论文题目：月季对蔷薇盘二孢（Marssonina rosae）入侵的防御机制研究
摘要：现代月季是全世界范围广泛栽培应用的著名花卉。黑斑病是月季露地栽培中最普遍、最严重的病害,常导致叶部形成黑色病斑,严重者导致叶片脱落,对月季的园林应用影响巨大,目前尚无对黑斑病完全免疫的品种。月季黑斑病致病菌为蔷薇盘二孢（Marssonina rosae）。本研究对月季抗病和易感株系响应蔷薇盘二孢的过程进行了转录组分析,探讨了生长素、茉莉酸和水杨酸对月季黑斑病抗性诱导的机制,利用外源激素喷施及月季离体叶片VIGS基因沉默技术,对易感、抗病株系响应蔷薇盘二孢入侵的防御机制的激活进行了研究,筛选出诱导或抑制防御机制的关键因子,初步阐明月季黑斑病广谱抗性的机制。主要研究结果如下:1.通过组织分离法获得了月季黑斑病致病菌单一菌株,利用该菌株对月季黑斑病抗病分离群体（Rosa‘Pocelina’×R.rugosa‘Dahong Zizhi’）进行抗性评价,获得6个抗病株系和12个易感株系。2.以抗病株系R13-54和易感株系R12-26为材料,比较了蔷薇盘二孢侵染月季过程中病程相关蛋白的活性,以及系统获得抗性的诱导情况,发现两株系防御反应均被激活,表现为双峰模式,两次高峰均分别发生在1-2dpi和10-12dpi,低谷均发生在4-6dpi,但R13-54的抗性诱导强度显著高于R12-26。3.对抗、感株系响应蔷薇盘二孢入侵过程中0hpi、36hpi、6dpi、12dpi的转录组进行了分析,发现抗、感株系被诱导了不同的差异表达基因,说明不同抗性月季对病菌入侵的响应显著不同;与对照组和侵染前相比,两株系中病源入侵特异性诱导的差异基因大量富集到与激素和细胞壁相关通路中。在响应早期,易感株系R12-26显著上调的基因富集到生长素、茉莉酸以及细胞壁代谢合成相关通路上,而这些基因在抗病株系R13-54中表现为早期下调,说明这些基因参与对R12-26中有效黑斑病抗性的负调控。4.外源干扰生长素、茉莉酸和水杨酸对两株系黑斑病抗性的影响表明:在易感株系R12-26中,黑斑病侵染早期,高水平的茉莉酸组成型积累与生长素共同抑制水杨酸信号通路,负调控黑斑病有效抗性的诱导;生长素通过促进茉莉酸积累与合成,削弱了水杨酸对茉莉酸的抑制,对黑斑病抗性进行负调控;当茉莉酸组成型高水平被抑制后,生长素则不参与对黑斑病抗性的负调控。5.建立月季响应蔷薇盘二孢侵染的离体小叶盘TRV介导的VIGS技术体系,利用该体系对7个激素相关基因进行沉默,分析了这些基因在月季黑斑病防御诱导中的功能。沉默生长素糖苷化基因Rc UGT74E1和生长素响应基因Rc AX15A后,促进水杨酸的合成,提高了月季黑斑病抗性;沉默Rc PIN1后,茉莉酸合成加速,影响了水杨酸对黑斑病有效抗性的诱导;蔷薇盘二孢侵染可诱导Rc SAMT的表达,促进SA转化为Me SA,参与对黑斑病的防御。这些结果进一步验证了茉莉酸和生长素通过协同作用,共同抑制水杨酸信号对黑斑病有效抗性的诱导。6.利用离体叶盘VIGS技术分析了4个细胞壁相关基因在黑斑病抗性诱导中的作用。结果表明,细胞壁降解相关基因Rc PLY18、Rc BXL1和Rc XYNC以及细胞壁加固相关基因Rc EXP15的沉默,均不同程度提高了月季对蔷薇盘二孢的抵抗,说明病源入侵导致细胞壁变化,负调控了月季对蔷薇盘二孢的有效防御。7.利用离体叶盘VIGS技术对4个细胞壁相关基因（Rc BXL1、Rc PLY18、Rc XYNC、Rc EXP15）进行沉默,结合4个基因响应外源激素干扰的表达模式分析发现,早期积累的茉莉酸抑制水杨酸的合成,诱导Rc PLY18强烈表达,导致果胶降解,促进了病害的发生。茉莉酸通过拮抗Rc BXL1诱导,抑制细胞壁合成,促进病害的发生;茉莉酸也可以通过促进水杨酸的积累,加强对Rc XYNC和Rc EXP15的抑制,提高对病源入侵的有效防御;但在响应黑斑病入侵的初期,茉莉酸积累的同时并未发生水杨酸积累,因此刺激了Rc XYNC和Rc EXP15的表达,加快了病害的入侵;Rc XYNC的表达可能依赖于生长素的积累,参与对抗病性的负调控,而Rc EXP15对病害的影响不是通过生长素起作用的。综上所述,高水平的茉莉酸组成型积累协同生长素共同抑制了水杨酸信号通路的激活,降低了月季对黑斑病的抗性;细胞壁的降解与生长素信号之间的串扰,进一步促进茉莉酸的合成,削弱了水杨酸对茉莉酸的抑制,降低了黑斑病抗性;但当茉莉酸的组成型高水平被抑制后,生长素则不参与对黑斑病抗性的负调控。上述研究结果为进一步阐明月季对黑斑病的有效防御机制提供了基础,为定向培育黑斑病高抗品种提供了依据。
关键词：月季黑斑病;蔷薇盘二孢;月季;转录组;VIGS;细胞壁;水杨酸;茉莉酸;生长素
学科专业：园林植物与观赏园艺
摘要
abstract
1 引言
1.1 国内外研究进展
1.1.1 月季黑斑病
1.1.2 月季黑斑病致病菌蔷薇盘二孢
1.1.3 月季黑斑病抗性评价
1.1.4 月季黑斑病抗性机制研究
1.1.5 月季黑斑病抗性育种进展
1.1.6 月季黑斑病分子生物学研究进展
1.1.7 月季黑斑病抗性的遗传规律
1.1.8 植物广谱抗病性
1.1.9 植物生长与病害防御之间的平衡
1.2 研究目的及意义
1.3 研究内容
1.4 本研究的技术路线
2 月季黑斑病易感和抗病株系的筛选
2.1 材料与方法
2.1.1 杂交群体构建
2.1.2 月季黑斑致病菌分离、纯化、鉴定
2.1.3 孢子悬浮液制备
2.1.4 离体叶片侵染
2.1.5 蔷薇盘二孢菌株致病性检测及部分蔷薇属资源黑斑病抗性评价
2.1.6 黑斑病抗性评价标准
2.2 结果与分析
2.2.1 蔷薇盘二孢的分离与纯化
2.2.2 蔷薇盘二孢rDNA‐ITS的序列分析
2.2.3 蔷薇属植物的黑斑病抗性评价
2.2.4 F1群体黑斑病评价
2.3 讨论
2.3.1 蔷薇盘二孢分类的必要性和重要性
2.3.2 常规杂交在月季黑斑病抗性育种中的重要性
2.4 小结
3 月季黑斑病抗病、易感株系对蔷薇盘二孢入侵的差异响应
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料
3.1.2 活体整株侵染
3.1.3 病程相关蛋白活性检测
3.1.4 NPR1基因表达模式分析
3.1.5 荧光定量PCR
3.1.6 数据处理与分析
3.2 结果与分析
3.2.1 病程相关蛋白在病害发生过程中的活性变化
3.2.2 月季响应蔷薇盘二孢入侵的防御系统激活模式
3.3 讨论
3.4 小结
4 月季黑斑病易感和抗病株系响应蔷薇盘二孢入侵的分子机制
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
4.1.2 转录文库的构建及测序
4.1.3 Raw Data质量评估
4.1.4 序列拼接和注释
4.1.5 基因表达水平分析
4.1.6 荧光定量PCR对测序结果准确性验证
4.1.7 差异基因的聚类及功能富集分析
4.2 结果与分析
4.2.1 转录组测序数据质量评估
4.2.2 各样本基因表达水平分析
4.2.3 月季对蔷薇盘二孢入侵过程的响应分析
4.2.4 转录组数据准确性验证
4.3 讨论
4.3.1 激素合成及信号转导在不同抗性株系响应蔷薇盘二孢入侵中的作用
4.3.2 细胞壁相关合成代谢在易感株系R12-26中对蔷薇盘二孢入侵的调节
4.4 小结
5 外源激素处理对蔷薇盘二孢入侵月季的影响
5.1 材料与方法
5.1.1 植物材料
5.1.2 内源水杨酸、茉莉酸和生长素含量检测
5.1.3 生长素、水杨酸、茉莉酸及其合成抑制剂/运输抑制剂外施处理
5.1.4 蔷薇盘二孢孢子悬浮液制备及接种处理
5.1.5 不同外施处理对两株系内源激素含量变化及信号通路相关基因表达模式的影响
5.1.6 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 接种蔷薇盘二孢对月季内源水杨酸、茉莉酸、生长素含量的变化
5.2.2 外源生长素干扰对月季黑斑病病害程度的影响
5.2.3 外源生长素干扰对内源水杨酸、茉莉酸、生长素水平的影响
5.2.4 外源生长素干扰对月季水杨酸和茉莉酸防御系统的影响
5.2.5 外源茉莉酸干扰对月季黑斑病病害程度的影响
5.2.6 外源茉莉酸干扰对月季内源水杨酸、茉莉酸、生长素积累和信号传递的影响
5.2.7 外源水杨酸干扰对月季响应月季黑斑病的影响
5.3 讨论
5.4 小结
6 月季黑斑病防御过程中参与激素诱导相关基因的功能验证
6.1 材料与方法
6.1.1 试验材料
6.1.2 激素相关候选基因信息
6.1.3 酶和试剂
6.1.4 病毒载体及菌株
6.1.5 目的基因片段的筛选与扩增
6.1.6 重组载体构建与菌液准备
6.1.7 月季离体叶盘的基因沉默
6.1.8 月季离体叶盘的人工接种
6.1.9 病毒检测和目的基因沉默效率检测
6.1.10 激素含量检测
6.1.11 病情指数统计
6.1.12 数据分析
6.2 结果与分析
6.2.1 离体叶盘VIGS体系可成功于月季黑斑病基因功能验证
6.2.2 激素相关候选基因离体叶盘沉默效率统计
6.2.3 生长相关激素生长素相关基因的沉默对黑斑病发病情况的影响
6.2.4 防御激素茉莉酸与水杨酸相关基因的沉默对黑斑病发病情况的影响
6.3 讨论
6.4 小结
7 细胞壁诱导防御在月季防御黑斑病过程中的作用
7.1 材料与方法
7.1.1 试验材料
7.1.2 激素相关候选基因信息
7.1.3 酶和试剂
7.1.4 病毒载体及菌株
7.1.5 目的片段的筛选与扩增
7.1.6 重组载体构建与菌液准备
7.1.7 月季离体叶盘的基因沉默
7.1.8 月季离体叶盘的人工接种
7.1.9 病毒检测和目的基因沉默效率检测
7.1.10 病毒检测和目的基因沉默效率检测
7.1.11 病情指数统计
7.1.12 数据分析
7.2 结果与分析
7.2.1 细胞壁相关候选基因离体叶盘的沉默效率统计
7.2.2 RcPLY18的沉默对黑斑病发病情况的影响
7.2.3 RcBXL1的沉默对黑斑病发病情况的影响
7.2.4 RcXYNC的沉默对黑斑病发病情况的影响
7.2.5 RcEXP15的沉默对黑斑病发病情况的影响
7.2.6 水杨酸、茉莉酸对细胞壁相关基因表达模式的影响
7.3 讨论
7.4 小结
8 结论与展望
8.1 主要结论
8.2 主要创新点
8.3 后续研究工作展望
参考文献
附录 A strain BFU-XTS-1 ITS序列信息
附录 B 转录组数据验证用引物信息
附录 C 转录组数据质控分析表
附录 D 转录组结果数据中各样本FPKM信息
附录 E 内源激素检测标准曲线
附录 F 激素相关基因定量因无信息
附录 G 候选基因VIGS目的片段克隆引物
附录 H 候选目的基因VIGS定量引物
个人简介
导师简介
获得成果目录清单
致谢