论文题目：小檗碱在心脏外科术后早期预防新发房颤的作用及机制研究
摘要：目的:本研究通过网络药理学方法预测小檗碱防治房颤的作用靶点、生物过程及信号通路、通过小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性临床研究,以及通过动物实验、组织样本转录组测序与分析,观察小檗碱通过TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK信号通路在兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型中抑制纤维化,减轻心房重构,预防房颤的心脏保护作用,进一步明确炎症导致心房纤维化在房颤发生和维持中的作用机制,为探明小檗碱对房颤的防治作用及机制、进而为预防心外科术后早期新发房颤的临床应用提供新的见解和理论支持。材料与方法:1.通过Gene Cards、Swiss Target Prediction、TCMSP数据库检索小檗碱作用靶点。通过Dis Ge NET、OMIMD、TTD数据库筛选房颤相关疾病靶点。将共同作用靶点输入STRING平台构建蛋白-蛋白（PPI）互作网络模型,进而使用DAVID平台及Cytoscape软件对相应靶点进行GO分析和KEGG信号通路富集分析,分析小檗碱治疗心房颤动的作用靶点及通路。2.我们随机分配200例窦性心律患者,安排他们进行择期单纯非体外循环冠状动脉旁路移植手术,并接受围手术期小檗碱（每天1.2克的剂量）或安慰剂,术后持续7天动态心电图监测。主要的结果是术后7天内发生的持续大于30秒的房颤发生率。次要结果包括术后7天内发生的持续大于30秒的房颤的起始时间、房颤时最大心室率、房颤期间平均心室率、房颤负荷,血液生物标志物及心率变异性（HRV）相关指标。采用SPSS23.0统计学软件进行分析。计数资料采用频数和百分比进行统计描述;计量资料若符合正态分布的用均数±标准差表示,非正态分布的用中位数（P25,P75）或最大值、最小值进行统计描述。对于主要结局指标的统计分析,当记录为时依性结局事件时则采用Kaplan-Meier曲线来描述其发生率,采用Log-rank检验比较其在两组间的差异,对于两组间发生率的比较采用χ~2检验。两组组间基线资料的均衡性分析和次要结局指标以及安全性指标的组间比较,采用非参数Wilcoxon秩和检验。对于分类资料,采用卡方检验。统计检验均为双尾,检验水准α=0.05,即P＜0.05时,差异具有统计学意义。3.体重2.8-3.2kg的雄性普通级新西兰大耳白兔30只。随机分为5组:（1）左心房快速起搏组（RAP组,n=6）;（2）左心房快速起搏+小檗碱组（RAP+BBR,n=6）;（3）假手术组（SHAM,n=6）;（4）假手术+小檗碱组（SHAM+BBR,n=6）;（5）空白对照组（Control,n=6）。适应性、分笼饲养1周,不限食水。RAP+BBR组及SHAM+BBR组兔手术前给予每日1次小檗碱100mg/（kg·d）灌胃,持续1周。其余组给予等量生理盐水灌胃,每日1次,持续1周。动物处理符合《护理和使用实验动物指南》（美国国家卫生研究院2011年出版,第8版）。之后给予造模,左侧开胸,制作皮袋放入植入子,四根电极导线经皮下隧道延伸,两个心电采集电极分别缝合留置于左上肢和右上肢腋下皮下用于观察心电图,两个刺激电极分别缝合于左心耳和左心房上。术后给予青霉素钠40万单位/日,连续3日,肌肉注射,预防感染。3日后开启动物遥测刺激系统,通过无线收发采集和刺激信号;实现利用Power Lab生理记录仪连续监测体表I导联心电信号,并通过专用计算机程序刺激软件,发放间歇（刺激2 s,暂停2 s）高频（频率20 Hz）阈上（强度2 m A,脉宽1 ms）刺激,刺激2周。RAP+BBR组及SHAM+BBR组兔手术后继续给予小檗碱灌胃（剂量,方式同术前）,持续2周。其余组予以生理盐水灌胃（同术前）。整个实验过程中所有兔均处于清醒及自由活动状态,饮食、睡眠等生活习惯均未改变。各组兔均在术后2周处死,摘取整个左心房组织,用冰生理盐水进行清洗,摘除血栓、纤维素等多余的组织。部分心房组织应用4%的多聚甲醛浸泡固定,后期脱水包埋蜡块。部分心房组织经液氮速冻后置于-80℃的冰箱中保存备用。委托北京博奥晶典生物技术有限公司以高通量测序技术（全转录组测序）为主要手段,应用RNA-seq技术对不同条件下兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型组织样本的m RNA进行转录组测序,并对测序结果进行差异基因表达、基因功能与信号通路富集分析,为小檗碱对房颤预防和治疗的可能作用机制提供实验依据。心房石蜡切片行免疫组化、Masson染色、H-E染色检测。心房组织行Western Blot检测,包括p-p65、p65、IKBα、TLR4、PPAR-α、p-AMPK、AMPK、α-SMA蛋白表达。采用SPSS 23.0统计软件,各组数据均用（?）±s表示,组间的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.网络药理学预测小檗碱防治房颤的作用靶点及通路基于网络药理学方法,我们共筛选得到小檗碱与房颤共同作用靶点50个,IL-6、TNF、VEGFA、NOS3、MMP9、STAT3等核心靶点较为重要。在DAVID数据库中对筛选出的50个小檗碱-房颤共同作用靶点进行GO功能富集分析得到GO条目1644个（P＜0.05）,其中生物过程（BP）条目1544个,细胞组成（CC）条目31个,分子功能（MF）条目69个。进行KEGG通路富集分析,筛选得到128条信号通路（P＜0.05）,其中与房颤直接相关的有30个。可见多个生物学功能与房颤的发生发展关系密切,主要涉及小檗碱可能通过炎症反应、氧化应激、心房纤维化、血管生成等生物过程进行调节,通过调控TNF、PI3K-Akt、MAPK、IL-17、HIF-1、VEGF、TLR、TGF-β等信号通路来发挥治疗房颤的作用。2.小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性临床研究2.1基线特征在本研究最终分析纳入200例患者中,所有患者均按要求完成该试验。两组患者的人口统计资料和术前变量汇总,差异无显著性统计学意义。两组患者术前心率变异性指标差异无显著性统计学意义。2.2主要结果OPCAB术后小檗碱组房颤的发生率为20%（20例）,安慰剂组的房颤发生率为35%（35例）,对照组（P=0.018）。在OPCAB术后,小檗碱组患者7天内发生POAF的风险为安慰剂组患者7天内发生POAF的0.5倍;95%的置信区间:0.29-0.87;P=0.0143。与安慰剂组相比,小檗碱组患者心脏手术后房颤发生率明显减低,可至少减低POAF 13%的发病风险。2.3次要结果和POAF相关测量两组术后房颤最长持续时间,房颤时最大心室率,房颤期间平均心室率等指标均有统计学意义（P＜0.05）,小檗碱组均低于安慰剂组。两组房颤患者胺碘酮使用量差异有显著性统计学意义（P=0.013）,小檗碱组用量小于安慰剂组。所有使用胺碘酮的患者都恢复了窦性心律。血液生物标志物测量。选取术后约48小时及第七天2个时间点检测,术前hs CRP,IL-6,NLR,BNP,Hs-Tn T水平小檗碱组与安慰剂组均无明显差异（P＞0.05）,术后48小时及第7天小檗碱组的hs CRP、IL-6水平,术后48小时小檗碱组的TNF-α、NLR、BNP血清浓度显著低于对照组,差异有显著性统计学意义（P＜0.05）.术后48小时小檗碱组的SOD血清浓度显著高于安慰剂组,差异有显著性统计学意义（P＜0.05）.术后48小时小檗碱组的Hs-Tn T,术后7天小檗碱组的NLR与对照组差异无显著性统计学意义（P＞0.05）。术后一般情况。两组在呼吸机辅助时间、ICU停留时间、输血量及术后LVEF值上接近,无显著性统计学意义（P＞0.05）。心率变异性（HRV）。两组术后HRV各项指标比较,小檗碱组SDNN,SDANN,RMSSD,TP,LF,HF,VLF各指标平均水平均显著高于安慰剂组SDNN,SDANN,RMSSD,TP,LF,VLF的平均水平（P＜0.05）,然而两组间LF/HF的差异无显著性统计学意义（P＞0.05）,两组间PNN50的差异可能有显著性统计学意义,P=0.067。两组△SDNN,△SDANN,△RMSSD,△HF差异有显著性,有统计学意义（P＜0.05）,即两组术后HRV各项指标数值均较术前降低。安慰剂组较小檗碱组降低更为明显。采用重复测量计算HRV各指标,两组SDNN,SDANN术后24-48小时内有显著性差异（P＜0.05）,且小檗碱组高于对照组。两组VLF,LF,HF术后第七天有显著性差异（P＜0.05）,小檗碱组高于对照组.两组RMSSD,PNN50水平相似,无显著性差异（P＞0.05）。2.4不良反应及并发症安全性方面,小檗碱组6例发生短暂的、轻微的不良反应（胃肠道反应,便秘）,不影响生活和治疗,血、尿常规及肝功能均无异常改变。两组在IABP使用率,二次开胸、围手术期心梗、脑血管意外发生率方面,两组之间没有显著差异（P＞0.05）.两组在房颤以外心率失常发生率方面差异有统计学意义（P=0.047）,小檗碱组明显低于安慰剂组。3.小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房重构的影响及机制研究3.1小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房结构重构的影响应用免疫组化法,蛋白印迹（Western Blot）法检测各组兔左心房组织α-SMA蛋白表达,应用Masson染色,H-E染色法比较各组兔心房组织纤维化程度变化。可见心房肌细胞中不同程度的棕色或黄色斑点,表示各组α-SMA免疫组化阳性。RAP组阳性表达最明显,胞浆呈棕黄色,RAP+BBR组相对于RAP组胞浆染色明显减轻。SHAM与SHAM+BBR的作用相当,均低于RAP+BBR组。Control组仅可见极少量阳性染色。Western Blot检测提示RAP+BBR组兔心房组织α-SMA蛋白表达明显低于RAP组（P＜0.05）。各组心房组织Masson染色结果显示胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。RAP组心肌纤维化面积增多。RAP+BBR组心肌间质纤维化较RAP组明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组纤维化程度相当。Control组心肌纤维排列整齐,细胞核大小正常。胶原容积分数（CVF）定量分析显示与Control组相比,其于各组心肌间质纤维化明显增加（P＜0.001）,ARP+BBR组胶原纤维数量较RAP组明显减少（P＜0.001）,两组均高于SHAM组与SHAM+BBR组（P＜0.001）,SHAM与SHAM+BBR两组胶原纤维数量相当（P＞0.05）。小檗碱对各组兔左房质量/体重比值（LAM/BM）的影响。RAP组兔LAM/BM显著高于其他各组（P＜0.001）,RAP+BBR组家兔的LAM/BM明显低于RAP组（P＜0.001）。SHAM与SHAM+BBR两组情况无显著性差异（P＞0.05）,与Control组比较差异有显著性（P＜0.001）HE染色可见Control组心肌纤维排列整齐致密,细胞核清晰,ECM减少,而RAP组心肌纤维萎缩、排列紊乱,并有大量炎症细胞浸润。与RAP组比较,RAP+BBR组上述病理改变明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组病理改变程度相当,介于RAP+BBR组与Control组之间。3.2兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型组织样本转录组测序与分析通过对RAP组和RAP+BBR组进行比较的基因功能富集分析,发现小碱可以干扰功能和通路的变化,例如炎症,代谢,细胞生长和发育等。在信号通路分析中,发现176条有差异的信号通路,选取其中富集结果校正P值最小的相关信号通路,主要包括PPAR、AMPK、Cancer、PI3K-Akt、Fatty acid metabolism、NF-κB、m TOR、TNF、JAK-STAT等多条信号通路。尤其对PPAR信号通路、AMPK信号通路的调节非常活跃。既为阐明小檗碱作用机制提供新的研究切入点,又同时为寻找房颤的治疗新靶点提供参考。3.3小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型炎症信号通路TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK的影响免疫组化可见心房肌细胞中不同程度的棕黄色或黑色斑点,表示p-65,p-AMPK免疫组化阳性。RAP组中p-65阳性表达明显,表达细胞数明显增多,核黑色胞浆呈棕黄色,p-AMPK表达阳性,细胞数明显增多,核蓝色,胞浆呈棕黄色。RAP+BBR组相对于RAP组均表达阳性,核和胞浆阳性染色显著减轻。SHAM与SHAM+BBR的作用相当,均低于RAP+BBR组。对照组仅可见极少量阳性染色。Western Blot检测提示RAP+BBR组兔心房组织p-p65,TLR4蛋白表达明显低于RAP组（P＜0.05）,IKBα蛋白表达明显高于RAP组（P＜0.05）。RAP+BBR组兔心房组织PPAR-α、p-AMPK蛋白表达明显高于RAP组（P＜0.05）。结论:1.基于网络药理学的方法预测出小檗碱的功效物质基础和对房颤的分子作用机制,挖掘了许多潜在的治疗靶标,充分体现出小檗碱的多靶点-多通路的作用特点,系统揭示了小檗碱防治房颤的药理作用机制,为临床应用提供了一个全新的、深入的参考,也为中医药精准治疗靶点的现代化研究提供了科学依据。2.围手术期应用小檗碱,与安慰剂组相比,患者心脏手术后POAF的发生率明显减低,可至少减低13%的发病风险。同时明显改善了房颤最长持续时间,房颤时最大心室率,房颤期间平均心室率指标,明显减少了POAF患者胺碘酮的使用量,明显降低了炎症细胞因子及氧化应激反应对心肌的损伤。在减轻HRV下降的程度,改善心脏自主神经功能方面具有一定的疗效,且安全性髙。3.小檗碱通过TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK信号通路有效地抑制炎性递质的产生及释放,减轻炎症反应,减轻心肌纤维化、减轻心肌细胞肥大作用,改善兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房结构重构,进而产生预防房颤的作用。
关键词：小檗碱;心房颤动;网络药理学;冠状动脉旁路移植;快速心房起搏;TLR4;NF-κB;PPAR-α
学科专业：中西医结合临床（专业学位）
中文摘要
英文摘要
英文缩略词表
前言
论文一 基于网络药理学预测小檗碱治疗房颤的作用靶点及通路
(前言)
资料与方法
结果
讨论
小结
论文二 小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性研究
(前言)
资料与方法
试验结果
讨论
小结
论文三 小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房重构的影响及机制研究
(前言)
材料与方法
实验结果
讨论
小结
结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述 小檗碱在心血管方面的应用
参考文献
个人简介
致谢