论文题目：FGF21介导的蛋氨酸限制对衰老小鼠认知功能损伤的改善作用机制研究
摘要：随着社会老龄化的不断加剧,衰老相关的神经退行性疾病已成为影响人类健康及社会发展的严重威胁。衰老过程中会伴随神经元损伤及突触可塑性下降继而引起的进行性痴呆,严重影响了患者的记忆、语言、认知及行为等功能。近年来,利用限制饮食中的特定营养素或总能量摄入改善机体衰老成为食品营养学领域研究的重点和热点。卡路里限制和间歇性进食的饮食限制模式在多种动物模型中都表现出了延长寿命,降低衰老相关疾病风险的作用,如脑血管疾病、2型糖尿病、癌症等,并具有潜在的干预老年性痴呆发生发展的作用。本课题所研究的蛋氨酸限制（Methionine restriction,MR）是近年来广泛报道的具有改善衰老动物代谢能力、延长寿命的限制饮食模式。本研究以蛋氨酸限制饮食为研究对象,通过体内外实验研究其对衰老相关认知功能障碍、突触可塑性损伤的改善作用,并进一步揭示营养应答信号FGF21及其调节神经系统氧化应激的潜在分子机制。（1）MR对衰老小鼠认知功能的干预作用:采用2月龄、12月龄、15月龄C57BL/6雄性小鼠,经适应性喂养后,分别进行不同饮食模式的饲喂:（1）正常蛋氨酸饮食（蛋氨酸含量0.86%）;（2）蛋氨酸限制饮食（蛋氨酸含量0.17%）;饲喂周期为3个月,结束后进行行为学测试,并收集动物组织样本。在旷场实验、Y迷宫、Morris水迷宫等动物行为学试验中,与年轻组小鼠相比,衰老小鼠的认知行为出现显著降低,MR提高了18月龄衰老小鼠的自主活动能力,并且显著改善了18月龄以及15月龄衰老小鼠的认知记忆能力的下降。小鼠海马区神经元HE染色的结果表明,MR能够改善衰老引起的神经元细胞核固缩、染色加深。利用透射电镜评价了MR对衰老小鼠突触结构的影响,结果表明,MR可显著增加突触后致密蛋白PSD的长度,即MR可以有效改善衰老诱导的小鼠突触结构损伤;利用q PCR检测了突触相关基因PSD95的表达,MR可显著增加衰老小鼠PSD95水平。因此,MR能够显著改善自然衰老引起的认知功能障碍及神经损伤。（2）MR对衰老小鼠海马区神经元功能的影响及对FGF21信号的激活作用:采用转录组学手段分析了小鼠海马基因的表达情况,通过DEG差异基因分析,发现了衰老小鼠海马区阿尔茨海默症等神经相关通路、氧化磷酸化等能量代谢相关通路发生显著改变;进一步采用GSEA基因富集,发现MR对髓鞘功能相关基因、FGFR激活相关基因的显著改变;通过ELISA法检测了小鼠血清、肝脏、脑部的FGF21水平,发现MR显著激活了衰老小鼠的循环FGF21水平;采用DIABLO法将转录组学与小鼠表征指标进行融合分析,发现小鼠行为学表现、FGF21水平、海马区神经相关基因呈高度相关性。因此,FGF21信号可能在MR改善衰老小鼠认知功能损伤中发挥核心作用。（3）MR改善衰老小鼠认知记忆功能中FGF21营养应答信号的参与机制:采用2月龄、15月龄C57BL/6雄性小鼠,使用腺相关病毒搭载sh FGF21,尾静脉两次注射法,沉默小鼠FGF21表达,并进行正常蛋氨酸饮食和MR。在旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫、巴恩斯迷宫等动物行为学实验中,MR具有改善衰老小鼠认知的功能,而在FGF21因子沉默时,其作用消失,相关神经退行性变化可以观察到类似结果。进一步采用r FGF21对SH-SY5Y神经细胞进行处理,发现r FGF21能够激活Nrf2信号通路,并增加其下游HO-1、NQO1等抗氧化酶的表达,发挥抗氧化及抗神经炎症的作用。因此,MR对于衰老小鼠的认知功能的改善作用,需要FGF21信号激活的参与。（4）MR对衰老小鼠认知功能改善作用的性别差异:在雄性及雌性15月龄C57BL/6小鼠中重复了MR对于衰老相关认知功能障碍的营养干预。结果显示,MR对于衰老小鼠体重及进食的影响,无显著性别差异。行为学实验结果显示,MR能够改善雄性衰老小鼠及雌性衰老小鼠的工作记忆能力、空间记忆能力。通过TEM观察海马区超微结构,发现MR对于衰老小鼠突触后致密物的改善作用,无性别差异性。MR对小鼠海马区线粒体数量的增加,无显著性别差异。因此,MR对于FGF21营养应答信号的激活无显著性别差异。综上所述,蛋氨酸限制饮食可以通过增加营养应答信号FGF21的表达进而激活Nrf2抗氧化信号通路改善氧化应激状态、保护突触可塑性改善衰老引起的认知功能障碍及神经细胞的损伤。本研究为膳食模式改善衰老引起的神经退行性疾病提供理论基础,同时为研究饮食限制模式改善认知功能障碍的机制提供新思路。
关键词：蛋氨酸限制;衰老;认知功能障碍;氧化应激;FGF21;突触可塑性
学科专业：食品科学
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 衰老及认知功能
1.1.1 衰老概述
1.1.2 衰老的分子理论
1.1.3 衰老与脑功能
1.1.4 衰老与炎症、氧化应激
1.1.5 研究认知功能的动物模型
1.2 衰老的营养学干预
1.2.1 饮食限制
1.2.2 蛋白质限制
1.2.3 氨基酸限制
1.3 蛋氨酸限制饮食
1.3.1 蛋氨酸限制概述
1.3.2 蛋氨酸限制的生物功能
1.3.3 蛋氨酸限制的营养应答机制
1.3.4 蛋氨酸限制与FGF21
1.4 FGF21 研究进展
1.4.1 FGF21 概述
1.4.2 FGF21 的生物学功能
1.5 研究意义与内容
1.6 技术路线
第二章 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠认知功能的改善作用
2.1 引言
2.2 技术路线
2.3 材料与方法
2.3.1 实验动物
2.3.2 材料与试剂
2.3.3 仪器与设备
2.3.4 试验方法
2.4 结果与分析
2.4.1 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠体重及进食量的影响
2.4.2 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠认知记忆功能的影响
2.4.3 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠血清氨基酸水平的影响
2.4.4 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠神经细胞形态的影响
2.4.5 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠突触功能的影响
2.4.6 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠海马区线粒体功能的影响
2.4.7 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠脑部炎症的影响
2.4.8 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠脑部氧化应激的影响
2.4.9 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠脑部抗氧化酶基因表达的影响
2.5 小结与讨论
第三章 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠FGF21 信号的激活作用
3.1 引言
3.2 技术路线
3.3 材料与方法
3.3.1 实验动物
3.3.2 材料与试剂
3.3.3 仪器与设备
3.3.4 试验方法
3.4 结果与分析
3.4.1 转录组数据的质量控制
3.4.2 MR对衰老小鼠海马区基因表达的影响
3.4.3 差异表达的KEGG通路富集分析
3.4.4 差异表达的GSEA富集分析
3.4.5 MR对衰老小鼠FGF21 受体表达的影响
3.4.6 MR对衰老小鼠FGF21 水平的影响
3.4.7 转录组学与表征的融合分析
3.5 小结与讨论
第四章 蛋氨酸限制饮食改善衰老小鼠认知功能中FGF21 营养应答信号的参与机制
4.1 前言
4.2 技术路线
4.3 材料与方法
4.3.1 实验动物与饲料
4.3.2 细胞株
4.3.3 材料与试剂
4.3.4 仪器与设备
4.3.5 试验方法
4.4 结果与分析
4.4.1 AAV-sh FGF21 腺相关病毒的介导的FGF21Knockdown模型构建
4.4.2 FGF21 沉默对蛋氨酸限制饮食改善认知功能的影响
4.4.3 FGF21 沉默对蛋氨酸限制饮食改善神经细胞形态的影响
4.4.4 FGF21 沉默对蛋氨酸限制调控衰老小鼠突触功能的影响
4.4.5 FGF21 沉默对蛋氨酸限制调控衰老小鼠线粒体生物合成的影响
4.4.6 rFGF21对NRF2 信号通路的激活作用
4.4.7 rFGF21 对氧化应激的改善作用
4.5 小结与讨论
第五章 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠认知功能改善作用的性别差异
5.1 引言
5.2 技术路线
5.3 材料与方法
5.3.1 实验动物
5.3.2 仪器与设备
5.3.3 试验方法
5.4 结果与分析
5.4.1 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠体重及进食量影响的性别差异
5.4.2 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠认知记忆功能影响的性别差异
5.4.3 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠血清FGF21 水平影响的性别差异
5.4.4 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠突触功能影响的性别差异
5.4.5 蛋氨酸限制饮食对衰老小鼠海马区线粒体功能影响的性别差异
5.5 小结与讨论
第六章 结论、创新点与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
缩略词
致谢