论文题目：含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究
摘要：由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
关键词：骨再生;骨组织工程;羟基磷灰石;碳酸根取代;稀土掺杂
学科专业：口腔临床医学
中文摘要
abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复
1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程
1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法
1.2 口腔颌面部骨组织工程概述
1.2.1 骨组织工程中的种子细胞
1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介
1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系
1.3 骨缺损修复材料简介
1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求
1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料
1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石
1.3.4 用于骨再生的支架材料
1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用
1.4 本论文的设计思路和技术路线
1.4.1 设计思路
1.4.2 技术路线
第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备
2.1 引言
2.2 实验仪器与试剂
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.3 实验方法
2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算
2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备
2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征
2.3.4 碳酸根取代度的确定
2.3.5 形貌与化学组成分析
2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测
2.4 结果与讨论
2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素
2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构
2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响
2.4.4 碳酸根取代度的确定
2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质
2.5 本章小结
第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能
3.1 引言
3.2 实验部分
3.2.1 实验试剂
3.2.2 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养
3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态
3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖
3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性
3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性
3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性
3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节
3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响
3.3.9 使用三维打印机打印支架
3.3.10 支架的形貌及成份表征
3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附
3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖
3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性
3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性
3.3.15 统计学分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养
3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响
3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响
3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响
3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响
3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析
3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响
3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响
3.4.9 三维打印支架的宏观外形
3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征
3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附
3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖
3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性
3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性
3.5 本章小结
第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 试剂
4.2.2 仪器
4.3 实验方法
4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组
4.3.2 术后大体观察
4.3.3 术后影像学观察
4.3.4 组织学观察染色
4.3.5 Masson染色
4.3.6 体内生物安全性评价
4.4 结果与讨论
4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立
4.4.2 动物处死后标本的获取
4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复
4.4.4 术后组织学检测
4.4.5 Masson染色表征
4.4.6 支架促血管再生
4.4.7 支架的体内安全性结果分析
4.4.8 支架促成骨性能讨论
4.5 本章小结
第五章 结论与展望
5.1 本论文的主要创新点
5.2 全文结论
5.3 展望
参考文献
作者简介及科研成果
致谢