辅助孵化 (assisted hatching, AH) 应用于冻融胚胎移植已有十几年的历史, 利用不同的方法, 如激光法、机械切割法、酸化法等对透明带进行薄化、打孔或者去除, 可以提高胚胎孵出率, 从而提高临床妊娠率。大量的研究表明, 激光辅助孵化法是一种简便、快速、安全的方法[1]。目前已成为很多中心的常规辅助孵化法。关于激光辅助孵化的研究报道很多, 而对于冷冻复苏胚胎, 选择什么时间做辅助孵化最合适的报道目前尚未发现。本研究以我中心713个冻融胚胎移植周期为研究对象, 分析激光辅助孵化以及辅助孵化时机对不同年龄患者的冻融胚胎种植潜力的影响, 旨在探讨激光辅助孵化在冻融胚胎移植中的临床意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象
以2009年5月至2010年5月在本中心行F-ET的713个周期1931个胚胎为研究对象, 胚胎来源于常规IVF和卵浆内单精子注射 (ICSI) 。胚胎复苏后培养16~18h后移植。
1.2 方法
1.2.1 胚胎冷冻
发育到第3天的胚胎, 移植后剩余的可冷冻胚胎利用程序化冷冻法进行冷冻保存。在室温下, 将待冷冻胚胎以2~3枚胚胎为一组进行分组, 即每个麦管内装2~3枚胚胎。分组后的胚胎在冻融缓冲液内清洗后, 分别放入冷冻液 (8014#, Qunn’s Advantage TM1.5M propanediol Freezing Medium, USA) , 冷冻液 (8014#, Qunn’s Advantage TM1.5M propanediol, 0.1M Sucrose Freezing Medium, USA) 内各10min, 然后装入麦管内, 封好后放入程序冷冻仪内, 启动冷冻程序, 温度降至-7℃时植冰, 待温度降至-79℃时, 将麦管直接投入-196℃液氮内保存。
1.2.2 胚胎复苏
注:代表差异显著*P<0.05
冻存麦管从液氮中取出后在室温下保持40s后, 入31℃温水中30s, 随后根据蔗糖浓度逐次降低, 胚胎分别放入含0.5mol/Lsucrose解冻液 (8005#, Quinn’s Advantage, USA) 及0.2mol/Lsucrose解冻液 (8007#, Quinn’s Advantage, USA) 中, 时间均为10min, 随后胚胎入冻融缓冲液清洗6~7遍, 在显微镜下挑出存活胚胎 (≥50%完整卵裂球) , 移入囊胚培养液1029 (Quinn’s Advantage, USA) 内, 在37℃, 5%CO2及饱和湿度培养箱内培养待移植。
1.3 复苏后胚胎处理
本中心利用1148μm双极二氧化碳激光系统 (ZILOS-t k, Hamilton Thorne Biosciences, USA) 对F-ET胚胎均给予激光辅助孵化技术 (LAH) 。孵化的方法为:选择卵周隙相对较大或碎片集中区, 在透明带的内侧打孔, 对打孔附近的透明带进行薄化处理。
1.4 内膜准备
自然周期:根据阴道超声 (TVS) 监测, 优势卵泡直径≥16mm, 子宫内膜:7~8mm以上, 排卵后第3天为解冻日。激素替代周期:月经第4~5天开始用补佳乐, 内膜:7~8mm以上, 雌激素达到150~200以上, 用3d黄体酮后, 第4天为解冻日。
2 数据分析
各组间临床妊娠率比较采用SPSS/1010软件进行χ2检验、logistic回归分析, 运用SAS 812软件行正交设计资料的方差分析。
3 结果
不同年龄段辅助孵化组与非辅助孵化组间妊娠率的比较, 年龄<35岁的患者进行冻融胚胎移植, 辅助孵化对临床妊娠率没有影响;而年龄>34岁的患者进行冻融胚胎移植, 辅助孵化组与非辅助孵化组间临床妊娠率没有显著差异, 但是, 辅助孵化组的临床妊娠率高于辅助孵化组。结果见表1。
选择复苏后培养不同时间做辅助孵化, 结合年龄分组。结果见表2。<35岁的, 复苏后立即行辅助孵化组的临床妊娠率高于复苏后培养16~18h行辅助孵化组, 但没有显著差异;而>34岁的患者, 差异显著 (P<0.05) 。 (表2) 。
4 讨论
对患者移植后剩余的优质胚胎进行冷冻保存, 已成为各生殖中心的常规, 这样可以增加患者妊娠的机会, 减轻患者的经济负担和促排卵用药的风险。然而, 由于冻融过程中细胞内冰晶形成和渗透压效应导致卵裂球受损, 以及透明带硬化等原因, 使得冻融胚胎移植周期的临床妊娠率和胚胎种植率更低, 即使两者的胚胎质量和囊胚形成率没有明显差异[2]。目前的研究认为, 透明带在暴露于极低的温度后变硬导致的胚胎孵出困难是造成这种现象的主要原因。人类胚胎透明带有内外两层, 富有弹性而不易薄化和扩张的内层是造成胚胎孵出困难的主要障碍。大量的研究表明, 对透明带最适宜的薄化范围应是:深度达致密层, 相当于透明带厚度的50%~80%, 宽度约相当于透明带总长的1/4[3]。研究认为采用正确的操作方法可以有效避免激光的热效应[4]。本研究选择在卵周隙相对较大或碎片相对集中区域的内层打孔, 然后围绕孔进行透明带的薄化处理, 尽量避免热效应和突变效应。结果显示, 胚胎培养一段时间后并未发现卵裂球退化现象。
Hsieh等认为, 相对于化学法, 激光法可以显著提高胚胎种植率、妊娠率及分娩率[5]。Kung等采用激光法对d3胚胎的透明带进行薄化后培养至囊胚, 部分移植部分冷冻, 也同样获得了理想的妊娠率和种植率[6]。同样, Blake等的研究也表明激光法可以显著提高囊胚的孵出率[7]。而Ng E等发表了第一个前瞻性的双盲随机研究认为激光辅助孵化不能提高冻融胚胎的种植率和临床妊娠率对于大龄患者也无益处, 虽然透明带厚度≥16μm时AH组种植率增加, 但仍未达到统计学意义[8]。本研究中, 患者年龄<35岁组中, 激光辅助孵化对临床妊娠率没有影响;>34岁组, 激光辅助孵化技术能够提高临床妊娠率, 但相对于对照组, 差异不显著。这提示:激光辅助孵化技术对年龄较大患者有一定的作用。这与张琪瑶等的研究结果相似[9]。
本研究选择胚胎复苏后和移植前进行辅助孵化。从研究的结果来看, 在胚胎复苏后立即行辅助孵化能够提高临床妊娠率, 尤其对>34岁患者, 效果明显。原因可能是冷冻胚胎复苏后, 卵裂球还没有恢复正常, 处于紧缩状态, 卵周隙相对较大, 而利用低脉冲进行辅助孵化时, 激光热效应指示环显示最低热效应扩散的外环 (即50℃) 会远离卵裂球, 从而最大限度的减少了热效应对卵裂球的损伤。另外, 本研究采用激光打孔和透明带削薄结合方法, 从而增强了透明带的渗透性, 有利于卵裂球复原和胚胎发育。胚胎培养16~18h即移植前进行辅助孵化, 孵化组与非孵化组没有差异这与Basak B等的研究结果相反。Basak B等采用胚胎复苏培养至第2天移植, 在移植前进行激光辅助孵化, 结果显示激光辅助孵化能显著提高冻融胚胎的种植率、临床妊娠率以及多胎率[10]。原因可能冻融胚胎培养16~18h后, 胚胎已完全恢复正常, 并已继续发育, 卵周隙进一步变小, Basak B等采用透明带削薄法, 对胚胎损伤小, 而本研究采用打孔结合削薄法, 激光打孔时, 激光热效应更难避开部分卵裂球, 热效应会对卵裂球的发育产生一定的影响影响妊娠率。
总之, 本研究结果提示只要选择合适的孵化方法和孵化时机激光辅助孵化有助于提高冻融胚胎的临床妊娠率, 尤其对高龄患者。
摘要：目的 分析不同年龄段患者的胚胎冻融后进行激光辅助孵化对临床妊娠率的影响。方法 对713例患者, 根据年龄、是否辅助孵化、培养不同时间后行辅助孵化进行分组, 比较各组间临床妊娠率。结果 <35岁的患者, 2组临床妊娠率无差异;而>34岁的患者, 临床妊娠率AH组高于非AH组, 但无显著差异。复苏后立即对胚胎行辅助孵化再培养, 相对于复苏后培养16～18h于移植前行辅助孵化对提高临床妊娠率更有帮助, 尤其对高龄患者, 作用更明显 (P<0.05) 。结论 辅助孵化技术的应用对冻融胚胎移植妊娠率的提升有一定帮助, 尤其是胚胎复苏后立即行辅助孵化能显著提高高龄患者的临床妊娠率。
关键词：冻融胚胎,激光辅助孵化,临床妊娠率
参考文献
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