糖化血红蛋白 (Hb A1c) 目前被公认是评价糖尿病患者长期血糖控制的 “金标准”, 2010 年美国糖尿病学会 (ADA) 已将Hb A1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准之一[l]。 在我国患有糖尿病的人数较多, 因此准确无误的诊断和治疗糖尿病非常重要。 目前糖化血红蛋白检测的标准化程度越来越高, 在临床糖化血红蛋白上会得到广泛应用, Hb A1c对糖尿病的诊断以及治疗有着重要的意义。 临床实验室进行Hb A1c测定的具体方法包括高效液相色谱法 (HPLC) 、免疫法、亲和层析色谱法和电泳法等, 其中高效液相色谱法具有应用范围非常广, 方法准确性和精确度高的优点。 伯乐D-10 采用的是离子交换高效液相色谱法检测Hb A1c。
1 实际工作中出现的问题与解决方法
D-10 血红蛋白A1c测定仪采用的是离子交换高效液相色谱法 (IE-HPLC) , 标本类型为2 m L EDTA-K2抗凝静脉血标本或用稀释液处理的预稀释样本, 每个样本在3 min内即可完成测定, 该仪器是通过美国国家糖化血红蛋白标准化计划认证的仪器, 其参考物质可追溯到对糖尿病的控制和减轻并发症的临床研究, 可为临床提供快速准确的Hb A1c检测服务。 Hb A1c测定的准确性与否直接影响临床治疗的效果, 确保Hb A1c测定结果的正常极其关键。
在实际工作过程, 有时会遇到糖化血红蛋白结果与临床不符或无法解释的结果, 对于这些情况通过回顾该院多年来累计的Hb A1c异常处理数据分析, 将我们在实际工作中遇到的问题与解决方法大致分类如下:
1.每次分析的色谱峰下总面积范围应在1, 000, 000到4, 000, 000 μvolt秒在之间, 若超出此范围则不能报出结果。 处理方法: 手工稀释样本重做, 低于1, 000, 000μvolt1·秒的样本, 取大于10 u L全血样本+1.5 m L稀释液;高于4, 000, 000 μvolt·秒的样本, 取少于5 u L全血样本+1.5 m L稀释液。
2. 异常低值 (<4.0) 、 异常高值 (>18.0) 或无A1c峰 (unknown峰>5.0%) , 提示患者血中存在血红蛋白变异体。 处理方法:患者不适合使用HPLC法测定Hb A1c, 可更换其他检测原理的仪器测定 (如免疫法) , 也可建议临床采用其他替代指标, 如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或连续监测血糖。 另外可再对血红蛋白变异体类型的检测, 以查明病因。
3.检测到已知血红蛋白变异体干扰。 D-10 可以识别Hb F、Hb S和Hb C等常见的异常血红蛋白 (见图1-3) , 在Hb F (<10%) 、Hb S和Hb C存在时, 一般不影响Hb A1c检测的准确性。 可是使用的方法以及平台不同, 那么Hb S对离子交换色谱法得出的检测结果也会有不同的影响。 其中不受Hb S影响的是Tosoh G7、HA8160方法, 但对于Bio-Rad Variant高效液相系统来说, Hb S的影响具有不确定性, 有些时候如在Hb A1c范围较低时, 糖化血红蛋白的值就会偏高。 也有些时候Hb A1c的值由于层析柱及试剂的批次不同就不会受到影响。 处理方法:在D-10 识别出异常血红蛋白时, 观察色谱图, 若Hb F<10%, 可不作处理, 若Hb F≥10%, 则提示患者不适合测定Hb A1c, 可建议临床采用其他与Hb A1c等同的指标进行检测, 比如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或者全程测定血糖。 Hb A1c的范围要适中, 检测时要选择好层析柱和试剂的批次。 图1-3:
4.检测结果偏低或偏高。 由于糖化血红蛋白在红细胞内是连续缓慢合成的, 一些疾病会导致红细胞寿命变短从而也会缩短糖化血红蛋白形成的时间, 检测结果就会有一定的影响。 一些疾病如肝硬化、脾肿大、糖尿病等引起的继发性溶血, 使检测结果偏低。 处理方法: 促红细胞生成素治疗和严重贫血患者需要进行输血治疗, 这也会根据不同的测定方法干扰影响糖化血红蛋白检测结果, 因此需要选择合适的检测方法。 Vitamin C和Vitamin E能够抑制血红蛋白糖基化, 测定结果假性降低。 当缺铁性贫血患者的血糖浓度保持不变、 红细胞数目减少的时候, 糖化血红蛋白测定值升高, 使用铁剂进行治疗, 100 mg/d十二周后, 因幼红细胞降低了血红蛋白的浓度, 使糖化血红蛋白平均值下降。
5.L-糖化血红蛋白是糖化血红蛋白的初期反应产物, 由于其结构不稳定, 会因为血糖浓度改变, 能够水解成葡萄糖和血红蛋白, 也能够继续反应生成醛胺。 因此L-糖化血红蛋白会影响糖化血红蛋白的测定结果。因为硼酸盐亲和色谱法以及免疫法不需要测定L-糖化血红蛋白, 所以没有影响。 但离子交换色谱法受到LA1c影响非常大。 处理方法:使用溶血剂对全血样本进行处理, 把产物置于37℃的等渗液, 在其中进行孵育6h。 或者使用硼酸盐亲和色谱法和免疫法进行检测。
6.Hb A1c变异率非常低, 稳定性好, 个体内日间差不大, 即使标本在室温下放置3~14 d也不会对测定结果造成非常大的影响。 通过检测不同温度下保存的全血标本, 说明了全血标本4~8 ℃保存50 天内, 检测结果与新鲜标本没有很大差别; 在17~23℃保存7 d后, 所测结果则明显低于新鲜标本; 在~20 ℃下保存28 d后, 检测结果也明显低于新鲜标本。 处理方法:若全血标本不能及时测定, 需将其于4~8℃保存, 若无特殊情况, 最好在15 d内测定标本, 那么Hb A1c检测结果可能会相差不大。
7. 发病迅速的Ⅰ型糖尿病患者由于血糖在短期内升高到一定水平, 而由葡萄糖的游离醛基和末端Valine连接, 或葡萄糖的游离醛基和血红蛋白上的游离Lysine形成席夫碱, 然后经过糖基化分子重排, 形成具有稳定结构的糖基化产物, 合成Hb A1c。 其反应过程非常缓慢, 与血糖达到平衡可能需要几周时间。 但是Hb A1c的水平往一般正常或上升极小, 并不能准确反映升高的血糖水平。 肾病患者由于体内尿素的浓度较高, 尿素不需外界条件就能分离形成氨和氰酸盐, 然后氰酸盐经质子化作用后形成异氰酸, 异氰酸与蛋白质的基团进一步反应形成氨基甲酰。Valine可与异氰酸发生特异性的反应, 形成氨基甲酰血红蛋白。 如果患者体内的氨基甲酰血红蛋白浓度高于5.4%, 就会对Hb A1c的测定产生影响, 可能为假性偏高。 处理方法:需要询问患者是否为Ⅰ型糖尿病患者、肾病患者, 对Ⅰ型糖尿病患者、肾病患者可能需要其他指标来检测, 不能用离子交换高效液相色谱法进行检测。
2 结果评价
Hb A1c是血红蛋白在血中与葡萄糖经过长期缓慢的非酶促糖化反应形成的不可逆的酮胺类物质, Hb A1c水平与血糖的平均浓度及血红蛋白的循环寿命相关。由于正常情况下红细胞在血液循环中的寿命约为120 d, Hb A1c可作为是判断糖尿病长期控制情况的良好指标。 在实验室检测过程中, 需要注意对Hb A1c结果正确性的判断, 排除可能存在的干扰因素。
实验室报告Hb A1c结果, 需要了解所使用检测方法的干扰因素。 最主要的干扰因素的是异常血红蛋白 (Hb F) 和血红蛋白变异体。 目前已发现的血红蛋白变异体超过700 种, 但最常见的是Hb S、Hb C和Hb E[2]。 对采用IE-HPLC法的D-10 来说, NGSP网站 (http://www.ngsp.org/factors.asp) 公布的具有干扰作用的因素是Hb F (>10%) [3]。 因此在仪器提示存在Hb F (>10%) 的时候, 要避免发出错误的结果。对于Bio-Rad Variant高效液相系统来说, 同时需要注意Hb S的影响具有不确定性, 可能在Hb A1c范围较低时, 糖化血红蛋白的值就会偏高, 也可能由于层析柱及试剂的批次不同而没有影响。
使用HPLC法检测Hb A1c, 报告结果时需要观察色谱图。 除上述所描述的干扰因素外, 还有许多其他病理情况以及未发现的干扰因素, 例如慢性肾衰病人、β型地中海贫血病人特殊血红蛋白变异体[4]等。 仔细的阅读色谱图, 会发现是否存在这些特殊物质, 从而避免发出错误的报告。 同时要注意标本的保存温度[5], 标本不能及时测定时, 需将其在4-8℃保存, 才能保证准确性, 否则检测结果会偏低。
实验室报告结果需要考虑患者临床情况。 某些病理情况下, 疾病或会影响红细胞在血液循环中的寿命, 例如急性失血、溶血性贫血会使Hb A1c假性降低[6];缺铁性贫血会使假性升高[7]。 此外输血、白血病也会间接对Hb A1c的水平产生影响[8]。
总之, 异常血红蛋白、血红蛋白变异体、某些疾病药物以及其他未知的干扰因素会对实验室报告的Hb A1c结果产生干扰, 若得出的报告检测结果偏低, 对测定以及治疗高血糖具有很大影响, 同时增大并发症发生的几率。 若得出的报告检测结果偏高, 会使判断失误, 治疗力度过大, 反而加大低血糖发生的几率。 所以, 检测人员在得出报告时如果发现出现的结果是Hb A1c异常, 或与临床诊断的结果不一致时, 为了避免发生干扰, 考虑使用其他合适的检测方法, 或建议临床选择其他与Hb A1c等同的指标进行检测, 比如糖化血清蛋白、糖化白蛋白或者全程测定血糖, 保证糖化血红蛋白的检测方法可以与临床需求相一致。 如有条件, 再继续进行探究, 比如进行血红蛋白变异体的鉴定等。
3 结语
在使用D-10 糖化血红蛋白分析仪检测并报告Hb A1c结果时; 首先要了解所使用检测方法的干扰因素, 其次要仔细观察色谱图, 判断是否存在异常血红蛋白或血红蛋白变异体, 或其他干扰因素;如遇到特殊结果或与血糖不符的结果时, 还要结合病人的临床实际进行综合判断, 为临床提供准确的报告以及合理的结果解释。
摘要：目的 总结D-10糖化血红蛋白A1c (Hb A1c) 分析仪在检测过程中的常见问题和结果分析。方法 回顾分析已检测样本及其色谱柱图。结论 在报告伯乐D-10糖化血红蛋白分析仪的检测结果时, 要了解该仪器的干扰因素, 仔细观察其色谱柱图, 判断是否存在血红蛋白变异体或其他干扰, 结合临床提供更准确更全面的结果解释。
关键词：糖化血红蛋白,D-10,异常血红蛋白,血红蛋白变异体
参考文献
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[3] Little RR, Rohlfing CL, Hanson SE, et al.The Effect of Increased Fetal Hemoglobin on 7 Common Hb A1c Assay Methods.Clin Chem, 2012 (58) :945.
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[5] 索艳, 李强.糖化血红蛋白测定方法及影响因素的研究进展[J].医学研究生学报, 2010, 23 (2) :211-212.
[6] Goldstein DE, Little RR, Lorenz RA, Malone JI, Nathan D, Peterson CM:American Diabetes Association Technical Review on Tests of Glycemia.Diabetes Care, 1995, 18:896-909.
[7] Sundaram RC, Selvaraj N, Vijayan G etal:Increased plasma malondialdehyde and fructosamine in iron deficiency anemia:effect of treatment.Biomed Pharmacother, 2007, (61) :682.
[8] 苏作军.糖化血红蛋白不同测定法的评价[J].检验医学, 2004, 19 (6) :514-517.