苦苣菜 (Sonchus oleraceus L.) 系菊科 (Compositae) 苦苣属 (Sonchus) 1～2年生的草本植物。广泛分布于我国的东北三省、内蒙古、日本国等地。可全草入药, 味苦, 性寒。具有清热解毒, 凉血止血等作用。主治肠炎、痢疾、黄疸、咽喉肿痛、吐血、尿血等症[1]。
国内外对苦苣菜化学成分和药理活性的报道较多。文献报道, 苦苣菜的水提液对动物耐缺氧和急性心肌缺血具有明显的保护作用[2];苦苣菜总黄酮对实验性肝损伤具有明显的保护作用[3];苦苣菜酸性提取物具有抗肿瘤作用[4];苦苣菜提取物具有明显的抗炎和抗凝血作用[5];苦苣菜水提液对亚硝基和羟基自由基均有很强的清除作用[6];苦苣菜提取物对小鼠具有明显的抗伤害性疼痛的作用[7];苦苣菜对老鼠的抗焦虑样作用[8]。
据报道, 胡佩卓等[9]研究了苦苣菜的脂溶性化学成分。徐燕等[10]对中国安徽大别山区苦苣菜的化学成分进行了研究。白玉华[11～12]连续对日本产苦苣菜的化学成分进行了研究。周桂芬[13]通过不同提取方法, 采用紫外-可见分光光度法测定苦苣菜总黄酮的含量。但国内外均未见对苦苣菜α-葡萄糖苷酶抑制活性研究的报道。
α-葡萄糖苷酶抑制剂可有效降低餐后高血糖, 如今已作为治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物类型[14]。本文利用体外α-葡萄糖苷酶抑制筛选模型对苦苣菜提取物进行了α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究, 以期为苦苣菜开发利用提供科学依据。
1 仪器与材料
Multiskan MK3酶标仪 (美国Thermo Electron公司) ;LRH-150恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司) ;DELTA320型PH计 (美国Mettler-Toledo公司) ;电子天平 (美国Mettler-Toledo公司) ;旋转蒸发仪 (德国Heidolph公司) 。
α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase, EC 3.2.1.20, 美国Sigma公司) ;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside, PNPG, 026K1516, 美国Sigma公司) ;阿卡波糖 (Acarbose, Lot16869, 德国SERVA公司) ;4-硝基苯酚 (4-Nitrophenol, PNP, 10116387, 美国Alfa Aesar公司) 和二甲亚砜 (DMSO) 。
苦苣菜样品于2008年7月采于内蒙古阿拉善盟额济纳旗进样, 经河南大学天然药物研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定为菊科植物Sonchus oleraceus Linn., 标本存放于河南大学天然药物研究所。
注:NT表示未测定。
2 实验方法
2.1 提取
苦苣菜全草阴干, 粉碎, 石油醚浸泡12h后, 于索氏提取器中连续回流提取, 提取3次, 每次1h, 浓缩, 得石油醚提取物。挥干溶剂后, 依次用乙酸乙酯、甲醇浸泡12h, 回流提取3次, 每次1h, 得乙酸乙酯提取物、甲醇提取物。
2.2 抗氧化活性筛选方法
2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法
2.2.2 α-葡萄糖苷酶活力的测定
酶活力单位定义:37℃, pH6.8系统条件下, 每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚的酶量, 定义为一个酶活力单位 (U) 。
酶活力测定:1 1 2μL磷酸钾缓冲液 (pH6.8) , 加入0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶20μL, DMSO 8μL, 37℃恒温15min后加入2.5 m m o l/L P N P G 2 0μL, 3 7℃恒温反应15min。再加入0.2mol/L的Na2CO3溶液80μL, 于405nm波长下测OD值。
2.2.3 标准曲线制作
根据采用的反应体系, 用磷酸缓冲液 (pH6.8) 配置1000μmol/LPNP, 稀释成400、300、200、150、100、50、25、5和0μmol/L。分别取7种不同浓度的PNP溶液各160μL, 加入0.2mol/LNa2CO3溶液80μL, 混匀, 在405nm下测定OD值, 测三组取算术平均值。以OD值为纵坐标, 对硝基苯酚浓度为横坐标, 做出标准曲线。
2.2.4 苦苣菜对α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测
将苦苣菜各提取物以D M S O溶解, 并存储于4℃冰箱中。以张丽等[15～17]建立的9 6微孔板筛选方法, 4 0 5 n m处检测其O D值。同时做相同体系下的样品空白组, 不加样品和酶与底物的空白对照组、不加样品的阴性对照组和以阿卡波糖为抑制剂的阳性对照组。并用Origin软件求出相应的IC50值。
3 结果与讨论
3.1 各提取物的抑制活性
表1显示, 苦苣菜的石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。从表1可以看出该植物各提取物在质量浓度为1500μg·mL-1时, 石油醚和乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较, 且均高于阳性对照药阿卡波糖 (55.63%) , 表明苦苣菜具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
为进一步研究抑制活性, 对苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物的初筛终浓度依次对半稀释进行IC50值计算。从表1可以看出, 不同溶剂比较, 苦苣菜的石油醚提取物的IC50值最小 (IC50=33.25μg·mL-1) , 显示其抑制效果最好, 其次为乙酸乙酯提取物 (IC50=1909.14μg·mL-1) 。说明苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物具有很好的抑制活性。
3.2 提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响
图1显示, 苦苣菜的不同极性提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈剂量依赖性, 其中石油醚提取物在质量浓度小于93.75μg·mL-1时, 抑制率达到了最大值100%, 此后, 再增加提取物浓度抑率也不再变化, 出现“平台期”。Acarbose在实验质量浓度范围内, 抑制率随质量浓度的增加而增大, 几乎呈线性增长。说明苦苣菜石油醚提取物具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
4 结语
本实验利用课题组建立的一种简单的α-葡萄糖苷酶抑制作用的微量筛选模型, 对苦苣菜的不同提取物进行酶抑制活性筛选。
实验结果表明, 苦苣菜的石油醚和乙酸乙酯提取物具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性, 各提取物的抑制活性均与浓度呈正相关性, 说明其抑制活性具有剂量依赖性;提取物的抑制活性与提取极性有关, 石油醚提取物的抑制活性高于乙酸乙酯提取物, 且远远好于Acarbose的抑制活性。表明可以对该提取物进行活性成分追踪。
摘要：采用索氏提取法提取苦苣菜全草, 以96微孔板法测定苦苣菜不同极性提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制作用, 并与阳性对照Acarbose进行比较, 发现苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物均有较好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。苦苣菜的石油醚提取物的抑制效果最好 (IC50=33.25μg·mL-1) , 其次为乙酸乙酯提取物 (IC50=1909.14μg·mL-1) 。石油醚提取物远远大于阳性对照Acarbose (IC50=1103.01μg·mL-1) 的抑制活性。不同溶剂的提取物比较, 苦苣菜石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果很好, 具有良好的潜在开发价值。
关键词：α-葡萄糖苷酶抑制剂,苦苣菜
参考文献
[1] 江苏新医学院.中药大辞典 (上册) [M].上海:上海出版社, 1986:1286.
[2] 卢新华, 黄晓梅, 彭礼硕.苦菜水提液对动物耐缺氧和急性心肌缺血的保护作用[J].中医药研究, 1998, 14 (2) :32～34.
[3] 卢新华, 陈虎云, 戴俊, 等.苦菜总黄酮对实验性肝损的保护作用[J].中国现代医学杂志, 2002, 2:22～24.
[4] Hata K, Ishikawa K, Hori K, et a1.Differentiation-inducing activity of lupeol, a lupine-type triterpene from Chinese dandelion root (Hokouci-kon) , on a mouse melanoma cell line[J].BiolPharm Bull, 2000, 23 (8) :962～967.
[5] 卢新华, 唐伟军, 谢应桂, 等.苦菜提取物抗炎作用的实验研究[J].中国新医药科技, 2006, 13 (4) :240～241.
[6] 林敏, 安红钢, 白俊杰, 等.苦苣菜提取液对亚硝基及·OH清除活性的研究[J].中国野生植物资源, 2008, 27 (4) :53～58.
[7] Fabiana Cardoso Vilela, Roseli Soncini, Alexandre Giusti-Paiva.Anxiolytic-like effect of Sonchus oleraceus L.in mice[J].Journal of Ethnopharmacology, 2009, 124 (2) :325～327.
[8] Fabiana Cardoso Vilela, Marina de Mesquita Padilha, Lucas dos Santos-e-Silva, et al.Evaluation of the antinociceptive activity of extracts of Sonchus oleraceus L.in mice[J].Journal of Ethnopharmacology, 2009, 124 (2) :306～310.
[9] 胡佩卓, 邹传宗, 祝英.苦苣菜脂溶性化学成分[J].西北植物学报, 2005, 25 (6) :234～237.
[10] 徐燕, 梁敬钰.苦苣菜的化学成分[J].中国药科大学学报, 2005, 36 (5) :411～413.
[11] 白玉华, 安政, 张维冰.日本苦苣菜Sonchus oleraceus L.的化学成分研究[J].齐齐哈尔大学学报, 2007, 23 (1) :1～3.
[12] 白玉华, 于辉, 常乃丹, 等.日本苦苣菜的化学成分[J].中国药科大学学报, 2008, 39 (3) :279～281.
[13] 周桂芬, 张涵, 吕圭源.苦苣菜中黄酮类化合物的含量测定[J].中华中医药学刊, 2008, 26 (1) :218～220.
[14] 陈静, 程永强, 刘晓庆, 等.食品中α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J].食品科学, 2007, 28 (4) :360～362.
[15] 陈百泉, 李昌勤, 常星, 等.头花蓼对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究[J].中国实验方剂学杂志, 2010, 16 (8) :151～153.
[16] 康文艺, 张丽, 宋艳丽.茜草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究, 中国中药杂志, 2009, 32 (5) :1104～1107.
[17] 康文艺, 张丽, 宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中国中药杂志, 2009, 34 (4) :406～409.