黄曲霉毒素是一类真菌 (如黄曲霉和寄生曲霉) 的有毒代谢产物, 具有很强毒性, 能强烈破坏人和动物的肝脏组织, 严重时会导致肝癌甚至死亡[1]。已经鉴定的黄曲霉毒素有20多种, 主要有B1、B2、G1、G2以及另外两种代谢产物M1、M2。在天然污染食品中以黄曲霉毒素B1最为多见, 其毒性和致癌性也最强。花生是最容易被黄曲霉污染的粮食, 所以花生制品花生油的黄曲霉毒素含量检测具有现实意义[2,3]。目前, 黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法、微柱法、高压液相色谱法、ELISA法和免疫亲和柱法等[4]。本文试图研究不同体积比乙酸-水溶液作为提取液对花生油中黄曲霉毒素的提取效果, 通过对空白样品加标, 尝试合适前处理方法, 借助高效液相色谱-串联质谱仪测回收率, 以寻找合适浓度的提取液。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器:高效液相色谱仪 (Agilent 1200) ;高速冷冻离心机 (美国Sigma公司) ;净化柱 (Agilent Bond Elut-PH, 500mg 3m L, 50/PK) ;移液枪 (美国Thermo Scientific公司) ;ML204/02型电子天平 (梅特勒上海有限公司) ;黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品 (单标, 浓度均为2.0μg/m L, 北京中科质检生物技术有限公司) ;乙腈;冰乙酸;二级水。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
将黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品用乙腈稀释为200μg/L的混合标准溶液, 再用乙腈:水 (10:90) 依次稀释配制成浓度分别为100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0μg/L的标准工作溶液, 乙腈:水 (10:90) 为实验空白。
1.2.2 样品前处理方法
用移液枪称取散装花生油样2g (精确到0.0001g) 于50m L离心管中, 加入10m L提取液, 用涡旋器涡旋2min, 于高速冷冻离心机内8000r/min离心2min。水相转移到另一离心管中, 再加5m L提取液重复提取一次, 合并水相, 过净化柱, 用1m L乙腈:水 (10:90) 定容, 滤膜过滤, 供高效液相色谱-串联质谱分析[5]。过净化柱方法:先加10m L甲醇活化净化柱, 加6m L相应浓度提取液润洗, 过样品提取液 (合并后的水相) , 再依次加入6m L相应浓度提取液、6m L水洗涤, 用水泵充分抽干净化柱, 最后加9m L三氯甲烷洗脱并收集洗脱液, 45℃恒温氮气吹干。
1.2.3 色谱条件
色谱柱Agilent Eclipse plus.C18 (2.1mm×100mm) , 1.8μm;进样体积5μL;流速0.2 m L/min;柱温40℃。梯度变化为线性变化, 流动相A为乙腈, 流动相B为V (甲酸) :V (水) =0.1:99.9。色谱分离梯度条件如下:T=0.00min时A为10%, B为90%;T=3.00min时A为30%, B为70%;T=8.00min时A为100%, B为0%;T=8.10min时A为10%, B为90%;T=10.00 min时A为10%, B为90%;
1.2.4 质谱条件
电喷雾离子源 (ESI) ;正离子扫描模式;多反应监测 (MRM) 模式;源温度150℃;毛细管电压2.82k V;脱溶剂气温度500℃;脱溶剂气流量800L/h;碰撞气流量0.13m L/min。其他参数见表1 (注:*为定量离子) 。
2 结果与讨论
2.1 线性范围与检出限
为了提高方法的可靠性和结果的准确度, 本方法采用空白基质溶液作为稀释液配制系列标准工作溶液的方法消除基质效应的影响。各浓度标准溶液分别进样检测, 以定量离子测定结果进行线性回归计算, 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液在1~100μg/L浓度范围内呈良好线性关系, 相关系数 (R2) 均大于0.99。以不含目标物的花生油作为本底, 采用加标方式考察方法检出限, 以S/N≥3作为方法检出限, 得到B1、B2、G1、G2检出限均为0.5μg/kg。
2.2 回收率
实验选取空白花生油作为样品和6种不同浓度乙酸溶液 (0%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%乙酸) 作为提取液;选3个水平加标浓度 (0.5、5.0、25.0μg/kg) , 每个水平做5个平行, 按1.2.2处理样品, 最后供高效液相色谱-串联质谱分析[5]。每个水平的回收率结果以平均值表示, 见图1、图2。
3 结语
由实验结果可看出, 以体积浓度为2%乙酸-水提取花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2取得较好的提取效率, 基本满足实验室测定要求。由于乙酸-水体系作为提取液与乙腈-水、甲醇-水相比低毒环保, 对长期从事此类实验的实验人员来说, 使用乙酸-水体系作为提取液可减少实验过程中有机试剂对身体的危害, 同时也符合绿色化工的要求, 具有现实意义。
摘要：用乙酸-水提取液体系提取花生油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2, 以高效液相色谱-串联质谱法测定, 对不同比例的乙酸与水对花生油中黄曲霉毒素的提取效率进行研究。结果发现, 以2%乙酸-水为提取液提取效果较好, 回收率均在80110%之间, 方法检出限 (S/N=3) 均为0.5μg/kg。
关键词：UPLC-MS/MS,花生油,黄曲霉毒素
参考文献
[1] 李鹏, 赖卫华, 金晶.食品中真菌毒素的研究[J].农产品加工, 2005, 34 (3) :12-15.
[2] 廉慧锋, 赵笑天, 王蓉珍, 等.超高效液相色谱–串联质谱法同时测定玉米、花生、麦仁中的9种真菌毒素[J].食品科学, 2010, 31 (20) :360-366.
[3] Starr J M, Selim M I.Supercritical fluid extraction of aflatoxin B1 from soil[J].J.Chromatography A, 2008, 1209:37-43.
[4] 林建忠, 邹伟, 张志刚, 等.LC/MS/MS测定食品中黄曲霉毒素B1的研究[J].检验检疫科学, 2004 (14) :31-33.-69.
[5] 林建忠, 邹伟, 张志刚, 等.LC/MS/MS测定食品中黄曲霉毒素B1的研究[J].检验检疫科学, 2004, 14 (增刊) :31-33.