论文题目：肠道菌群与色氨酸代谢在鲫造血器官坏死病发生发展中的作用研究
摘要：近年来,由鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cy HV-2）引起的鲫造血器官坏死病,严重危害全球多个国家的金鱼和鲫鱼养殖业,造成巨大的经济损失。该病发病率和死亡率都很高,目前尚无有效的防控方法。近年来,肠道微生物是微生物学和医学领域的研究热点,在机体健康和疾病方面发挥着至关重要的调控作用,参与调节宿主代谢、免疫、生长发育等。然而,目前关于异育银鲫肠道微生物与Cy HV-2感染之间的相关性研究甚少。本研究联合使用Illumina Mi Seq测序技术和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析Cy HV-2感染的异育银鲫的肠道菌群组成和代谢物谱,并利用R语言Pearson系数分析肠道菌群与代谢物间的相关性。根据肠道菌群及代谢组分析结果,以色氨酸代谢下游Ah R（Aryl hydrocarbon Receptor）通路为例,进一步验证Ah R通路对Cy HV-2感染异育银鲫进程的影响,明确肠道菌群及其代谢产物与Cy HV-2感染密切相关,为鲫造血器官坏死病的防控提供有价值的理论依据和实践指导。主要研究结果如下:1.高通量测序结果表明,异育银鲫肠道菌群在门水平上以变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主;在属水平上,异育银鲫肠道内相对丰度较高的菌属为气单胞菌属、鲸杆菌属、黄杆菌属、希瓦氏菌属等。Cy HV-2感染改变了异育银鲫肠道菌群结构,与对照组相比,Cy HV-2感染组变形菌门和厚壁菌门的相对丰度显著增加,而梭杆菌门的丰度降低（p＜0.05）;Cy HV-2感染组鲸杆菌属相对丰度显著降低,而气单胞菌属的相对丰度显著增加（p＜0.05）。藉此推测,Cy HV-2感染影响异育银鲫肠道物理屏障。进一步研究证实,Cy HV-2感染使肠道上皮细胞之间的紧密连接不完全,间隙变宽,肠绒毛分布不均匀甚至脱落;Cy HV-2感染下调物理屏障功能相关基因表达,CLDN（Claudin）、VPF（Vascular permeability factor）、OCLD（Occludin）、ET（Endothelin）、ZO（Zonula occludens）和TF（Tight function）的相对表达分别下调了26.54倍、9.08倍、16.99倍、30.98倍、14.42倍和14.69倍。2.LC-MS分析表明,Cy HV-2感染显著改变异育银鲫肠道内24种代谢物。其中,8种代谢物的浓度升高,包括高良姜素、6-（二溴乙烯）-17β-羟基雄激素-4-3-丙酸酯、1-脱氧-D-丙庚酮糖7-磷酸、鞣花酸、D-麦芽糖、丙氨酰缬氨酸、N-a-乙酰-L-精氨酸、亚磷酸酯;16种代谢物的浓度降低;KEGG注释表明,Cy HV-2感染后11条信号通路表示出显著变化（p＜0.05）。其中,最显著不同的前5条信号通路是是色氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、碳水化合物消化吸收、代谢通路和味觉转导。肠道菌群与代谢产物相关性分析表明,有7种代谢物与气单胞菌属有明显的相关性,其中甘草次酸、1-磷酸景天庚酮糖、多奈哌齐和2-氧精氨酸与气单胞菌呈正相关,1-酮糖和8-异-15-酮基-前列腺素与其呈负相关;18种代谢物与鲸杆菌属存在明显的相关性,包括单磷酸腺苷、4-酮环磷酰胺、Lyso PC（24:0）、D-葡萄糖酸、顺乌头顺-4-羧基亚甲基丁-2-烯-4-内酯、4-吡哆酸、4-羟基苯甲醛、吡咯烷酮羧酸、吲哚乙醛、13-氧代ODE、L-半胱氨酸、酮亮氨酸、4-羟基苯基丙酮酸、脱氧核糖5-磷酸、硬脂酰鞘磷脂、植物鞘氨醇和2-氧代精氨酸。3.以色氨酸代谢为例,反向验证其变化对病毒感染进程的影响。结果表明,Cy HV-2感染显著上调色氨酸代谢下游Ah R1和Ah R2在异育银鲫头肾中的相对表达。Ah R信号通路激活剂FICZ（6-Formylindolo[3,2-b]carbazole）可有效激活异育银鲫体内Ah R信号通路,腹腔注射FICZ高效抑制Cy HV-2在异育银鲫体内的增殖,这种抑制作用与其上调抗病毒基因的表达和增强Th2免疫应答有关。综上所述,Cy HV-2感染导致异育银鲫肠道菌群失调,并诱导了条件性致病菌—气单胞菌的增殖,降低了有益菌鲸杆菌属丰度;Cy HV-2感染引起肠道代谢产物变化,肠道菌群与代谢产物存在显著相关性;差异代谢产物显著富集到色氨酸等代谢通路,影响肠道微生物组的代谢功能,导致肠壁通透性异常。激活色氨酸代谢相关通路—Ah R通路对于Cy HV-2感染具有一定的抑制作用,进一步深入探究其影响机制将为Cy HV-2感染的治疗提供新靶点,为异育银鲫的免疫防控提供新思路。
关键词：鲫造血器官坏死病;异育银鲫;肠道菌群;肠道代谢组学;色氨酸代谢
学科专业：水产
摘要
Abstact
第一章 前言
1.1 鲫造血器官坏死病简介
1.2 鱼类肠道菌群
1.3 色氨酸代谢通路
1.3.1 犬尿氨酸代谢通路(kynurenine pathway,KP)
1.3.2 5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine)途径(血清素途径)
1.3.3 吲哚(Indole)途径
1.4 色氨酸代谢与AhR(Aryl Hydrocarbon Receptor)通路
1.5 AhR在动物机体健康和疾病中的作用
1.6 研究目的与意义
第二章 Cy HV-2感染后异育银鲫肠道菌群的变化特征
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物与管理
2.1.2 主要实验试剂
2.1.3 主要实验设备
2.1.4 人工感染
2.1.5 样品制备
2.1.6 CyHV-2定量分析
2.1.7 Illumina PE250文库测序
2.1.8 菌群多样性分析
2.1.9 肠道结构观察
2.1.10 肠道紧密连接相关基因的表达
2.1.11 气单胞菌的体外分离培养
2.1.12 统计分析
2.2 实验结果
2.2.1 人工感染CyHV-2后异育银鲫不同组织中的病毒载量
2.2.2 CyHV-2感染异育银鲫肠道菌群的变化特征
2.2.3 肠道组织结构的观察及物理屏障相关基因表达的检测
2.2.4 气单胞菌的体外分离培养
2.3 讨论
2.4 结论
第三章 CyHV-2感染后异育银鲫肠道代谢物的变化及其与菌群的相关性分析
3.1 实验材料与方法
3.1.1 实验动物与管理
3.1.2 主要实验试剂
3.1.3 主要实验设备
3.1.4 人工感染
3.1.5 样品制备
3.1.6 代谢组学分析
3.1.7 肠道菌群与代谢物之间的相关性分析
3.2 实验结果
3.2.1 代谢组学分析
3.2.2 CyHV-2感染后肠道菌群和代谢物之间的相关性分析
3.3 讨论
3.4 结论
第四章 异育银鲫体内AhR表达与CyHV-2感染的相关性分析
4.1 实验材料与方法
4.1.1 实验动物与管理
4.1.2 主要实验试剂
4.1.3 主要实验设备
4.1.4 AhR通路关键基因的组织特异性分布
4.1.5 CyHV-2感染对AhR通路中关键基因和蛋白表达的影响
4.1.6 AhR通路激活模型的构建
4.1.7 AhR通路激活对CyHV-2在异育银鲫体内增殖的影响
4.2 实验结果
4.2.1 AhR1与AhR2基因在异育银鲫体内组织特异性分布
4.2.2 CyHV-2感染后AhR通路中关键基因与蛋白的动态变化
4.2.3 AhR通路激活对CyHV-2在异育银鲫体内增殖的影响
4.3 讨论
4.4 结论
第五章 结论
1、CyHV-2感染对异育银鲫肠道菌群和肠道物理屏障的影响
2、CyHV-2感染对异育银鲫肠道代谢物的影响和菌群-代谢物相关性分析
3、异育银鲫体内AhR表达与CyHV-2感染的相关性分析
参考文献
致谢