1 15N同位素稀释和示踪技术基本原理
15N同位素稀释技术是量化土壤总N转化速率的有效方法, 是依赖于对某一形态产物的15N标记及其稀释和富集动态监测[1], 15N同位素示踪技术则主要依赖于对一形态底物的15N的标记及其稀释和富集动态监测。由此可见, 利用15N同位素稀释和示踪原理, 不仅可以量化土壤N转化速率, 还可揭示N素生产和消耗途径。
2 15N同位素稀释和示踪技术方法
目前, 利用15N同位素稀释和示踪技术研究N素总转化速率的分析方法有算术分析法和数值分析法两种。基于Kirkham和Bartholomew提出15N同位素稀释法模型, Blackburn提出了低丰度的15N标记方法, 公式如下:
式中, M0:培养过程to时刻的N的总含量15N+14N;M1:培养过程t1时刻N的总含量15N+14N;H0:培养过程to时刻15N百分超, 即被标记的15N丰度和15N自然丰度之差;H1:培养过程t1时刻15N百分超;t:测定时间间隔即t=t1-to;m:总N产生速率;c:总N消耗速率。
上述方程既可用15NH4+-N或15NO3--N标记[2]。
由于森林土壤N循环过程复杂, 需要量化的参数多, 而基于算术分析的15N同位素标记方法由于未考虑15N再矿化这一因素, 只适合短期测定, 且量化的参数少, 数值分析法因为克服上述问题越来越受到重视。有关N素总转化速率量化的数值分析法, 程谊等[3]做了很好的归纳。目前, Müller等基于马尔柯夫链蒙特卡洛随机采样方法开发的15N同位素示踪过程模型, 将土壤有机N库拆分为活性、惰性氮库, 允许采用零级、一级和米门动力学公式对N转化进行描写, 可对有机N的矿化、NH4+固持到难分解有机N、易分解有机N的矿化、NH4+固持到易分解有机N、总N矿化、总NH4+固持、自养硝化、异养硝化、总硝化、总NO3-固持和硝酸盐异化为铵 (DNRA) 等过程进行同步量化, 备受关注。
3 森林土壤N转化、运移关键过程的15N同位素研究
森林土壤N素转化过程, 如N矿化、硝化、反硝化和硝酸盐异化还原为铵 (DNRA) 和N微生物固持、植物N素吸收均存在不同程度的N同位素分馏效应。通过N同位素分馏效应的研究, 可有效揭示植物、微生物N的利用途径。
利用15N同位素稀释技术和示踪技术来分析土壤N素迁移转化动态, 是当前森林生态学一个研究重点。相关研究主要可回答如下问题:第一, 森林土壤总N矿化速率和净N矿化速率比例关系及其关键调控因子;第二, 森林土壤微生物和植物根系对N素的竞争中谁占优势;第三, 全球大气N沉降增加背景下, 外源性N输入对不同类型的森林土壤N循环产生的影响。需要说明的是, 土壤总N矿化速率和净N矿化速率比例关系因森林类型、土壤肥力和土层深度等不同而有所差异。如Zhang等[4]则采用15N同位素稀释法和模型分析来量化土壤N转化速率, 研究发现, 与北方温带针叶林相比, 中国南方亚热带森林土壤N矿化速率高和N周转快。
运用稳定性15N同位素示踪技术可以揭示森林生态系统植物和土壤微生物的N竞争关系。有关森林植物和土壤微生物对N的竞争的研究主要围绕两点展开, 一是在N源的竞争上存在无机N源和有机N源之争;二是在竞争关系上, 植物和微生物对N竞争的相对优势。传统观点认为, 植物仅能利用土壤有机物经矿化作用形成的无机态N。相应地, 植物和微生物对N源的竞争主要围绕NH4+-N和NO3--N展开。植物和微生物对无机N的竞争的证据来源长期和短期的15N同位素示踪实验, 土壤无机N库标记丰度较高丰度的15NH4+-N和15NO3--N, 经过短期培养 (15 d) , 测定植物、微生物和土壤无机N库及其同位素组成。在长期的15N同位素实验中, 采用相同的示踪技术, 不同的是测定的时间为培养后的数周或数月。基于15N同位素示踪实验研究的结果, 目前较为流行的观点是, 短期时微生物在无机N的竞争上占有优势, 且微生物偏向于利用NH4+-N, 长期而言植物是最终的赢家。近年来, 借助15N同位素示踪技术, 越来越多的证据显示植物根系, 尤其是和菌根真菌有联系的植物根系, 可以直接吸收有机态N。植物根系对有机N的吸收能减少植物对微生物矿化N的依赖, 潜在缓解植物和微生物对N素的竞争。尽管如此, 上述研究仍无定论, 尤其是根际土壤微生物-植物的N素营养竞争关系知之甚少。
在全球大气N沉降增加的背景下, 当前生态学界普遍关注的一个的问题是外源性N输入对森林生态系统C循环和养分循环有何影响。当外源性N输入超过生态系统生物生理需求和非生物持留能力时, 森林土壤出现“N饱和”现象, 伴随着NO3--N淋溶加剧、净硝化作用增加、N矿化先增加后降低、气态N损失和土壤酸化等一系列土壤过程非线性变化响应。简而言之, 在外源性N输入的情形下, 矿物N相对丰富的热带、亚热带和温带森林土壤N循环易由封闭状态向开放状态 (如反硝化和淋溶) 的转变。而有关N沉降对森林土壤N素循环的影响, 多数研究结果集中在净N矿化速率层面。Corre等采用15N同位素稀释法研究则发现, 德国云杉林土壤总N矿化、总硝化在中等富N状态下达到最大, 在高度富N状态下均有所下降。
4 森林土壤N素持留机制的15N同位素研究
一般来说, 矿物N相对丰富的生态系统, 如热带、亚热带和温带森林土壤N矿化和硝化速率快, 加大了N素流失特别是NO3--N淋溶风险的同时也形成了有效的N素持留机制:如调控植物和微生物对N素的吸收、硝酸盐异化还原为铵 (DNRA) 、NO3--N非生物性吸持为土壤有机质 (SOM) 和土壤有机N (SON) 再矿化、低土壤p H值抑制氨气 (NH3) 挥发等。Stark等采用1 5N同位素稀释技术研究墨西哥和俄勒冈州未受干扰的针叶林土壤NO3--N的动态时发现, 尽管土壤总硝化速率相当高, 而微生物能快速同化所产生的NO3--N。与S t a r k等结果一致, Z h u等[5]采用15N同位素示踪技术对中国亚热带酸性森林土壤研究发现, 土壤产生的NO3--N中有17.2%~74.9%被微生物固持。对此, Huygens等[6,7]利用15N同位素稀释技术和15N示踪技术研究智利南部常绿假山毛榉雨林火山土壤的N循环过程, 发现异养硝化及其耦合的DNRA过程、NO3--N转化为不易淋溶损失的有机态N、溶解性有机N (DON) 转化和溶解性无机N (DIN) 过程的解耦三个过程对于原始温带雨林生物可利用性N持留作用重大。他们的研究显示, 添加15N一年后, 15NH4+-N和15NO3--N的回收率分别为84%、69%, 表明大量的NH4+-N和NO3--N被该森林土壤截留。异养硝化作用对总NO3--N生产的贡献达96%, 总无机N的贡献约为10%。大约26%通过异养硝化产生的NO3--N经DNRA过程迅速转化为NH4+-N, 大约69%通过异养硝化产生的NO3--N固持到不同的有机N库。最近, Zhang等[4]的15N同位素示踪研究显示:中国南方的酸性森林0~20 cm土壤NH4+-N的产生速率为 (3.04±0.90) mg (kg·d) , NH4+-N的固持速率为 (1.8 0±1.1 3) m g (kg·d) , 自养硝化速率为 (0.14±0.17) mg/ (kg·d) , 异养硝化速率为 (0.70±0.46) mg/ (kg·d) , NO3-N吸持为S O M速率为 (0.6 5±0.4 1) m g/ (k g·d) 和DNRA速率为 (0.04±0.03) mg/ (kg·d) 。中国北方森林0~20 cm土壤NH4+-N的产生速率为 (1.80±0.50) mg/ (kg·d) , NH4+-N的固持速率为 (0.59±0.96) mg (kg·d) , 自养硝化速率为 (1.07±1.57) mg/ (kg·d) , 异养硝化速率为 (0.22±0.31) mg/ (kg·d) , NO3--N吸持为SOM速率为 (0.04±0.11) mg/ (kg·d) 和DNRA速率为 (0.05±0.04) mg/ (kg·d) 。基于上述研究结果, Zhang等[4]阐明中国南方酸性森林土壤无机N的保留机制为低的异养硝化速率、低的NH3挥发速率、较高速率的NO3--N固持为有机N抵消了径流、淋溶和反硝化的影响。
5 研究不足与展望
尽管15N同位素稀释技术和示踪技术能准确地测定森林土壤N素总转化速率, 但测定结果受诸多条件限制, 存在较大的不确定性。如果不能合理解释利用15N标记测定的结果, 易得出误导性的结论。这就要求在实验技术上, 确保15N均匀标记于土壤。目前, 多孔细针注射法可以降低操作上的误差。另一个问题是, 室内溶液注射易改变土壤水分, 野外15N的添加可能由于NH3的挥发或NO3--N淋溶造成标记的15N损失, 且外源性添加的15N是否产生激发效应 (如硝化作用强的森林土壤) , 有待确定。再者, 由于土壤粘土矿物的吸附, 起始标记的部分15N如15NH4+-N被吸附, 测定N素总转化速率需要待吸附平衡后确定一个合理的起始时间。
当前, 有关森林土壤N素总转化速率和土壤温室气体如N2O通量的15N同位素研究十分丰富。然而, 极少有研究能将森林土壤含N温室气体通量和土壤N素总转化速率结合分析, 同时量化硝化、反硝化过程对N2O排放的相对贡献。在全球大气N沉降增加的背景下, 外源性N持续输入在多大程度会影响森林土壤N循环过程、改变植物和土壤微生物间的N素竞争关系;在森林土壤“N饱和”过程中, 会形成何种N素持留机制;N沉降增加导致的森林土壤N2O净排放通量发生改变的N素调控机制, 和硝化作用和反硝化作用的关系, 这些将是今后研究的重点和难点, 离不开稳定性15N同位素稀释技术和示踪技术的支撑。
摘要：森林土壤N素形态、N库动态及其运移转化特征备受关注。采用稳定性15N同位素稀释技术和示踪技术测定森林土壤总N转化速率和15N回收率, 可以揭示森林土壤N素特别是无机N的运移转化规律和持留机制。由此可见, 稳定性15N同位素技术在森林土壤N循环研究中的作用举足轻重。基于此, 介绍15N同位素稀释技术测定土壤总N转化速率的基本原理和15N同位素示踪技术研究土壤N素运移规律的基本思路, 并简要列举了稳定性15N同位素技术和示踪技术在森林土壤N素转化、运移和持留机制研究中的应用实例, 同时指出此法的不足和应用前景。
关键词：总N转化速率,持留机制,15N同位素稀释技术,15N同位素示踪技术,同位素分馏
参考文献
[1] Killham, K.Soil ecology[M].Cambridge University Press, 1994.
[2] AK Das, L Boral, RS Tripathi, et al.Nitrogen mineralization and microbial biomass-N in a subtropical humid forest of Meghalaya, India[J].Soil Biology&Biochemistry, 1997, 29 (9-10) :1609-1612.
[3] 程谊, 蔡祖聪, 张金波.15N同位素稀释法测定土壤氮素总转化速率研究进展[J].土壤, 2009, 41 (2) :165-171.
[4] Zhang J, Cai Z, Zhu T, et al.Mechanisms for the retention of inorganic N in acidic forest soils of southern China[J].Scientific Reports, 2012, 3 (6145) :2342.
[5] Zhu T, Meng T, Zhang J, et al.Nitrogen mineralization, immobilization turnover, heterotrophic nitrification, and microbial groups in acid forest soils of subtropical China[J].Biology and Fertility of Soils, 2013, 49 (3) :323-331.
[6] Huygens D, Rutting T, Boeckx P, et al.Soil nitrogen conservation mechanisms in a pristine south Chilean Nothofagus forest ecosystem[J].Soil Biology&Biochemistry, 2007, 39 (10) :2448-2458.
[7] Huygens D, Boeckx P, Templer P, et al.Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils[J].Nature Geoscience, 2008, 1 (8) :543-548.