民以食为天,食以安为先,食品安全重于泰山。食品安全不仅关系到消费者人身安全,也关系到食品行业的良性发展。近几年爆出的食品安全事件时刻刺激着人们的神经,社会各界也越来越关注食品安全的重要性。食品中非食用违禁物质的添加,在某些行业有成为潜规则的趋势。非食用物质定义明确:严禁在食品中添加食用。我国卫生部门先后分六批公布了《食品中可能违法添加的非食用物质名单》《名单》中所列物质涉及范围广,在食品中添加用途也不同,有的起防腐作用,有的能抗菌,有的能增色。罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O均在《名单》中,这些物质有可能作为染色剂被添加到调味品中。有些生产业者为了经济利益,产品中过量添加上述染色剂,则会对食用者产生危害,因此,方便快捷检测上述添加剂非常有意义。
目前,检测工业色素常用的前处理方法有固相萃取 法[1,2,3]、分子印迹技术[4]、基质分散固相萃取[5]等,测试方法主要为液相色谱法[6,7]、液相色谱-质谱联用方法[8,9]等。近些年兴起的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)能够有效避免假阳性结果,并具有较高的灵敏度、准确度、重现性,满足了检验机构实际需求,在工业色素分析应用中快速发展[10,11,12]。本次研究立足实际工作,选取较为典型的调味料产品—火锅底料作为实验样本,采用成熟的固相萃取技术,探索一套切实可行、易于推广的前处理方法与仪器检测方法,为食品中工业色素的检验检测工作提供技术参考。
1.实验部分
(1)实验所需仪器
电子天平(ML204,梅特勒公司),氮吹仪(HN200,海能仪器有限公司),固相萃取装置(SPE-12,美国SUPELCO公司),高速冷冻离心机(Velocity 18R,Dynamica公司),超声波清洗仪(SK2200H,上海科导超声仪器有限公司),超纯水仪(Integral 5,密理博公司),超高效液相色谱-串联质谱仪(ACQUITY Quattro Premier XE,Waters公司)。
(2)实验所需试剂
罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O标准品(Dr.Ehrenstorfer公司),无水硫酸钠(分析纯,天津市北方天医化学试剂厂),乙酸铵(色谱纯,Fisher公司),正己烷、甲酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司),甲醇、乙腈(色谱纯,德国默克公司),Waters Oasis HLB(改性的苯乙烯二乙烯基苯共聚物)固相萃取柱(60mg/3mL)。
(3)标准溶液及流动相的配制
①标准储备液及标准使用液的配制
分别称取罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O标准物质(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中,分别以甲醇定容至刻度,配制1mg/mL的单标储备液。配制好后,放入4℃冰箱中避光保存。
准确移取罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O单标储备液,甲醇稀释配成混合标准使用液,经0.2μm微孔滤膜过滤后待测。
②流动相的配制
A.0.1%甲酸水:取1mL甲酸于1000mL容量瓶中,加水定容至刻度。B.0.1%甲酸/5mM乙酸铵水溶液:称取0.38g乙酸铵于200mL烧杯中,加适量超纯水溶解,加入1mL甲酸,转移至1000mL容量瓶,加水定容至刻度。
(4)样品前处理
称取5.000g(精确至1mg)火锅底料于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入5g无水硫酸钠混匀,再加入15mL含0.1%甲酸的乙腈溶液,漩涡振荡器混合1min,超声提取15min,静置1min,取上层清液于另一离心管中,再加入10mL 0.1%的甲酸乙腈溶液,漩涡振荡混合1min后,超声提取15min,静置1min,取上层清液,合并两次提取液,加入5mL饱和了正己烷的乙腈溶液,漩涡振荡混合1min,10000r/min离心5min,取下层溶液用40℃氮气吹干,加入0.1%甲酸/5mmoL·L-1乙酸铵溶液1mL,混匀备用。
用3mL甲醇和超纯水依次通过Oasis HLB固相萃取柱,将其纯化后移取提取液加入固相萃取柱(流速不超过1mL/min),加入35%甲醇水溶液6mL淋洗小柱,抽干,分别用3mL甲醇和3mL 10%氨水-甲醇混合液两步洗脱,抽干5min,收集洗脱液保温(37-40℃)氮气吹干,用流动相1mL溶解,过滤备用。
(5)测定条件
①色谱条件
色谱柱:ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm);进样量:10μL;柱温:40℃;
流动相:0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液,B:乙腈;流速0.20mL/min;
梯度条件:0～2min:A75%～45%;2～4min:A45%;4～ 6min:A45%～75%。
②质谱条件
调整质谱参数,得到最优质谱条件。
2.结果与讨论
(1)样品前处理条件的优化
①提取溶剂的选择。
由于本次研究的待测物为调味料物质,含有较多的香体物质和油脂,如果不将它们去除,基质效应会影响目标物的响应强度,因此在本次研究中选取用乙腈饱和过的正己烷作为除脂溶剂。
本实验分别选择甲醇、乙腈、含0.1%甲酸的乙腈作为提取剂进行研究,发现目标物的提取效率为:添加了甲酸的乙腈溶液>乙腈>甲醇。含0.1%甲酸的乙腈为提取液时,回收率最高,因此选用0.1%甲酸乙腈溶液作为本次研究的提取液。同时,在提取前加入无水硫酸钠来提高萃取效果,防止乳化层形成。
②固相萃取柱的选择。
固相萃取柱的用途是对目标物进行吸附和解吸附。通过固相萃取柱处理,预期达到的效果有:A.最大程度清除试样中干扰目标物的杂质,起净化作用;B.对微量目标物进行富集,提高检出水平。固相萃取柱的使用一般遵循以下步骤:柱活化,上样(加入待测液),淋洗(洗出干扰物),洗脱(目标物解吸)。
选用Oasis HLB是亲水-亲脂平衡的吸附剂,是改性的苯乙烯二乙烯基苯共聚物,对于极性、非极性的化合物均有很好的保留。
(2)检测方法的选择与条件优化
①流动相的选择
液相色谱-质谱法分析中,通常选择粘度低、通用性好的溶液作为流动相。实验中选取了常用的甲醇-水,乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水/5mmol/L乙酸铵溶液分别做流动相进行测试。结果表明,甲醇水体系对四种色素无法实现基线分离,且峰展宽严重,响应较差。乙腈-水体系能够基本实现分离,峰形仍较差。乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)两种流动相体系能实现四种工业色素的分离,但是采用乙腈-0.1%甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)体系比采用乙腈-水体系时,四种物质的响应更高,而且色谱图峰形更好。
A:碱性橙2;B:酸性橙2;C:碱性嫩黄O;D:罗丹明B
混标溶液测定时,首先采用等度洗脱模式,通过调整流动相比例,四种色素均不能实现完全基线分离。采用经过优化的梯度洗脱模式,四种色素能达到较好的分离度,测试时间有效降低,色谱图见图1。
②母离子与子离子的确定
本文采用三重四级杆串联质谱仪,通过优化质谱条件,调整参数,得到罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O的母离子分别为m/z443.22、m/z213.17、m/z326.87、 m/z268.08,与文献报道及相关标准记载一致[13,14,15]。
*定量离子
(3)线性范围
配制四种色素的混合标准使用液,按照已确定的测试条件,以标准溶液浓度为横坐标(x μg/L),峰面积为纵坐标(y),拟合一次线性方程,分别得到四种目标物的一次线性回归方程,见表2。
从表中可得出,这四种色素在适宜浓度范围内线性良好。
(4)方法的检出限和定量限
采用基质加标的方法添加四种工业色素,按本文确定的前处理方法和仪器条件进行检测。以3倍基线噪声(S/N=3)和10倍基线噪声(S/N=10)分别计算方法检出限和定量限。同时采用空白基质加标的方法配制检出限、定量限等同浓度溶液,并经仪器检测验证。
(5)方法精密度与回收率
采用空白基质加标方式,以本文确定的仪器条件,进行日内、日间精密度测试。实验结果表明四种色素的日内相对标准偏差在1.6%-6.7%之间,日间相对标准偏差在2.5%-7.5%之间。梯度浓度空白基质加标回收率在83.7%-102.4%范围内。
(6)实际样品的测定
购自自由市场和超市的12份火锅底料产品,按照本文前述建立的样品前处理方法与超高效液相色谱-串联质谱联用条件,对试样进行分析。检测结果中,有2份样品检出碱性橙2,含量分别为2.8μg/kg、2.3μg/kg,有一份样品检出酸性橙2,含量为4.7μg/kg,结果均小于其定量限,属带入水平。检出原因可能为使用的原料中混杂了染过色的花椒、辣椒等,从而转移到最终产品中,非人为加入。
3.结论
通过优化样品前处理过程和检测条件,确立了同时检测火锅底料中罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2、碱性嫩黄O的UPLC-MS/MS分析方法。四种待测物质在适宜浓度范围内线性良好,相关系数R2在0.9988-0.9994之间,检出限分别为0.20μg/kg、1.0μg/kg、1.8μg/kg、3.1μg/kg,满足日常检验要求。
摘要：采用固相萃取法同时提取、净化、富集火锅底料中罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2和碱性嫩黄O,并建立了用超高效液相色谱-串联质谱法对四种工业色素定性定量检测的分析方法。前处理部分采用含0.1%甲酸的乙腈为提取溶剂,用饱和了正己烷的乙腈溶液去除脂肪,超声波萃取;采用固相萃取柱净化,两步洗脱;色谱部分采用C18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm),乙腈-0.1%甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)为流动相进行梯度洗脱。在最优条件下:罗丹明B、碱性橙2、酸性橙2和碱性嫩黄O在相应线性浓度范围内,线性良好,相关系数R2均大于0.998,四种物质的检出限分别为0.20μg/kg、1.0μg/kg、1.8μg/kg、3.1μg/kg,日内、日间相对标准偏差(n=5)均小于8.0%,平均回收率为83.7%-102.4%。
关键词：工业色素,火锅底料,固相萃取,超高效液相色谱-串联质谱
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