论文题目：加味人参乌梅汤调控腹泻大鼠肠道菌群结构和功能的宏基因组学研究
摘要：目的:基于宏基因组学技术研究加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群结构和功能的影响,进一步揭示加味人参乌梅汤益气生津止泻的效应机制。方法:选取48只4周龄SD大鼠适应性喂养2d,随机抽取12只作为空白组,予生理盐水灌胃。余36只进行造模,参考文献采用苦寒泻下、劳倦力竭、饥饱失常的复合因素造模,予30%番泻叶灌胃,1h后置于水箱中负重游泳至力竭,捞出烘干,日1次,持续14d。参考文献评价造模成功后随机分为模型组、西药组和中药组,每组12只。模型组予生理盐水灌胃,西药组予枯草杆菌二联活菌颗粒灌胃,中药组予加味人参乌梅汤灌胃,1次/d,期间观察给药过程中各组大鼠一般情况。干预7d后麻醉处死大鼠,取材送检。⑴取结肠组织固定于4%多聚甲醛,H＆E染色,光镜下观察结肠病理形态。⑵酶联免疫吸附试验法检测电解质(Na+、K+、CL-、Ca2+)、D-Lactate、DAO的血清浓度。⑶蛋白质印迹法检测结肠Occludin、Claudin-1、ZO-1的表达水平。⑷结肠内容物宏基因组测序:按样品DNA提取、建库测序、数据质控、物种注释与差异物种分析、基因集构建与差异基因分析、功能注释分析等流程。⑸血清非靶向代谢组学分析:按代谢物提取、鉴定流程进行主成分、偏最小二乘法等分析差异代谢物和差异代谢通路信息。⑹差异代谢物验证:酶联免疫吸附试验法检测LTB4、Calcitriol、Taurine、Cortisone血清水平。结果:⑴效应指标:（1）腹泻情况:造模2周时大鼠腹泻症状明显,稀便率（90.02±3.59）%,腹泻指数（2.03±0.21）,药物干预1周后中、西药组的大鼠稀便率和腹泻指数较造模2周及模型组均显著下降（P＜0.01）。（2）结肠病理形态:模型组、西药组黏膜固有层水肿、细胞排列稀疏,透光度增强,肠腺萎缩和间质炎性细胞增多;中药组仅表现黏膜轻微水肿、炎性细胞轻微增多。（3）血清电解质:模型组Na+、K+、CL-、Ga2+水平较空白组明显下降（P＜0.05）,中药组Na+、K+、Ga2+水平较模型组明显升高（P＜0.05）,而西药组无明显改善（P＞0.05）,且中药组改善Ga2+水平优于西药组（P＜0.05）。（4）结肠损伤指标:模型组D-Lactate、DAO水平较空白组显著上升（P＜0.01）,中、西药均能显著降低DAO水平（P＜0.01）,而中药改善D-Lactate水平优于西药治疗。（5）结肠黏膜紧密连接蛋白:模型组Occludin、Claudin-1、ZO-1表达水平较空白组显著下调（P＜0.01）,中、西药均能显著上调Claudin-1、ZO-1表达水平（P＜0.01）,而中药上调Occludin、ZO-1表达水平优于西药治疗（P＜0.05）。⑵宏基因组学:（1）菌群物种OTU相对丰度:模型组菌群物种OTU数量明显下降（P＜0.05）;中、西药组菌群物种OTU数量较模型组显著升高（P＜0.01）。（2）菌群物种相对丰度及差异:门水平上,模型组厚壁菌门增加,拟杆菌门、疣微菌门显著减少;中、西药组拟杆菌门显著增加,厚壁菌门显著下降,中药组疣微菌门较前增加。纲水平上,模型组梭菌纲、杆菌纲增加,拟杆菌纲减少;中、西药组杆菌纲明显减少,拟杆菌纲显著增加。属水平上,模型组中拟杆菌属、普雷沃氏菌属减少,乳杆菌属相对丰度显著增加;中、西药组拟杆菌属显著增加,乳杆菌属相对丰度显著减少。（3）物种聚类分析:属、种水平上,中药组拟杆菌门、拟杆菌属、厚壁菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属显著高于模型组和西药组。（4）菌群功能丰度及差异:KO聚类分析:中、西药组在碳水化合物、氨基酸、能量代谢及多糖的生物合成和代谢、消化系统功能注释显著高于模型组,中药组在能量、碳水化合物、氨基酸代谢以及膜转运聚类分析度高于西药组。egg NOG功能注释:中药组在次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢、能量产生和转换、转录、氨基酸运输和代谢、信号转导机制和核苷酸运输和代谢显著高于西药组。CAZy功能注释:中、西药组在CBMs、GTs、GHs和CEs显著高于模型组,而中药组CBMs、GTs明显高于西药组。⑶非靶向代谢组学:（1）差异代谢物:与模型组比较,磷酸、Taurine、LTB4、Calcitriol是中、西药组主要差异代谢物,其中Cortisone是西药组与模型组间的主要差异代谢物。（2）差异代谢通路信息:与模型组比较,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,丙酸、果糖、甘露糖、氨基酸的代谢为中、西药组主要差异代谢通路信息,其中PPARs为西药组差异代谢通路,c AMP/PKA为中药组的差异代谢通路。（3）差异代谢物验证:模型组Calcitriol、Taurine、Cortisone血清水平显著低于空白组（P＜0.01）,中、西药均能著提高LTB4、Calcitrio、Taurinel血清水平（P＜0.01）,中药在改善LTB4、Calcitrio代谢水平明显优于西药治疗（P＜0.05）,而西药可有效改善Cortisone代谢水平（P＜0.01）。结论:1.加味人参乌梅汤对腹泻模型大鼠具有显著的益气生津止泻效应。2.加味人参乌梅汤可有效调控腹泻模型大鼠肠道菌群门、纲、属水平上的拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门、杆菌纲、拟杆菌纲、乳杆菌属、拟杆菌属的相对丰度和属、种水平上的功能菌群拟杆菌门、拟杆菌属、厚壁菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属物种间的聚类,并通过功能菌群对宿主能量、碳水化合物、氨基酸等营养物质代谢和转运的调控而发挥益气生津止泻效应。3.加味人参乌梅汤对腹泻模型大鼠血清差异代谢物磷酸、甲基丙二酸、D-甘露糖6-磷酸、LTB4、Calcitriol、Taurine、二十碳五烯酸具有良性调控作用,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解,丙酸、果糖、甘露糖、氨基酸的代谢是其主要的差异代谢通路信息,而PPARs、c AMP/PKA是关键差异代谢通路信息。4.SCFAs可能是加味人参乌梅汤调控肠道菌群和宿主代谢交互共变效应的主要产物,其功能的发挥有可能是加味人参乌梅汤多靶点、多层次、多途径发挥益气生津止泻效应的主要环节。
关键词：加味人参乌梅汤;肠道菌群;代谢组学;宏基因组学
学科专业：中医儿科学
中文摘要
ABSTRACT
中英文对照缩略词表
引言
第一部分 文献研究
1 小儿泄泻的中西医认识及研究进展
1.1 中医对小儿泄泻病的认识及研究进展
1.2 西医对儿童腹泻病的认识及研究进展
2 人参乌梅汤的研究概述
3 中药复方干预腹泻的宏基因组学和代谢组学研究
3.1 宏基因组学
3.2 代谢组学研究
第二部分 实验研究
实验一 加味人参乌梅汤益气生津止泻效应研究
1 材料与仪器
1.1 实验动物
1.2 实验药物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
2 实验方法
2.1 实验分组
2.2 药物制备
2.3 模型制备
2.4 药物干预
2.5 样品采集
2.6 检测指标
2.7 统计学方法
3 结果
3.1 一般情况观察
3.2 腹泻情况
3.3 结肠病理形态学表现
3.4 各组大鼠血清电解质结果
3.5 各组肠道损伤标志物D-Lactate和 DAO水平
3.6 各组大鼠结肠Occludin、Claudin-1、ZO-1表达水平
4 小结
4.1 一般情况
4.2 结肠组织形态
4.3 电解质稳态
4.4 肠道损伤标志物
4.5 肠黏膜紧密连接蛋白
5 结论
实验二 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群结构和功能的影响
1 材料与仪器
1.1 实验动物
1.2 实验药物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
2 实验方法
2.1 实验分组
2.2 实验药物及制作方法
2.3 模型制备和药物干预
2.4 实验取材
2.5 肠内容物DNA提取和宏基因组测序
2.6 统计学方法
3 结果
3.1 操作分类单元(OTU)分析
3.2 大鼠粪便微生物相对丰度及注释
3.3 大鼠粪便微生物功能相对丰度及差异分析
4 小结
4.1 基于OTU肠道菌群物种相对丰度分析
4.2 肠道菌群物种相对丰度及丰度聚类分析
4.3 功能注释丰度分布及差异分析
5 结论
实验三 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠血清代谢表型影响的研究
1 材料与仪器
1.1 实验动物
1.2 实验药物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
2 实验方法
2.1 实验分组
2.2 实验药物及制作方法
2.3 模型制备和药物干预
2.4 实验取材
2.5 统计学方法
2.6 非靶向代谢组学分析
3 结果
3.1 大鼠血清代谢物差异分析
3.2 模型组血清代谢组学结果
3.3 西药组血清代谢组学结果
3.4 中药组血清代谢组学结果
3.5 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠血清代谢组学影响
3.6 肠道菌群宏基因组学与代谢物关联分析
4 小结
4.1 各组差异代谢物及代谢通路信息分析
4.2 关键差异代谢物验证分析
5 结论
第三部分 讨论
1 加味人参乌梅汤的立法组方依据
1.1 组方理论基础
1.2 现代机制研究
2 动物实验模型的构建及评价
2.1 模型动物的选择
2.2 造模方法的选择及制备
2.3 实验模型的评价
2.4 阳性药物的选择
3 加味人参乌梅汤的效应评价
4 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群结构和功能的影响
4.1 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群物种相对丰度及差异分析
4.2 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群功能相对丰度及差异分析
5 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠血清代谢表型的影响
6 加味人参乌梅汤对腹泻大鼠肠道菌群-宿主代谢交互共变效应的分析
第四部分 结论
创新性
问题与展望
致谢
参考文献
附件
附件1:综述 基于菌群平衡探索儿童腹泻发病机制和治疗进展
参考文献