论文题目：小型核酸自动提取系统研制及在动物源性成分真实性快检中的应用
摘要：目前,全球食品安全研究领域的一大热点问题即是对食品中动物源性成分真实性进行快速检测。实时荧光PCR技术因其可以对动物源性成分进行快速定量检测等优势,已经广泛应用于食品中动物源性成分真实性快检。其中,快速制备高质量的核酸模版对实时荧光PCR检测至关重要。如今,基于磁棒法的磁珠法核酸自动提取技术因其核酸提取效率高、纯化效果好等优势,已经逐渐成为样本核酸提取纯化的首要选择。然而,目前市场上主流的磁珠法核酸自动提取系统通量水平基本上都以中等至高为主,在食品中动物源性成分真实性快检时便携性不足,且规模大、成本高。以上,基于对食品中动物源性成分真实性快检研究进展和核酸自动提取系统研究进展的充分调研,本课题自主设计研发了小型磁珠法核酸自动提取仪和配套的磁珠法核酸提取试剂盒,通过核酸自动提取仪与核酸提取试剂盒配套研发,相互优化,从而构建小型核酸自动提取系统,以解决目前动物源性成分真实性快检中存在的痛点,满足现场快速检测和小规模检测的需要。首先,本课题基于食品样本类型特征研制出核酸提取试剂并优化食品样本消化裂解方法及核酸纯化方法,设计独特的核酸提取试剂分装方式,优化核酸提取方法,从而成功研制出磁珠法核酸提取试剂盒。其次,本课题通过仪器结构、仪器电路、人机交互的设计研发,成功研制出小型磁珠法核酸自动提取仪。其中,混匀装置和深孔板装置是本自研核酸自动提取仪区别于其他核酸自动提取仪的创新亮点及核心优势。在仪器研制成型后,对其性能进行测试与优化。通道精度测试结果显示,两次DNA提取中各通道的变异系数CV分别为1.91%和1.17%;同一通道在两次DNA提取之间的变异系数CV分别为1.10%、0.21%、2.09%、2.35%、0.93%、1.75%、0.70%、0.59%。结果表明,本自研核酸自动提取仪8个通道之间的核酸提取均一性良好,且各通道的核酸提取重复性也良好,达到了预期目标。同时,结合自研核酸提取试剂盒对仪器核酸提取程序进行优化。实验结果显示,核酸提取程序S1提取的DNA的浓度平均值为271.34μg/m L,Ct Mean为13.397;核酸提取程序S2提取的DNA的浓度平均值为254.41μg/m L,Ct Mean为14.423;两者提取的DNA的OD260/OD280比值皆在1.7～2.0之间。因此,确定优化后的核酸提取程序S1与自研核酸提取试剂盒配套使用,应用于食品中动物源性成分真实性快检。最后,将自研核酸自动提取系统与商业化核酸提取试剂盒从DNA提取效率、DNA提取重复性、检测灵敏度、抑制剂去除效果、DNA提取稳定性、综合应用等维度进行全面比较分析。比较分析结果显示,自研系统提取的DNA的浓度平均值为304.08μg/m L,Ct Mean为12.973,变异系数CV为0.82%,商业试剂盒提取的DNA的浓度平均值为231.91μg/m L,Ct Mean为14.701,变异系数CV为3.71%,两者提取的DNA的OD260/OD280比值皆在1.7～2.0之间;自研系统最低可检测出稀释到10-6数量级的DNA,商业试剂盒最低检测出的数量级为10-5;自研系统提取的原DNA和10倍稀释DNA的CT值差异在3.267,商业试剂盒提取的原DNA和10倍稀释DNA的CT值差异在3.054;两者提取的DNA的CT值在-20℃和室温条件下具有显著性差异（P＜0.05）;商业试剂盒仍为手工提取模式,提取时间大约为60分钟,而自研系统则通过仪器自动化提取核酸,操作更加便捷,提取时间也更短,仅需约45分钟。验证对比结果表明,自研核酸自动提取系统在新鲜猪肝组织DNA提取中的核酸提取效果、提取时间、操作简便性等方面优于商业化核酸提取试剂盒。综上,本课题围绕食品中动物源性成分真实性快检,研发了小型磁珠法核酸自动提取仪和配套的磁珠法核酸提取试剂盒,最终成功构建小型核酸自动提取系统。本自研核酸自动提取系统采用旋转混匀模式,磁棒套设计成单体形态,且可通过卡扣与从动齿轮自动联接。同时,在处理食品样本时可根据需要处理的样本数量选择拼接1～8个深孔板,具有较高的实际应用价值。
关键词：核酸自动提取;磁珠法;食品安全;真实性快检;动物源性成分
学科专业：工学 食品工程（专业学位）
摘要
ABSTRACT
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第一章 绪论
1.1 食品中动物源性成分真实性快检研究进展
1.1.1 食品安全研究现状
1.1.2 动物源性成分快检技术概述
1.1.3 实时荧光PCR化学原理及制约因素
1.2 核酸自动提取系统研究进展
1.2.1 核酸提取方法概述
1.2.2 磁珠法核酸自动提取技术原理
1.2.3 磁珠法核酸自动提取系统研究现状
1.3 课题研究目的、内容与创新点
1.3.1 研究目的与意义
1.3.2 研究内容与价值
1.3.3 创新点
第二章 磁珠法核酸提取试剂盒的设计研发
2.1 基于磁珠法的核酸提取实验方法研究
2.2 核酸提取试剂基础研究
2.2.1 DNA提取与纯化
2.2.2 RNA提取与纯化
2.3 核酸提取试剂盒的研发
2.3.1 核酸提取试剂配方研究
2.3.2 核酸提取试剂分装方式设计
2.3.3 核酸提取方法优化
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 小型磁珠法核酸自动提取仪的设计研发
3.1 小型磁珠法核酸自动提取仪工作原理
3.2 仪器结构设计
3.3 仪器电路设计
3.4 人机交互设计
3.4.1 核酸提取程序选择的交互设计
3.4.2 核酸提取程序自定义定制的交互设计
3.4.3 核酸提取程序运行的交互设计
3.5 仪器性能测试与优化
3.5.1 实验材料
3.5.2 实验方法
3.5.3 结果与分析
3.6 讨论
3.7 小结
第四章 小型核酸自动提取系统的验证对比
4.1 实验材料
4.1.1 实验样本
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 DNA提取方法
4.2.2 实时荧光PCR检测
4.2.3 DNA提取效率的评价
4.2.4 检测灵敏度的评价
4.2.5 抑制剂去除效果的评价
4.2.6 DNA提取稳定性的评价
4.3 结果与分析
4.3.1 DNA提取效率比较结果
4.3.2 检测灵敏度比较结果
4.3.3 抑制剂去除效果比较结果
4.3.4 DNA提取稳定性比较结果
4.3.5 DNA提取方法综合比较
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 总结与展望
5.1 论文总结
5.2 研究展望
参考文献
致谢