青霉胺是青霉胺片的原料药, 可用于原发性高血压和心功能不全。《中华人民共和国药典》2010年版二部中青霉胺含量测定采用方法为硝酸汞电位滴定法。但该方法操作较为繁琐, HPLC法测定含量具有操作简便, 结果准确, 专属性强等优点。结合实际, 我们对青霉胺采用HPLC法测定含量的方法进行了研究, 以确认HPLC法是否适合青霉胺的含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪:日本岛津LC-10AD。
全自动电子天平:瑞士Sartorius BP211D。
自动电位滴定仪:上海雷磁仪器厂ZD-3型。
1.2 试药
青霉胺来源:江西东风药业股份有限公司;批号:PAM201010-1。
青霉胺对照品来源:中国药品生物制品检定所;批号:0498-9901;含量:98.08%。
乙二胺四乙酸二钠、磷酸二氢钠、1-己烷磺酸钠、磷酸均为分析纯。
1.3 溶液
稀释剂:取乙二胺四乙酸二钠1.0g溶解于适量水中, 并用水稀释至1000mL, 摇匀。流动相:称取6.9g磷酸二氢钠和0.20g1-己烷磺酸钠溶解于适量水中, 并用水稀释至1000mL, 摇匀。用10%磷酸溶液调节pH值至3.0±0.1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为依利特Hypersil C/10um (460mm300mm) , 检测波长为210nm, 流速为1.6mL/min, 进样量为20uL。
2.2 对照品溶液与供试品溶液的制备
(1) 对照品溶液。取青霉胺对照品31.25mg, 精密称定, 至25mL容量瓶中, 用稀释剂溶解并稀释至刻度, 即得。
(2) 供试品溶液。取青霉胺供试品31.25mg, 精密称定, 至25mL容量瓶中, 用稀释剂溶解并稀释至刻度, 即得。
2.3 线性关系
精密称取青霉素胺对照品18.75mg、25.00mg、31.25mg、37.50mg、43.75mg、置25mL容量瓶中, 用稀释剂溶解并稀释至刻度, 摇匀。分别进样20μL, 记录色谱图。以对照品浓度 (X, mg/mL) 对相应峰面积 (Y) 绘制标准曲线, 回归方程为X=1.139410Y=60.982, r=0.9991。结果表明, 青霉素胺在浓度0.75~1.75mg/mL的范围内呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
取试验用对照品溶液, 重复进样6次, 记录色谱图, 按峰面积计算, RSD为0.11%。
2.5 稳定性试验
将试验用供试品溶液在室温放置, 分别于0h、1h、3h、5h取20μL进样, 记录色谱图, 按峰面积计算, RSD为0.78%。
2.6 回收率试验
精密称取青霉素胺对照品适量, 精密称定, 配制成测定浓度80%、100%、120%3个浓度的溶液, 各2份, 以20μL进样, 记录色谱图, 以峰面积计算平均回收率为99.9%, RSD=0.39% (n=6) , 如表1。
2.7 供试品测定
取试验用供试品溶液20μL注入液相色谱仪, 记录色谱图;另取试验用青霉胺对照品溶液同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中青霉素胺的含量, 并与《中华人民共和国药典》2005年版二部收载的方法进行比较, 结果见表2。
3 讨论
(1) 检测波长的选择。取青霉胺对照品用稀释剂溶解并制成每1mL含0.2mg的溶液, 在200nm~300nm的波长范围内扫描, 在210nm的波长处有最大吸收, 因此选择210nm为检测波长。
(2) 系统适应性。采用依利特Hypersil色谱柱进行试验, 理论塔板数达到8028。
(3) 用HPLC法测定青霉素胺的含量, 准确性及重现性均较好, 且操作简便, HPLC法与电位法进行比较, 测定结果基本一致, 因此可以用HPLC法替代电位法测定青霉胺的含量。
摘要：研究采用HPLC测定青霉胺含量的方法。试验结果表明, 采用色谱柱为依利特Hypersil C/10um (460mm300mm) , 检测波长为210nm, 流速为1.6mL/min。在0.75～1.75mg/mL的浓度范围内青霉胺的浓度与峰面积呈良好线形关系 (r=0.9991) , 平均回收率99.9%, RSD为0.39%。该方法适用于检测青霉胺的含量, 与硝酸汞电位滴定法相比, 该方法测定操作简便, 专属性高, 重现性好, 能取得满意结果。
关键词：HPLC法,青霉胺,含量测定
参考文献
[1] 药典委员会.中华人民共和国药典2010年版 (二部) [M].中国医药科技出版社, 2010:427.
[2] USP32-NF27.美国, 2008, 3220.
[3] 药典委员会.中华人民共和国药典2010年版 (二部) [M].北京化学工业出版社, 2005, 172.