细胞生长因子,髓鞘相关通路蛋白抗体及抑制剂治疗,细胞治疗:神经干/前体细胞,间充质干细胞,雪旺细胞,嗅觉鞘膜细胞,及生物材料移植治疗等,但治疗效果依旧不是很理想。生物信息学利用计算机科学来收集,处理和分析由基因芯片和测序技术获得的大数据。它使我们能够在微观层面上对疾病发展的基因变化进行大规模的筛选,已经成为研究难治性疾病机制的一种有效方法。研究越来越多地使用基因微阵列技术来确定与疾病发病机制密切相关的异常表达基因。这些基因通过翻译和转录调节炎症因子,趋化因子,各种蛋白分子和细胞信号通路,衍生出不同的蛋白表型,促使正常生物功能的发生改变,这些因素共同影响,相互作用,从而引起疾病的发生,发展和演变。脊髓损伤后二次级联瀑布样的炎症风暴反应由多种基因的参与。然而,对于这些基因的相互作用以及下游的信号通路,蛋白分子网络相互作用等,在损伤反应中及神经功能的恢复的潜在分子机制知之甚少。因此,为了更好地探索和理解脊髓损伤后的分子机制,鉴别和筛选出这些在脊髓损伤后的不同时间点基因的差异性时程表达,这些基因富集到的分子信号通路,下游的蛋白分子网络的探索,有望通过基因水平层面上的生物信息学研究为脊髓损伤研究提供新的见解和思路。研究目的为了深入探索脊髓损伤后不同时间点的分子机制,我们的实验研究分为以下四个部分:第一部分:脊髓损伤后不同时间点的关键基因及通路的鉴定（总体分析）。第二部分:基于GEO数据库和自噬数据库相结合筛选脊髓损伤后CCL2自噬相关HUB基因及分子信号通路及验证（针对分析）。第三部分:CCL2在脊髓髓损细胞模型（PC-12细胞）中通过PI3K信号通路对自噬及炎症的调控（细胞实验）。第四部分:CCL2通过PI3K信号通路调控自噬,炎症,影响脊髓损伤后的再生,修复（动物实验）。研究方法通过GEO公共数据库测序网站下载大鼠的基因表达谱数据（GSE45006和GSE464）,从中筛选出脊髓损伤后各个关键时间点的基因表达矩阵文件,通过计算机Perl和R语言对各个时间点的数据进行基因探针的注释,转换,样本的合并,批次效应的矫正,数据的清洗,归一化处理后得到标准化文件,通过对该标准化后的文件利用R语言limma包进行差异表达显著基因的获取,通过基因本体论富集分析（GO富集分析）,京都基因和基因组百科全书路径分析（KEGG富集分析）和基因集富集分析（GSEA富集分析）分析这些差异表达的基因得出关键的信号通路,通过STRING在线数据库,分析这些差异表达显著的基因,并行蛋白-蛋白互作网络的分析及可视化,通过Cytoscape开源软件,使用Cytohubba插件中的MCC算法,获得各个关键时间点,权重排名超前的30个枢纽基因。根据Hub基因表达数据和脊髓损伤后状态绘制了ROC曲线。通过这个数据矩阵推断这些Hub基因在正常组和脊髓损伤组的表达,分析了这些Hub基因与脊髓损伤后的临床诊断的相关性。通过R语言的GOPLOT进行预测与再生相关的基因。通过自噬基因数据库与前述GEO数据库大鼠基因表达数据库取交集获得自噬基因的基因表达矩阵文件,通过R语言进行基因的差异表达分析并通过GSVA分析信号通路的差异分析。最后通过细胞及动物层面对CCL2自噬基因及PI3K分子信号通路对自噬及功能进行实验验证。研究结果本实验从Gene Expression Omnibus数据库中下载了两份大鼠基因表达谱数据,包括SCI后不同时间点正常组和脊髓损伤组的胸椎矩阵数据进行分析。我们筛选出每个时间点显著表达差异排名超前的20个上调和下调的基因,对这些差异表达显著的基因进行基因本体学富集分析,获得了这些差异表达显著基因富集到的生物学的过程,细胞的组成,分子学的功能,三个分类中。其要富集在生物学过程类别的有以下:突触中囊泡介导的运输,神经递质运输,再生,学习或记忆,认知,伤口愈合,神经递质水平的调节,对脂多糖的反应和膜电位的调节。其中主要富集在细胞组成类别的有以下:神经元突触末端,运输囊,突触后膜,不对称突触,突触后密度,突触后特化,神经元对神经元突触,远端轴突,突触膜和轴突末端。其中主要富集在分子功能类别的有以下:金属离子跨膜转运体活性,配体门控离子通道活性,配体门控通道活性,羧酸结合,有机酸结合,细胞粘附分子结合,门控通道活性,整合素结合,参与突触后膜电位调节的发射器门控离子通道活性和神经递质受体活性。对这些差异表达的基因进行京都基因组百科全书通路分析,获得分子信号通路如下:AGE-RAGE信号通路,谷氨酸突触,尼古丁成瘾,肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）,c AMP信号通路癌症中的蛋白多糖,GABA能突触,心肌细胞中的肾上腺素信号传导,松弛素信号传导途径胰岛素分泌,血小板激活,Rap1信号传导途径,神经活性配体-受体相互作用,胰腺分泌,阿米巴病,甲状腺激素的合成,羟色胺突触,醛固酮的合成和分泌,突触囊泡循环,可卡因成瘾,唾液分泌,化学因子信号通路,类风湿性关节炎炎症介质对TRP通道的调节ECM与受体的相互作用,长期电位,破骨细胞分化,钙信号通路,内分泌和其他因子调节的计算,HIF-1,TNF,MAPK,PI3K-Akt,IL-17,JAK-STAT,NF-kappa B,PPAR信号通路,松弛素信号通路,人类巨细胞病毒感染,Toll样受体信号传导途径,细胞凋亡和p53信号通路,以及麻疹通路。为了获得PPI数据,提交各个时间点差异表达的基因到STRING数据库中。使用Cytoscape（3.8.0版）来构建蛋白互作网络,蛋白互作网络显示了差异表达的基因的关系和功能,该网络是在去除孤立的节点后建立的。1天的PPI网络由451个节点,1877个连线所构成。3天的PPI网络由513个节点,1869个连线构成。7天的PPI网络由531个节点,2344个连线构成。14天的PPI网络由451个节点,1877个连线构成。接着使用R语言分析,获取每个时间点排名前30基因,并做柱状图。通过Cytoscape插件Cytohubba的MCC算法,从差异表达的基因中筛选出脊髓损伤每个时间点权重最高的30个Hub基因。通过合并脊髓损伤后第1,3,7和14天的数据集,使用R语言中的GOplot包来分析和选择感兴趣的元素和术语进行基因预测获取再生相关的基因,然后与这些枢纽基因取交集,得到再生相关的枢纽基因.通过人类自噬数据库HADb（http://autophagy.lu/）筛选出自噬相关基因,同以上的获取的基因矩阵文件取交集,获得自噬相关基因矩阵文件,通过R语言limma包筛选出脊髓损伤后差异表达显著的自噬相关基因。并从自噬相关基因中筛选出CCL2基因。通过对脊髓损伤后的不同时间点的CCL2自噬相关基因在对照组和脊髓损伤组的表达量分析,通过R语言"ggpubr"包进行了计算,脊髓损伤组与对照组相比,CCL2的表达有明显差异。通过R语言p ROC包对脊髓损伤后四个时间点的基因矩阵进行计算,我们发现CCL2在脊髓损伤后4小时,12小时,1天,3天ROC曲线的曲线下面积均大于90%,分别为:91.7%,100%,100%和100%。通过脊髓损伤后四个时间点大鼠的动物实验造模,验证了以上生物信息学学的分析结果,并通过PC-12脊髓损伤的细胞实验,通过小干扰RNA对CCL2进行敲除,对四个时间点CCL2表达最高的时间点进行敲除效率验证。最后对脊髓损伤PC-12细胞模型进行CCL2基因敲除,研究PI3K信号通路,以及下游自噬,炎症表型变化情况发现:CCL2-PI3K/Akt信号轴是脊髓损伤中自噬和炎症的关键调节媒介。研究结论综上所述,我们对脊髓损伤后四个时间点的大鼠基因表达谱进行了全面的生物信息学分析。在每个时间点都成功筛选出了差异表达显著的基因。通过基因本体论富集分析,京都基因和基因组百科全书路径分析和基因集富集分析对这些差异表达的基因进行富集分析,发现它们与炎症反应、组织再生和损伤愈合有关,PI3K-Akt,MAPK,JAK-STAT,HIF-1,NF-κB和Toll样分子信号通路在脊髓损伤后中发挥着重要作用。此外,通过构建PPI得到30个Hub基因,通过R goplot包获得与脊髓损伤后的组织修复、重建和再生中发挥关键作用基因。通过自噬数据库HADb获得CCL2自噬相关基因。并通过验证CCL2在PC-12细胞中通过PI3K信号通路对自噬及炎症的调控,最后拟通过动物实验验证大鼠脊髓损伤模型后通过抑制CCL2表达来影响脊髓损伤后功能的恢复。因此,本研究通过生物信息学的方法获得CCL2自噬相关基因及PI3K信号通路,并通过细胞实验验证CCL2在PC-12脊髓损伤细胞中的功能和作用机制的研究,为进一步阐明继发性脊髓损伤的分子机制提供了理论依据,有助于脊髓损伤新治疗策略的制定和研发。
关键词：脊髓损伤;基因表达谱;基因本体论富集分析;京都基因和基因组百科全书通路分析;基因集富集分析;蛋白互作网络;自噬;炎症
学科专业：外科学（骨外）
中英文缩略词表
中文摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 脊髓损伤(Spinal cord injury)
1.2 组学及生物信息学
1.3 GEO数据库
1.4 自噬
1.5 趋化因子
1.6 CCL2/MCP-1
1.7 PI3K/Akt信号通路
1.8 研究的目的和内容
第二章 脊髓损伤后不同时间点的关键基因及通路的鉴定
2.1 材料与方法
GEO原始数据下载及R及Perl等软件安装及IDE环境的搭建
原始数据的处理
2.2 结果
数据的标准化
差异表达基因(DEGs)的鉴定
差异表达基因(DEGs)的GO富集分析
差异基因的KEGG富集分析
基因组富集分析
蛋白互作网络(PPI)的构建
枢纽基因的鉴定
组织修复、重建和再生的关键基因预测
2.3 讨论
脊髓损伤后涉及的分子信号通路
脊髓损伤后涉及的关键基因
脊髓损伤后涉及的再生基因
2.4 结论
第三章 脊髓损伤后CCL2及分子信号通路的筛选及实验验证
3.1 材料与方法
获取自噬相关基因及自噬相关基因矩阵文件
自噬相关基因的差异分析
GSVA自噬相关信号通路的差异分析
CCL2为蛋白-蛋白网络相互作用(PPI)中的核心地位
CCL2枢纽基因(Hub基因)的鉴定
CCL2组织修复,重建和再生的关键基因的选择
CCL2自噬相关基因的表达量分析
CCL2自噬相关基因的接受者操作特征曲线分析
CCL2自噬相关基因的实验验证
3.2 结果
获取自噬相关基因
自噬相关基因和信号通路的差异分析
蛋白-蛋白网络相互作用(PPI)和核心基因Hub gene中CCL2的核心地位
CCL2是组织修复,重建和再生的关键基因
CCL2表达量分析和ROC曲线分析
脊髓损伤动物模型验证了CCL2表达的升高
3.3 讨论
3.4 结论
第四章 CCL2在PC-12细胞中通过PI3K信号通路对自噬及炎症的影响
4.1 材料与方法
生物信息学分析
脊髓损伤的动物模型及其分组
冻存细胞的复苏
细胞传代
细胞的冻存
PC-12细胞脊髓损伤的细胞模型
细胞转染 小干扰RNA(si-RNA)转染
RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR)分析
Western blotting分析
免疫荧光染色(Immunofluorescence)
单丹磺酰尸胺染色MDC
统计学分析
4.2 结果
SCI后 CCL2的基因表达上调
SCI后 PI3K/Akt通路被激活
脊髓损伤动物模型验证CCL2表达升高
脊髓损伤细胞模型验证CCl2 的表达量升高,验证si-CCL2 的干扰效率
CCL2敲除减轻SCI中自噬的抑制作用并抑制炎症反应
PI3K/AKT信号通路在脊髓损伤细胞模型中被激活
CCL2通过PI3K/Akt信号通路调控自噬并影响炎症反应
4.3 讨论
4.4 结论
第五章 总结和展望
5.1 总结
5.2 展望
参考文献
个人简历
致谢
综述 生物信息学在骨科学中的应用
生物信息学在脊髓损伤研究中的应用
生物信息学在关节炎研究中的应用
生物信息学在异位骨化研究中的应用
生物信息学在骨科其他疾病研究中的应用
参考文献