论文题目：寒性成分龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ网络预测及免疫效应评价研究
摘要：中药四性理论是中药药性理论的核心,是指导中药临床用药的重要依据。中药四性的物质基础源于其物质偏性,中药的物质偏性源于不同的药材基源以及不同的炮制方法,中药中所含有的化学成分就是中药寒热药性的物质基础,特定中药常富含特定成分。以中药樟脑和冰片为例,均是由单一成分构成,且二者结构骨架相同,仅有一价键不同,但樟脑性热而冰片性寒。也就是说,单一成分也可体现寒热药性,存在物质偏性。那么寒、热性中药中含量最多的成分,是否能对中药性质起到比较重要的影响呢?基于这个假想,以寒性中药龙胆和胡黄连主要活性物质龙胆苦苷（GPS）和胡黄连苷Ⅱ（PIC）为研究对象,将网络药理学引入中药寒热药性理论研究中,探索中药单体成分是否具有寒热性质及寒性性质作用表现靶点和生物途径;使用分子对接以及RT-PCR技术对筛选出的关键靶点进行验证;再引入免疫分析法研究寒热药性理论,探究其物质基础,获取单克隆抗体,为后续进一步研究寒热药性或为构建寒热评价标准奠定基础,多方式整合阐释中药寒热药性的科学内涵。具体研究成果如下:1.龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ寒性验证及作用机制:TCMSP数据库、PubChem数据库和PharmMapper平台收集GPS和PIC潜在靶点,OMIM数据库、DrugBank数据库和GeneCards中筛选汇总表里俱热证潜在靶点;韦恩分析获得成分—疾病交集靶点,构建蛋白互作网络,再通过MCC方法计算获得关键靶点;将交集靶点导入DAVID数据库进行GO、KEGG富集分析。结果显示:预测GPS和PIC治疗表里俱热证的作用靶点均为18个,GPS主要影响的生物过程为细胞凋亡,主要代谢通路为凋亡通路、p53信号通路、鞘脂信号通路、NOD样受体信号通路等;PIC主要生物过程为信号转导和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控,主要代谢通路为催乳素信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路等。2.龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ关键靶点验证:使用Discovery Studio 2016软件的LibDock模式将GPS和PIC与各自的潜在靶点分别进行分子对接记录对接分数,计算结合能;以LPS（3 mg/kg）滴鼻诱导构建表里俱热证模型,GPS高、低剂量组（200 mg/kg、100 mg/kg）,PIC高、低剂量组（30mg/kg、15 mg/kg）连续给药5天,末次给药2 h进行造模,24 h后取肺组织进行RT-PCR验证上述结果中关键因子的mRNA表达水平。结果显示:GPS与筛选靶点中CASP8、CDK2、CYCS等8个靶点均对接成功,与CYCS结合能力最佳;PIC与筛选靶点中HRAS、MAPK1、MAPK3等6个靶点均对接成功,与STK11结合能力最佳;成功构建表里俱热证模型,RT-PCR结果显示GPS可下调 MAPK1、MAPK3、HRAS、HSP90AA1 mRNA 的表达,上调 CYCS mRNA 的表达;PIC 可下调 MAPK1、MAPK3、HRAS、HSP90AA1、STK11 mRNA 的表达,表明GPS和PIC可能通过调节这些基因的表达作用于多种通路显示寒性性质。3.合成龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ人工抗原:高碘酸钠氧化法合成GPS-BSA和PIC-BSA人工抗原,透析后进行蛋白含量测定,紫外全波长扫描法和SDS-PAGE电泳鉴定人工抗原是否偶联成功。结果显示:两种人工抗原均偶联成功,GPS-BSA、PIC-BSA的浓度分别为 3.12 mg/mL、2.80mg/mL;经鉴定,GPS-BSA偶联比约为 13:1,PIC-BSA 偶联比约为15:1。4.制备抗龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ多抗并筛选单克隆细胞株:人工抗原混合佐剂免疫小鼠,获得免疫小鼠血清对包被液、封闭液、包被浓度检测条件筛选,使用最佳条件对小鼠血清效价进行检测。选择效价最高小鼠采用电融合方法进行细胞融合,筛选分泌相应抗体的单克隆细胞株。结果显示:GPS组小鼠除1号鼠,均可进行细胞融合,选择效价最高2号鼠（1:20 000）,融合率约为83.06%,筛选出可分泌抗GPS抗体的杂交瘤细胞株3G9,并采用诱生腹水法扩增单抗,检测3G9腹水效价在24 000以上。PIC组中4号鼠效价最高（接近1:16 000）,细胞融合率约为80.56%,未能筛选出抗PIC抗体杂交瘤细胞株。
关键词：中药寒热药性;网络药理学;RT-PCR;人工抗原;单克隆抗体
学科专业：中药学
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 引言
1.2 中药寒热药性研究方法
1.2.1 物象研究
1.2.2 物质基础研究
1.2.3 生物信息学
1.2.4 数据挖掘
1.2.5 网络药理学
1.3 中药小分子单抗和多抗的应用
1.3.1 皂苷类
1.3.2 黄酮类
1.3.3 萜类
1.3.4 生物碱类
1.3.5 醌类
1.3.6 其他
1.4 立题依据及研究意义
2 基于网络药理学探究龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ寒性作用机制
2.1 引言
2.2 实验材料
2.3 实验方法
2.3.1 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ的靶点预测
2.3.2 热证靶点的收集
2.3.3 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ与热证交集靶点并绘制Venny图
2.3.4 蛋白-蛋白互作网络构建
2.3.5 生物功能和通路富集分析
2.4 结果
2.4.1 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ的潜在靶点
2.4.2 热证急性上呼吸道感染潜在靶点
2.4.3 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ与热证交集靶点及其Venny图
2.4.4 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ治疗热证潜在靶点的PPI网络分析
2.4.5 潜在靶点GO分析
2.4.6 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ治疗热证潜在靶点KEGG分析
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ关键靶点验证
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验动物
3.2.2 实验软件
3.2.3 实验试剂
3.2.4 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 潜在核心靶点分子对接验证
3.3.2 动物分组、给药及造模
3.3.3 血涂片中性粒细胞计数
3.3.4 ELISA检测肺组织相关细胞因子含量
3.3.5 RT-PCR检测肺组织中关键靶点的mRNA表达水平
3.4 实验结果
3.4.1 分子对接结果
3.4.2 各组小鼠体征变化
3.4.3 血涂片中性粒细胞百分比
3.4.4 小鼠肺组织内相关因子含量
3.4.5 小鼠肺组织中关键靶点的mRNA表达水平
3.5 讨论
3.6 本章小结
4 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ人工抗原的合成
4.1 引言
4.2 实验试剂
4.3 实验仪器
4.4 主要溶剂配制
4.5 实验方法
4.5.1 偶联物的制备
4.5.2 Bradford法蛋白浓度的测定
4.5.3 人工抗原的紫外扫描法鉴定
4.5.4 人工抗原的SDS-PAGE电泳鉴定
4.6 实验结果
4.6.1 Bradford法蛋白浓度的测定
4.6.2 人工抗原的紫外扫描法鉴定
4.6.3 人工抗原的SDS-PAGE电泳鉴定
4.7 讨论
4.7.1 偶联物的制备
4.7.2 人工抗原的鉴定
4.8 本章小结
5 龙胆苦苷和胡黄连苷Ⅱ单克隆抗体的制备
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 细胞株
5.2.2 实验动物
5.2.3 实验试剂
5.2.4 实验仪器
5.2.5 主要溶剂配制
5.3 实验方法
5.3.1 动物免疫
5.3.2 包被液的选择
5.3.3 封闭液的选择
5.3.4 包被原工作浓度
5.3.5 检测血清效价
5.3.6 免疫血清效价动态监测
5.3.7 细胞融合
5.3.8 杂交瘤细胞筛选
5.3.9 抗体的扩大生产
5.4 实验结果
5.4.1 包被液的选择
5.4.2 封闭液的选择
5.4.3 包被原工作浓度
5.4.4 血清效价
5.4.5 血清效价动态监测
5.4.6 细胞融合结果
5.4.7 阳性孔筛选及单克隆化结果
5.4.8 腹水效价
5.5 讨论
5.5.1 动物免疫及效价检测
5.5.2 细胞融合单抗杂交瘤筛选
5.5.3 单抗杂交瘤筛选及扩增
5.6 本章小结
6 讨论
结论
参考文献
缩略词
致谢