临床上糖尿病常引起多种消化道症状, 病人常表现为腹泻、便秘、上腹胀痛等症状[1], 其发病机制尚不太清楚。现在大多数学者认为糖尿病胃肠功能紊乱的发病机制主要与胃肠的自主神经病变有关, 也有临床和实验室研究发现在无自主神经病变时亦可出现胃肠功能紊乱[2]。但有关小肠黏膜上胰岛素受体和杯状细胞研究较少, 鉴于此, 利用免疫组化和PAS染色方法观察糖尿病小鼠小肠黏膜上胰岛素受体是否改变, 为进一步研究糖尿病的消化系统并发症提供证据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物来源引进日本C5 7bl/ksj-d b/+m转基因小鼠。
1.1.2 动物分组病例组:
选取3、5、6、8、10月龄db/d b自发性糖尿小鼠, 每组6只。对照组:选取相应年龄段db/+m表型正常小鼠, 每组6只。
1.2 免疫组化步骤
(1) 脱蜡至水; (2) 蒸馏水洗5min×3次; (3) 3%甲醇-H2O2室温孵育10分钟, 以消除内源性过氧化物酶; (4) 蒸馏水洗5min×3次; (5) 枸橼酸钠缓冲液微波炉内抗原修复约30min; (6) 滴加10%正常山羊血清封闭, 湿盒内孵育约10min; (7) 滴加兔抗胰岛素受体, 湿盒内过夜; (8) 0.01M PBS缓冲液洗5min×3次; (9) 滴加生物素标记的二抗 (羊抗兔) , 放入湿盒内孵育2h; (10) 缓冲液洗5min×3次; (12) 滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液, 湿盒内孵育2h; (13) 缓冲液洗5min×3次; (14) 14DAB显色, 木精复染细胞核。
阴性对照用0.01M PBS代替一抗, 其余步骤同上。
结果判定:细胞内有棕黄色分布的为阳性反应。
2 结果
胰岛素受体 (IR) 在小肠黏膜主要表达在上皮细胞的细胞膜和细胞质, 在黏膜下层和肌层的细胞也有IR的表达。糖尿病组 (DM) 比同月份正常对照组 (N) IR的表达量明显减少 (P<0.05, P<0.01) , 糖尿病组中5月龄IR的表达量最高, 10月龄表达的最少, 并且5月龄与10月龄均存在着显著差异 (P<0.05) , 正常对照组随月龄增长无显著性差异 (P>0.05)
3 讨论
胰岛素受体广泛分布于全身各组织细胞内, 胰岛素受体是一种糖蛋白, 是胰岛素信号传导通路上的连接蛋白, 主要连接胰岛素受体 (IR) 和多种效应分子。
胰岛素受体由2个α亚基及2个β亚基即α2β2构成, α亚基及β亚基通过-s-s键相连, α亚基在细胞膜外表面, 分子量130kD, 由723个氨基酸构成, 具有与胰岛素或IGF特异结合部位, β亚基跨膜存在于胞质内, 分子量95kD, 由620个氨基酸残基构成。
胰岛素是胰岛β细胞分泌的蛋白质激素, 体内发挥重要的生理作用, 必须经过以下几步: (1) 胰岛素与胰岛素受体α亚基结合; (2) 胰岛素受体β亚基中近膜结构域与胰岛素受体底物结合, 随之发生一系列生化反应, 使其信号得以转导和放大; (3) 产生一系列生物学效应。在上述过程中任何一个或数个环节的异常均可导致胰岛素抵抗。大量资料表明2型糖尿病与胰岛素抵抗有十分密切的关系[3], 学者们从各个环节研究了2型糖尿病时胰岛素抵抗发生的机制, 对胰岛素受体这个环节也不例外, 研究较多是非肠道组织如肝、脂肪组织、红细胞等细胞上的胰岛素受体的变化, 但对肠道组织小肠黏膜的胰岛素受体研究相对来说较少, 故本研究应用免疫组化来探讨糖尿病小鼠小肠黏膜上胰岛素受体的蛋白表达, 结果表明糖尿病时小肠黏膜上胰岛素受体的蛋白表达量比同月份正常对照组降低, 这与糖尿病时非肠道组织的胰岛素受体变化一致, 并且Ziegler, TR等研究发现大鼠小肠胰岛素受体与典型的胰岛素靶组织的受体完全相同, 并且胰岛素受体在结构上具有同源性, 所以小肠黏膜的胰岛素受体水平可反映胰岛素受体的总体水平。糖尿病时糖尿病小鼠小肠黏膜的胰岛素受体蛋白表达量减少, 那么正常剂量的胰岛素与其结合的数量要少, 故它的生物学效应要降低, 从而说明此种糖尿病小鼠存在着胰岛素抵抗。
摘要：目的 利用免疫组化方法观察糖尿病小鼠小肠黏膜上胰岛素受体是否改变, 为进一步研究糖尿病的消化系统并发症提供证据。方法 分别选取3、5、6、8、10月龄db/db糖尿病小鼠及相应年龄段的db/+m正常小鼠, 每组6只。标本用4%多聚甲醛灌流固定后, 灌流固定后, 从距Treitz韧带约10cm处切下一段空肠, 用于免疫组化。结果 胰岛素受体 (insulin receptor, IR) 在糖尿病组 (DM) 比同月份正常对照组 (N) IR的表达量明显减少。结论 糖尿病小鼠存在着胰岛素抵抗。
关键词：小肠黏膜,胰岛素受体,免疫组化
参考文献
[1] 李卉, 刘芳, 王常林, 等.糖尿病腹泻的发病机制及中西医治疗[J].长春中医药大学学报, 2009, 25 (1) :50～51.
[2] Talley NJ, Young L, Bytzer P, et al.Impact of chronic gastrointes-tinal symptoms in diabetes mellitus on health-related quality of life[J].Am J Gastroenterol, 2005, 96 (1) :71～76.
[3] Kahn CR, Weir Gc.Joslin’s Diabetes Mellitus, Molecular Aspect of Insulin Action.13Edition.published by lea&Febiger Company:pressed in philished, 1995, 8:139.