第一篇：微生物学实验要求
微生物学实验基本要求
微生物学实验基本要求及成绩评定
一、思想和态度要求
1、树立严谨认真的科学态度
2、理解与验证基本原理
3、掌握并不断提高分析和解决问题的方法
4、启迪创新思维
二、具体要求
1、实验前5-10分钟到达实验室。迟到1次扣除0.5分，无故一次不到扣除1分。
2、每次实验前预习实验的目的、原理和方法，做到心中有数。
3、实验前洗手，保持试验台清洁，保持室内安静。
4、实验过程中要严格无菌操作、防止杂菌污染。
5、实验过程中，严格按正确方法操作实验仪器。
6、实验过程中认真及时做好实验记录。
7、实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃品接近火焰。如遇火险，先关掉火源，再用湿布掩灭，必要时用灭火器。
8、每次实验完成后，清洁试验台，各种物品放回原位。
9、带菌材料的处理：含菌培养基应灭菌后再作为垃圾处理。
10、由于操作不当损坏玻璃器皿，先登记姓名，并扣分，每件1分。
11、认真按要求完成实验报告。
三、微生物学实验成绩评定
1、基础和综合实验80%
每次实验5分，其中实验操作3分，实验报告2分
2、实验考试10%
实验理论和实验操作各为5分
3、自主设计实验10%
包括实验设计、实验操作、实验结果、汇报交流，共10分
第二篇：微生物学实验目的内容与要求
一、 微生物学实验内容与目的
微生物学实验内容包括：培养基的制备及灭菌;从土壤中分离和纯化微生物;细菌染色及形态观察;放线菌、酵母菌和霉菌形态观察;微生物显微计数和大小测量;E.coli生长曲线的测定;细菌的生理生化反应;环境因素对微生物生长的影响;微生物的诱变育种;产淀粉酶菌株的分离纯化;水和饮料中细菌学检查;食用真菌的采集、分离和培养;抗药性突变株的筛选。
微生物学实验课的目的在于通过一系列实验项目，使学生能比较熟练地掌握微生物学实验的操作方法和技能;学会进行综合实验的设计、准备、操作和结果分析;培养学生对实验原理、方法和结果的正确理解，仔细观察，认真思考的科学素养和分析问题和解决问题的科学能力。
二、 微生物学实验室要求与安全
为了确保微生物学实验课质量，提高实验效果，并保证实验室的安全，特提出如下要求，希望共同遵守。
(1)实验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，写出实验设计方案。在课堂上注意聆听老师对实验内容的讲解，注意观察教师的示范操作，以掌握实验操作的要领。
(2)进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。
(3)非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。
(4)实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。
(5)实验中注意正确使用试剂，按操作规程使用仪器，遇到仪器故障时请老师帮助解决，切勿擅自折卸，否则因此而损坏仪器，应予以赔偿。
(6)用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记好材料名称、姓名、日期后送到指定位置。
(7)实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应关闭电源，用湿布阻燃灭火，必要时使用灭火器。
(8)实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并将操作台擦
拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。
(9)离室前脱下工作服，反折放在指定的地方;双手在2%来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。
第三篇：食品微生物检测实验室要求
自来水水池至少有两个，工作台，药品试剂柜，超净工作台(无菌室)，灭菌锅，培养箱，冰箱，干燥箱，电子天平，显微镜，平皿，试管，三角瓶等玻璃器皿。这些都是必备基本设备，只要能摆放的下就可以。
一 、微生物实验室设计
微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。
二、微生物实验室基本要求
(一)准备室
准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。
(二)洗涤室
洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。
(三)灭菌室
灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。
(四)无菌室
无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。 1. 无菌室的设置
无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：
(1)无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5=5m2，外间面积1×2=2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。
(2)内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上;外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。(3) 在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。
(4)无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上(即离工作台最远的位置)，最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。
2. 无菌室内设备和用具
(1)无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。
(2)在内室和外室各安装一个紫外灯(多为30W)。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。
(3)外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。
(4)内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。 3. 无菌室的灭菌消毒
(1)薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。 (2)喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。
(3)紫外线照射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射30～60min。
(五)恒温培养室1. 培养室的设置
(1)培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4=14m2左右，外室面积在3.2×1.8=6m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。
( 2)分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。 (3)为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。 (4)内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。 2. 培养室内设备及用具 (1)内室通常配备培养架和摇瓶机(摇床)。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。 (2)外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。
3. 培养室的灭菌、消毒 同无菌室的灭菌、消毒措施。 小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。
(六)普通实验室
进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。
第四篇：食品卫生微生物检验实验室操作要求
食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。
一、无菌操作要求
1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净。
4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求
1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
3.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置
三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
(一)干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法
1.灭菌前准备
(1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
(2)装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
2.装放
(1)干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
(2)大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
3.设备检查
(1)检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
(2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
(3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。
4.灭菌处理
(1)干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。
②灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。
③菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5 –2h。
④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。
(2) 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：
①手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L(重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换).
②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)。
③盖好顶盖拧紧，勿使漏气;置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气10-15min)。
④关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间(按灭菌物品性质与有关情况而定)。
⑤达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
(3) 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：
① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。
②夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。
③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至
④自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。
⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。
5.灭菌温度与时间(1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。(2)压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间
(二)间歇灭菌方法
1.灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。
(1)将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。
(2)关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。
(3)灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。
2.血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。
(1) 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。
(2)将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。
3.煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.
4.灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。
(1) 物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。
(2) 取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。
(3) 培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
(4) 启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。
(5)取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。
(6) 取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
(7) 凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
(8) 每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
四、有毒有菌污物处理要求
微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。
1.经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。
2. 经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。
3.染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h(消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30min高压灭菌。
4.涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
5.打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。
污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
五、培养基制备要求
培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：
1.根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2.PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。
3.培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。
4.盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。
5.培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。
6.每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
7.目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。
8.每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。
六、样品采集及处理要求
1.所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。
2.根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。
3.采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。
4.样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。
5.检验室收到样品后，进行登记(样品名称、送检单位、数量、日期、编号等)，观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。
(1) 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。
(2)瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者(食物中毒样品除外)。
(3) 按规定采样数量不足者。
对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。
6.样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。
(1) 液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。
(2)固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。
(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。
七、记录和报告的要求
1.检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。
2.样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
八、特殊样品检验时的前处理
1.食品微生物检测需用灭菌蒸馏水进行稀释的样品有酱腌菜、酱油 2.对食醋样品的前处理是用20%-30%灭菌碳酸钠溶液调PH至中性
3.袋装鲜奶样品进行微生物检验时的处理用无菌手续吸取25mL检样+225mL稀释液 4.碳酸饮料等样品的前处理应开盖后将气体待充分排出，用无菌手续吸取25mL检样+225mL稀释液
5.冷冻食品应在45 ℃以下不超过15 min，或2 ℃～5 ℃不超过18 h 解冻后进行检验
第五篇：微生物学实验
细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。 本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。
一 显微镜直接计数法
(一)目的要求
1.明确血细胞计数板计数的原理。
2.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
(二) 基本原理
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养(短时间)以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台;中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2);另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。
图15—1 血细胞计数板构造
(一) 图15—2 血细胞计数板构造
(二)
A. 正面图;B.纵切面图; 放大后的方格网，中间大方格为计数室
1.血细胞计数板;2. 盖玻片;3.计数室
计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。
设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则
1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B(个)
同理，如果是16个中方格的计数板，
1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B(个)
(三)器材
1.菌种 酿酒酵母
2.仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。
(四)操作步骤
l.菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。
3.加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。
4.显微镜计数
加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
5.清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
(五)实验报告
l.结果
将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数;B表示菌液稀释倍数。
各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml
12345
第一室
第二室
2.思考题
(1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差.力求准确?
(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。
二 平板菌落计数法
(一)目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法。
(二)、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。
(三)器材
1.菌种 大肠杆菌菌悬液。
2.培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。
3.仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
(四)操作步骤
l.编号
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-
4、10-
5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-
1、10-
2、10-
3、10-
4、10-
5、10-6。
2.稀释
用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
OptionsEmail Replies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10?1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。
3，取样
用三支1mL无菌吸管分别吸取10-
4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。
不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
图15—3 平板菌落计数操作步骤
4.倒平板.
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。
待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
5.计数
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-
4、10-
5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。
涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
五、实验报告
1.结果
2.将培养后菌落计数结果填入下表
稀释度10-410-510-6
Cfu数/平板123平均123平均123平均
每毫升中的cfu
2.思考题
(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?
(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?
(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?
(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?
三 光电比浊计数法
一、目的要求
1.了解光电比浊计数法的原理。
2.学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。
光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。
图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理
(三)器材
1.菌种 酿酒酵母培养液
2.仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。
(四)操作步骤
1.标准曲线制作
(1)编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为
1、
2、
3、
4、
5、
6、7。
(2)调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×10
6、2×10
6、4×10
6、6×10
6、8×10
6、10×10
6、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。
(3)测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表
管号12345678
细胞数106/ml
光密度(OD)
每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定
(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。
各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。
3.根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。
(五)实验报告
l.结果
每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数
2.思考题
(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?
(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?
(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?
四 大肠杆菌生长曲线的测定
(一)目的要求
1.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。
2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。
(二)基本原理
大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。
图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶
(三)器材
1.菌种 大肠杆菌
2.培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。
3.仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。
图15—6 直接用试管测OD值
(四)操作步骤
1.标记
取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、
3、
4、
6、
8、
10、
12、
14、16和20h。
2.接种
分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。
3.培养
将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、
3、
4、
6、
8、
10、
12、
14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。
4.比浊测定
用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。
本操作步骤也可用简便的方法代替：
1.用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。
2.分别在培养0、1.5、
3、
4、
6、
8、
10、
12、
14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。
(五)实验报告
1.结果
(1)将测定的OD600值填入下表：
培养时间对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20
光密度值OD600
(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。
2.思考题
(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点?
(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。
(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?
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