论文题目：Hsa-CircRNA-0001009靶向调控miRNA-22-3P/HMGB1通路对髓母细胞瘤生物学功能的机制研究
摘要：目的:探究环状RNA（Circular RNA,CircRNA）hsa-CircRNA-0001009靶向调控miRNA-22-3P/HMGB1通路对髓母细胞瘤生物学功能的影响。方法:通过基因芯片筛选出miRNA-22-3P上游靶基因hsa-CircRNA-0001009,双荧光素酶进一步验证miRNA-22-3P与hsa-CircRNA-0001009的分子海绵关系。查阅相关文献预测miRNA-22-3P的下游靶基因HMGB1,通过qRT-PCR验证髓母细胞瘤临床标本中hsa-CircRNA-0001009表达,WB及免疫组化检测HMGB1蛋白的表达及定位。使用慢病毒构建低表达hsa-CircRNA-0001009的髓母细胞系DAOY,验证抑制hsa-CircRNA-0001009的表达对miRNA-22-3P及HMGB1表达的影响,然后通过CCK-8实验、细胞克隆形成、细胞划痕愈合、Transwell小室侵袭迁移、流式细胞仪等检测方法,探究hsa-CircRNA-0001009对髓母细胞瘤DAOY细胞生物学功能的影响。使用miRNA-22-3P抑制剂,探究了miRNA-22-3P抑制对hsa-CircRNA-0001009及HMGB1蛋白的表达影响,再次验证对细胞的增殖、凋亡及表达的影响。最后用动物异种移植模型观察hsa-CircRNA-0001009表达对体内肿瘤的影响。结果:与正常脑组织相比,髓母细胞瘤组织中hsa-CircRNA-0001009和HMGB1的表达升高。hsa-CircRAN-0001009作为miR-22-3P的分子海绵调节了髓母细胞DAOY细胞系的增殖、迁移、侵袭和凋亡,进一步调节下游靶基因HMGB1的表达。小鼠异种移植模型也证实了hsa-CircRNA-0001009低表达抑制了肿瘤的增殖。同时,抑制miR-22-3P表达促进hsa-CircRNA-0001009的表达和HMGB1的表达,并促进了肿瘤的增殖、抑制了肿瘤的凋亡。结论:hsa-CircRNA-0001009和miRNA-22-3P/HMGB1构成了髓母细胞瘤调控通路,影响了髓母细胞DAOY细胞系的增殖、迁移、侵袭和凋亡,可能成为髓母细胞瘤的治疗靶点之一。
关键词：髓母细胞瘤;分子分型;CircRNA;hsa-CircRNA-0001009;HMGB1
学科专业：临床医学·外科学（专业学位）
中文摘要
Abstract
前言
1 髓母细胞瘤
1.1 流行病学
1.2 分子分型
1.3 治疗发展
1.4 分子分型特征下治疗现状
2 环状RNA
2.1 环状RNA的生物学功能
2.2 CircRNA与常见脑肿瘤
3 miR-22-3P与 HMGB1
材料与方法
1 组织、细胞、慢病毒
1.1 髓母细胞瘤和正常小脑组织
1.2 细胞
1.3 慢病毒
2 实验试剂、耗材、抗体及主要仪器
3 细胞功能实验方法
3.1 hsa-CircRNA-0001009双荧光载体构建
3.2 细胞培养与计数
3.3 慢病毒转染
3.4 RNA提取
3.5 qRT-PCR实验
3.6 miRNA-22-3P抑制剂实验
3.7 CCK-8细胞增殖实验
3.8 细胞克隆形成实验
3.9 Transwell小室检测细胞侵袭、迁移
3.10 细胞划痕实验
3.11 流式细胞仪检测细胞凋亡
4 小鼠异种移植实验
4.1 小鼠来源
4.2 小鼠培养条件
4.3 小鼠肿瘤模型建立
5 Western Blot实验
5.1 细胞蛋白提取
5.2 蛋白浓度测定(BCA法)
5.3 电泳
6 免疫组化及免疫荧光
6.1 免疫组化
6.2 免疫荧光
7 统计分析
实验结果
第一部分 Hsa-CircRNA-0001009分子海绵miR-22-3P/HMGB1通路的筛选及组织验证
1 Hsa-CircRNA-0001009的筛选与验证
2 HMGB1的筛选与验证
第二部分 Hsa-CircRNA-0001009低表达对miR-22-3P/HMGB1及细胞功能的影响
1 构建hsa-CircRNA-0001009低表达的髓母细胞瘤模型
2 Hsa-CircRNA-0001009低表达对miR-22-3P/HMGB1的影响
3 Hsa-CircRNA-0001009对DAOY细胞生物学功能的影响
4 抑制hsa-CircRNA-0001009对体内肿瘤生长的影响
第三部分 抑制miR-22-3P对 hsa-CircRNA-0001009表达及细胞功能的影响
1 抑制miR-22-3P对 hsa-CircRNA-0001009和HMGB1表达的影响
2 抑制miR-22-3P对细胞增殖和凋亡的影响
讨论
实验结论
参考文献
综述 自噬在儿童脑肿瘤中的研究进展
参考文献
致谢