论文题目：患病江豚微生态变化及迁地背景下江豚保护性研究
摘要：长江江豚是生活在长江中下游及鄱阳湖、洞庭湖等沿江大型湖泊的淡水豚类物种。近年来,随着工农业经济的快速发展,长江生态遭受严重破坏,长江江豚的栖息地环境持续恶化,导致其种群数量快速下降,由20世纪90年代的2700头,下降至2017年的1014头。目前,长江江豚处于极度濒危状态。迁地保护是进行长江江豚保护的重要举措之一,在江豚保种和科学研究中发挥了重要作用。然而,疾病感染和饲养管理技术欠缺严重制约了迁地保护区江豚的健康生长和种群繁育。近年来,长江江豚疾病频发,而关于长江江豚病原学（细菌和病毒）方面的研究几乎处于空白,迁地保护区饲养管理不当又时常引起江豚死亡率高和繁殖效率低。因此,有必要对长江江豚感染性疾病和迁地保护区江豚的饲养管理开展系统性研究,初步了解长江江豚细菌性疾病和病毒性疾病的流行病原,掌握长江江豚主要致病菌的生物学特性;建立迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病防治的技术规范。本研究开展了长江江豚细菌性疾病的病原学调查;长江江豚病料样本的病毒群落研究;长江江豚6种危害较大细菌的生物学特性研究;迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究,研究结果如下:1长江江豚细菌性疾病流行病学调查通过细菌的分离培养、染色镜检、理化鉴定、PCR鉴定等,对462份长江江豚呼吸孔、粪便、血液、内脏组织、皮肤病灶、腹腔积液、胸腔积液等样品进行了细菌的分离鉴定,同时使用16S r DNA高通量测序对患病长江江豚和健康长江江豚的肠道菌群进行了研究。结果从462份长江江豚样本中,获得655个细菌纯培养,分离鉴定成功31种细菌,分别为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、微球菌（Micrococcus）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、变形杆菌（Proteus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、嗜麦芽窄杆菌（Stenotrophomonas maltophilia）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、链球菌（Streptococcus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、诺卡氏菌（Nocardia）、弧菌（Vibrio）、不动杆菌（Acinetobacter）、魔氏摩根菌（Morganella morganii）、肠球菌（Enterococcus）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、弯曲杆菌（Campylobacter）、黄杆菌（Flavobacterium）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、志贺样邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）和丹毒丝菌（Erysipelothrix）,其中产气荚膜梭菌、弧菌、爱德华菌等11种细菌在长江江豚属首次发现,大肠杆菌、气单胞菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌在所有样品中检出率相对较高;肠道内容物高通量测序,共检测到菌属340种,其中15种为潜在致病菌属,分别为埃希氏菌属、乳杆菌属、链球菌属、绿脓杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、诺卡氏菌属、弧菌属、巴氏杆菌属、葡萄球菌属、魔氏摩根菌、肠球菌、幽门螺旋杆菌、弯曲杆菌。2长江江豚主要致病菌生物学特性研究利用微生物学、分子生物学、兽医药理学和兽医病理学方法对分离自长江江豚的6种主要致病菌（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌、魔氏摩根菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）进行了生物学特性研究。结果显示,分离菌株按照常规方法进行培养,均可良好生长,与其他动物源细菌无明显差异;生化研究和16s r RNA序列测定结果与各菌最初鉴定结果表型一致;细菌耐药性研究结果显示,6种菌均存在一定程度的耐药性,以大肠杆菌的耐药性最强,金黄色葡萄球菌的最弱,气单胞菌属不同菌之间耐药性存在一定差异;BALB/c小鼠致病性试验证实,6种菌对小白鼠均有致病性,以维氏气单胞菌和杀鲑气单胞菌的致病力最强,金黄色葡萄球菌的致病力最弱,感染小白鼠剖解病理变化存在一定差异,但主要以肺脏瘀血、出血和肝脏瘀血、变性和坏死为主。3长江江豚病毒性疾病研究初探通过病毒宏基因组学研究方法,对收集自2017-2019年野外患病死亡的长江江豚组织病料（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤等）进行了病毒群落研究和分析。结果共获得10600个重叠序列（contigs）,检测到病毒65个,其中,基于参考序列鉴定出病毒25种,Denovo序列鉴定病毒42种。科水平上,两种方法鉴定出的优势病毒为肌尾噬菌体科（Myoviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）、长尾噬菌体科（Siphoviridae）、线头病毒科（Nimaviridae）、阿克曼病毒科（Ackermannviridae）、痘病毒科（Poxviridae）、丝状噬菌体科（Inoviridae）、短尾噬菌体科（Podoviridae）、砂粒病毒科（Arenaviridae）、有尾噬菌体目未分类病毒科（Caudovirales unclassified）。除疱疹病毒外,噬菌体病毒、逆转录病毒、线头病毒、痘病毒和砂粒病毒等均为首次在长江江豚上发现。4迁地保护区长江江豚的饲养管理与疾病防治研究通过临床大量实践和数据分析,分别对迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中生长的长江江豚的饲养管理和疾病防治技术进行了研究,结果,总结制定出迁地保护区大水域、围网环境下和疗养池中长江江豚饲养管理的技术规范,计算统计出长江江豚血常规和血液生化的正常阈值,发现了长江江豚各生理生化指标与江豚疾病诊断间的相关性,建立了长江江豚健康体检的技术规范和健康评价标准,基本形成了长江江豚常见疾病诊断与治疗的方法技术体系,其中通过静脉滴注对患病长江江豚进行治疗的技术在国内处于领先水平。综上所述本研究首次系统阐明了长江江豚细菌性疾病的流行特点;初步探明了长江江豚病料样本病毒群落的结构和组成,并首次发现了大量的长江江豚源病毒;揭示了6种常见致病菌的生物学特性,提供了细菌性疾病药物治疗和疫苗研发的参考信息;建立了迁地保护区长江江豚饲养管理和疾病诊疗的技术规范。饲养管理和疾病防控是迁地保护区长江江豚管理的两个重要方面,也是当前长江江豚保种面临的主要问题,知己（不断提高长江江豚的饲养管理和疾病防治水平等）和知彼（掌握长江江豚传染性疾病的流行特点、病原的生物学特性、长江江豚生长特性和各个生长阶段的饲养管理要点等）,方能有效解决长江江豚在迁地保护过程中疾病防控盲目和饲养管理欠缺的现状,为长江江豚、中华白海豚等鲸类动物的健康成长和种群繁育提供理论支持。
关键词：长江江豚;迁地保护;细菌;病毒;饲养管理;疾病防治
学科专业：临床兽医学
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第一部分 文献综述
1 长江江豚概况
1.1 江豚分类
1.2 江豚的地理分布
1.3 长江江豚的生活习性及特征
1.4 长江江豚现状
1.5 长江江豚保护生物学研究进展
2 长江江豚迁地保护概述
2.1 迁地保护
2.2 江豚迁地保护历史
2.3 长江江豚迁地保护现状
2.3.1 湖北石首天鹅洲江豚保护区天鹅洲故道江豚繁育群体
2.3.2 安徽铜陵淡水豚保护区夹江江豚繁育群体
2.3.3 安徽安庆西江迁地保护区江豚繁育群体
2.3.4 湖北何王庙/湖南集成垸迁地保护区江豚繁育群体
2.3.5 中国科学院水生生物研究所白鱀豚馆人工养殖种群
2.4 长江江豚迁地保护面临的问题
2.4.1 半自然水域长江江豚的繁殖生物学研究欠缺
2.4.2 长江江豚疫病防控体系不健全
2.4.3 人工调控和生态补偿机制不足
2.4.4 人为伤害和气候条件是潜在的致危因素
3 鲸豚类动物疾病研究进展
3.1 海洋鲸豚类动物细菌性疾病研究进展
3.2 海洋鲸豚类动物病毒性疾病研究进展
3.2.1 鲸豚源麻疹病毒
3.2.2 鲸类痘病毒
3.2.3 鲸类乳头状瘤病毒
3.2.4 疱疹病毒/类疱疹病毒
3.2.5 流感病毒
3.2.6 其他病毒
3.3 海洋鲸豚类动物真菌性疾病研究进展
3.4 海洋鲸豚类动物寄生虫性疾病研究进展
4 长江江豚疾病研究概况
4.1 长江江豚疾病研究现状
4.1.1 解剖学研究
4.1.2 血液生理学研究
4.1.3 饲养管理研究
4.1.4 疾病相关研究
4.2 有关长江江豚疾病防控的几点讨论
5 本研究的目的与意义
第二部分 试验部分
第一章 长江江豚细菌性疾病流行病学调查
1 研究背景
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 试验试剂
2.2 方法
2.2.1 样品采集
2.2.2 长江江豚源细菌的分离鉴定
2.2.3 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定
3 结果
3.1 长江江豚细菌性样品采集结果
3.2 细菌分离鉴定结果
3.2.1 呼吸孔样本细菌分离鉴定结果
3.2.2 粪便样本细菌分离鉴定结果
3.2.3 内脏组织细菌分离鉴定结果
3.2.4 皮肤病灶细菌分离鉴定结果
3.2.5 腹腔积液细菌分离鉴定结果
3.2.6 胸腔积液细菌分离鉴定结果
3.2.7 血液样本细菌分离鉴定结果
3.3 细菌分离培养形态及染色镜检结果
3.4 细菌理化鉴定结果
3.5 细菌PCR鉴定结果
3.6 长江江豚肠道菌群16SrDNA测定结果
3.6.1 测序数据处理
3.6.2 OTU分析和物种注释
3.6.3 各样品细菌多样性及相关性分析
4 分析与讨论
4.1 长江江豚样品采集方法和处理方法的选择
4.2 水生哺乳动物细菌性疾病检测方法
4.3 长江江豚细菌性疾病流行情况
4.4 江豚呼吸道菌群与疾病的相关性
4.5 江豚胃肠道菌群与疾病的相关性
4.6 长江江豚的主要致病菌
5 总结
第二章 长江江豚主要致病菌生物学特性研究
1 研究背景
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 细菌样本
2.1.2 试验动物
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 试验试剂
2.2 方法
2.2.1 细菌培养特性观察
2.2.2 细菌理化特性鉴定
2.2.3 PCR扩增和测序
2.2.4 基因序列分析
2.2.5 药物敏感性试验
2.2.6 细菌致病性试验
3 结果
3.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株生物学特性研究结果
3.1.1 嗜水气单胞菌YHA-AQ株细菌培养特性
3.1.2 嗜水气单胞菌YHA-AQ株理化特性鉴定结果
3.1.3 嗜水气单胞菌YHA-AQ株遗传进化关系
3.1.4 嗜水气单胞菌YHA-AQ株药物敏感性试验结果
3.1.5 嗜水气单胞菌YHA-AQ株小鼠致病力试验
3.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株生物学特性研究结果
3.2.1 维氏气单胞菌YVA-AQ株细菌培养特性
3.2.2 维氏气单胞菌YVA-AQ株理化特性鉴定结果
3.2.3 维氏气单胞菌YVA-AQ株遗传进化关系
3.2.4 维氏气单胞菌YVA-AQ株药物敏感性试验结果
3.2.5 维氏气单胞菌YVA-AQ株小鼠致病力试验
3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株生物学特性研究结果
3.3.1 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株细菌培养特性
3.3.2 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株理化特性鉴定结果
3.3.3 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株遗传进化关系
3.3.4 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株药物敏感性试验结果
3.3.5 杀鲑气单胞菌YSA-AQ株小鼠致病力试验
3.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株生物学特性研究结果
3.4.1 魔氏摩根菌YMM-AQ株细菌培养特性
3.4.2 魔氏摩根菌YMM-AQ株理化特性鉴定结果
3.4.3 魔氏摩根菌YMM-AQ株遗传进化关系
3.4.4 魔氏摩根菌YMM-AQ株药物敏感性试验结果
3.4.5 魔氏摩根菌YMM-AQ株小鼠致病力试验
3.5 大肠杆菌YE-AQ株生物学特性研究结果
3.5.1 大肠杆菌YE-AQ株细菌培养特性
3.5.2 大肠杆菌YE-AQ株理化特性鉴定结果
3.5.3 大肠杆菌YE-AQ株遗传进化关系
3.5.4 大肠杆菌YE-AQ株药物敏感性试验结果
3.5.5 大肠杆菌YE-AQ株小鼠致病力试验
3.6 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株生物学特性研究结果
3.6.1 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株细菌培养特性
3.6.2 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株理化特性鉴定结果
3.6.3 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株遗传进化关系
3.6.4 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株药物敏感性试验结果
3.6.5 金黄色葡萄球菌YSS-AQ株小鼠致病力试验
4 讨论
4.1 长江江豚常见致病菌的培养特性
4.2 长江江豚源细菌的鉴定方法
4.3 长江江豚源细菌的耐药性
4.4 长江江豚源细菌的致病性
5 结论
第三章 长江江豚病毒性疾病研究初探
1 研究背景
1.1 病毒性疾病对人和动物的危害
1.2 长江江豚病毒性疾病研究现状
1.3 未知病毒检测方法研究进展
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病料样本
2.1.2 试验仪器
2.1.3 试验试剂耗材
2.2 方法
2.2.1 试验流程
2.2.2 测序数据质控
3 结果
3.1 测序数据质控
3.2 去除宿主污染
3.3 病毒组成分析
3.4 数据组装
3.5 病毒序列鉴定
3.5.1 基于参考序列的鉴定
3.5.2 Denovo病毒序列鉴定
3.5.3 基于参考序列鉴定与Denovo序列鉴定的比较
3.6 病毒丰度
3.7 基因预测
3.8 功能分析
4 分析与讨论
4.1 高通量测序技术与未知病毒检测
4.2 长江江豚病毒宏基因组学样本的处理
4.3 检测相关病毒分析
5 总结
第四章 长江江豚的饲养管理与疾病防治研究
1 研究背景
2 材料与方法
2.1 研究对象
2.2 研究方法
2.2.1 长江江豚的饲养管理
2.2.2 长江江豚血液学研究
2.2.3 长江江豚健康体检方法的建立
2.2.4 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究
2.2.5 长江江豚典型病例诊治分析
3 结果
3.1 长江江豚的饲养管理
3.1.1 围网环境下长江江豚的饲养管理
3.1.2 迁地保护区大面积水域长江江豚的饲养管理
3.1.3 疗养池长江江豚的饲养管理
3.2 长江江豚血液学研究
3.2.1 长江江豚血常规和血液生化指标测定方法的建立
3.2.2 长江江豚正常生理生化指标参考范围的确定
3.2.3 长江江豚生理生化指标与其疾病的相关性
3.2.4 长江江豚健康体检技术规范
3.2.5 长江江豚疾病诊断与治疗方法研究
3.2.6 长江江豚典型病例诊治分析
4 分析与讨论
5 结论
全文结论
参考文献
致谢