论文题目：养殖半滑舌鳎无眼侧黑化机制的初步研究
摘要：本研究以我国鲆鲽类主导养殖品种—半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）为研究对象,针对养殖鱼无眼侧黑化的表观现象,运用显微观察技术,研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞及鳞片的形态特征,探明了其数量分布与体色的关系;利用分子克隆技术克隆了黑化相关功能基因POMC,p MCH,MCHR,分析了其基因结构和多态特性,探究了它们在各个组织中的表达情况;采用实时荧光定量PCR方法研究了POMC,p MCH,MCHR在不同黑化程度实验鱼的脑垂体和皮肤中的表达变化规律,分析了体色相关基因表达调控与无眼侧黑化程度的关系。研究结果可为半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞与分子机制研究提供基础资料。主要研究结果如下:1.半滑舌鳎体表色素细胞形态、鳞片特征与黑化的关系半滑舌鳎色素细胞类型主要有3种:黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。黑色素细胞较大,细胞直径10-60μm,细胞形状不规则,大体分为两种类型:一种树突状分枝不明显;另一种延伸成放射状。黄色素细胞较小,圆形或椭圆形,细胞直径1-5μm,视野下呈黄色。虹彩细胞较大,细胞直径10-70μm,分布较均匀,形状不规则,呈卵圆形、棒状或多边形等。半滑舌鳎无眼侧正常皮肤中未发现黑色素细胞分布,而无眼侧黑化皮肤黑色素细胞和虹彩细胞的分布数量显著低于有眼侧正常皮肤（P＜0.05）。无眼侧正常皮肤中黄色素细胞和虹彩细胞数量与有眼侧正常皮肤和无眼侧黑化皮肤相比也较少。半滑舌鳎色素细胞主要在皮肤上分布（约占70%）。在无眼侧黑化的皮肤上,以延伸成放射状的黑色素细胞分布为主（占60%以上）,而在有眼侧正常皮肤上,以树突状分枝不明显的黑色素细胞分布为主;在无眼侧黑化和有眼侧正常鳞片上,都是以的分枝不明显的黑色素细胞为主,且鳞片上的黑色素细胞分布相对稀疏。生活史中,半滑舌鳎无眼侧鳞片类型经历了栉鳞→弱栉鳞→圆鳞逐渐转变的过程,但无眼侧黑化区域的鳞片仍为栉鳞,在无眼侧黑化与正常皮肤交界处发现了弱栉鳞。无眼侧黑化鱼的体表两侧栉鳞的类型与形态特征相似,但有眼侧皮肤、无眼侧黑化皮肤和无眼侧正常皮肤的鳞片上硬棘数量不同,提示半滑舌鳎无眼侧黑化发生过程中鳞片形态及其调控机制也发生了明显变化。2.半滑舌鳎阿黑皮素原（POMC）的克隆和表达特性分析首次从半滑舌鳎垂体中获得了两种POMC亚型-POMC-a和POMC-b c DNA全长序列,全长分别为910bp和844bp,开放阅读框（ORF）分别为642bp和537bp,5’非编码区分别为113bp和87bp,3’非编码区分别为154bp和210bp。POMC-a和POMC-b分别编码213和178个氨基酸,除信号肽区域外,其序列均编码促肾上腺皮质激素（ACTH）,α-黑色素刺激素（α-MSH）,β-黑色素刺激素（β-MSH）,γ-促脂素（γ-LPH）,β-内啡肽,但缺失了γ-黑色素刺激素（γ-MSH）和大部分连接区域。POMC-a和POMC-b预测蛋白分子量分别为23.7KDa和19.5KDa,预测等电点分别为6.51和6.91。同源性分析显示,半滑舌鳎POMC-a的氨基酸序列与鲽形目、鲈形目的同源性为61.2%-66.5%,与黄鳍鲷的同源性最高;POMC-b的氨基酸序列与鲽形目、鲈形目的同源性达到51.8%-61.2%,与欧鳎的同源性最高。半滑舌鳎POMC-a和POMC-b具有不同的组织表达特性,其中POMC-a m RNA主要在垂体表达,在脑、肠、有眼侧皮肤和无眼侧黑化皮肤中也有少量表达;POMC-b m RNA主要在垂体中表达,在脑、脾脏、肝脏和头肾中有少量表达。无眼侧黑化皮肤中POMC-a和POMC-b m RNA表达水平均显著高于有眼侧皮肤和无眼侧正常皮肤。脑垂体和皮肤中POMC的表达与无眼侧黑化程度密切相关,其中脑垂体POMC-a m RNA表达在无眼侧50%黑化组达最高,皮肤POMC-a m RNA表达在10%黑化组最高,其后随黑化程度增加而显著降低。脑垂体POMC-b m RNA表达水平也在50%黑化组达峰值,皮肤POMC-b m RNA表达水平在10%黑化组最高,其后显著下降。3.半滑舌鳎黑色素富集激素（MCH）的克隆和表达特性首次从半滑舌鳎脑中获得了p MCH2 c DNA全长序列,全长626bp,ORF长为444bp,5’端非编码区长32bp,3’端非编码区长150bp,共编码147个氨基酸,预测蛋白分子量为16.2KDa,预测等电点为5.80。MCH2核心肽位于p MCH2序列379-441bp处,编码21个氨基酸。p MCH1 c DNA部分序列ORF长405bp,编码134个氨基酸。MCH1位于p MCH1序列352-402bp处,编码17个氨基酸,预测蛋白分子量为14.8KDa,预测等电点为6.22。同源性分析表明,半滑舌鳎MCH1、MCH2氨基酸序列都表现出与鲽形目鱼类最高的同源性（56%-66.9%）。半滑舌鳎p MCH m RNA主要在垂体中表达。此外,p MCH1在有眼侧皮肤、肠、性腺和脑中有少量表达,p MCH2在有眼侧皮肤、性腺、脑、无眼侧正常皮肤和鳃中有少量表达。皮肤中p MCH1和p MCH2 m RNA具有相反的表达趋势,无眼侧黑化皮肤中p MCH1 m RNA表达显著高于无眼侧正常皮肤,而p MCH2 m RNA表达则显著低。不同黑化程度表达中,MCH1 m RNA在脑垂体和皮肤中表现出类似的表达变化趋势,都在10%黑化组表达量达峰值,而后随着黑化程度的加大显著降低;MCH2在皮肤中则表现出随黑化程度加大而表达显著增强的趋势,表明MCH在脑垂体和皮肤层面参与了无眼侧黑化性状发生与发展的调控过程。4.半滑舌鳎黑色素富集激素受体（MCHR）的克隆和表达特性首次从半滑舌鳎脑中获得了MCHR1和MCHR2 c DNA全长序列,c DNA全长分别为1685bp和1626bp,ORF长分别为1080bp和1044bp,5’非编码区分别长262bp和213bp,3’非编码区分别为343bp和369bp。MCHR1和MCHR2分别编码359和347个氨基酸,都包括7个跨膜结构域。此外,在3’端末端都含有一个加尾信号AATAA。其预测蛋白分子量分别为23.7KDa和19.5KDa,预测等电点分别为6.51和6.91。半滑舌鳎MCHR的氨基酸序列与鲽形目鱼类的同源性最高（81.8-91.6%）。组织表达分析显示,半滑舌鳎MCHR1 m RNA主要在鳃中表达,在脾、性腺和有眼侧皮肤中有少量表达,MCHR2 m RNA主要在有眼侧皮肤中表达,在性腺中有少量表达。MCHR在无眼侧黑化皮肤中的表达量与无眼侧正常皮肤、有眼侧皮肤差异表达显著。时空表达分析显示,无眼侧黑化发生早期MCHR1 m RNA显著升高,在无眼侧50%黑化组达峰值,皮肤中MCHR1 m RNA在无眼侧10%黑化组显著升高,其后保持较高水平;脑垂体和皮肤中MCHR2 m RNA表达表现出一致的变化趋势,在无眼侧黑化发生早期MCHR2 m RNA都达到峰值其后逐渐下降至相对较低水平。表明MCHR可能直接或通过其它信号通路参与了半滑舌鳎无眼侧黑化性状的调控过程。
关键词：半滑舌鳎;无眼侧黑化;色素细胞;鳞片;分子机制
学科专业：水产养殖
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
1 体色相关色素细胞研究进展
2 鱼类POMC研究进展
2.1 POMC基因的结构
2.2 鱼类POMC的系统进化分析
2.3 POMC及下游多肽功能研究
3 鱼类MCHs的研究进展
3.1 鱼类MCHs基因的结构与表达特性
3.2 鱼类MCHs的功能
4 鱼类MCHR的研究进展
4.1 鱼类MCHRs基因的结构与表达
4.2 鱼类MCHR的功能
第二章 半滑舌鳎无眼侧黑化的形态学特征
1 材料与方法
1.1 实验材料及取样
1.2 色素细胞形态与数量分布特征分析
2 结果
2.1 半滑舌鳎无眼侧黑化类型
2.2 半滑舌鳎色素细胞的类型与分布特征
2.3 半滑舌鳎鳞片类型与数量分布特征
3 讨论
第三章 滑舌鳎POMC-a和POMC-b基因的克隆和表达特征
1 材料与方法
1.1 试验用鱼及样品处理
1.2 总RNA提取
1.3 cDNA第一链的合成
1.4 POMC保守片段的克隆
1.5 5’端和 3’端cDNA序列克隆
1.6 序列分析
1.7 Real-time PCR检测mRNA的相对表达量
2 结果
2.1 cDNA全长序列分析
2.2 同源性分析
2.3 半滑舌鳎POMC-a和POMC-b的系统进化分析
2.4 组织表达特性分析
2.5 半滑舌鳎POMC mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系
3 讨论
第四章 半滑舌鳎MCH基因的克隆和表达特征分析
1 材料和方法
1.1 实验用鱼
1.2 总RNA的提取
1.3 cDNA第一链的合成
1.4 MCH基因cDNA克隆
1.5 序列分析
1.6 MCH mRNA的组织表达与时空表达模式
2 结果
2.1 cDNA全长序列分析
2.2 MCH的氨基酸序列同源性比较
2.3 半滑舌鳎MCH的系统进化分析
2.4 半滑舌鳎MCH mRNA的组织表达特性
2.5 半滑舌鳎MCH mRNA与无眼侧黑化程度的关系
3 讨论
第五章 半滑舌鳎MCHR基因的克隆和表达特征分析
1 材料和方法
1.1 实验用鱼
1.2 总RNA的提取
1.3 cDNA第一链的合成
1.4 中间片段的扩增
1.5 MCHR的RACE扩增
1.6 实时荧光定量PCR
1.7 序列分析及数据处理
2 结果
2.1 半滑舌鳎MCHR cDNA序列全长分析
2.2 半滑舌鳎MCHR的氨基酸序列同源性比较
2.3 半滑舌鳎MCHR的系统进化分析
2.4 半滑舌鳎MCHR mRNA的组织表达特性
2.5 半滑舌鳎MCHR mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系
3 讨论
论文小结
参考文献
致谢